食醋是我国重要的调味品，有两千多年的悠久历史。酿造的地理环境、原料与工艺的差异，生产出具有不同风味的食醋。酿造食醋的原料有大米、小麦、高粱、小米、麸皮、含糖分的果类等[1]。在微生物氨基酸脱羧酶作用下将氨基酸脱羧生成生物胺，通过氨基化和转胺作用也能使醛和酮转化为生物胺[2]。适量生物胺可促进人体的正常生理活动，但生物胺的浓度超过一定的限度会对人体产生严重的危害[3-4]，损伤人体的神经系统和心血管系统。因此，建立快速简便地检测食醋中生物胺含量的方法，对保证食醋食用安全具有重要意义。
由于生物胺分子中缺少发色基团，无紫外吸收、也无荧光及电化学活性，因此，分离及测定各类生物胺的含量存在一定的困难。目前，检测生物胺的方法主要为衍生化-高效液相色谱（high performance liquid chromatography，HPLC）[5-7]法。也有用生物传感器法[8]、毛细管电泳法[9]、薄层色谱法[10]等测定食品中生物胺。唐晗等[11]利用化学发光传感器检测食品中生物胺含量。刘方震[12]利用毛细管电泳技术检测尿样、酱油等样品中的生物胺，分离速度快、效能高并且消耗样品量极少，但选择性差。李燕君[13]改良了传统的薄层色谱检测方法并成功定性、定量检测黄酒中生物胺的含量。黄祖新[14]采用高效液相色谱法检测了福建红曲醋中各生物胺含量。瞿凤梅等[15]采用丹磺酰氯衍生化结合HPLC的方法检测泡菜中的生物胺含量。HPLC方法是常用的检测方法，但需要进行柱前或柱后衍生，具有反应条件苛刻、衍生产物不稳定及前处理耗时较长等不足。本研究采用液相色谱-串联质谱（liquid chromatography tandem mass spectrometry，LC-MS/MS）法测定食醋中多种生物胺的含量，为食醋企业提供可靠数据，以期控制食醋生产过程中生物胺的产生，保证食醋的安全。
1 材料与方法
1.1 材料与试剂
食醋样品均购买于许昌市时代广场，样品1，老陈醋（山西）；样品2，黑米醋（广东）；样品3，老陈醋（山西）；样品4，老陈醋（江苏）；样品5，香醋（上海）；样品6，老陈醋（山西）；样品7，香醋（江苏）；样品8，香醋（江苏）。
精胺、亚精胺、酪胺、组胺二盐酸盐、腐胺、尸胺、色胺：阿拉丁公司；甲酸、乙腈（均为色谱纯）：美国西格玛公司。
1.2 仪器与设备
Agilent 6460型串联三重四极杆质谱仪、Agilent 1290型液相色谱仪：美国安捷伦公司；Mili-Q型超纯水仪：密理博公司；ME104T/02电子天平：梅特勒-托利多集团。
1.3 方法
1.3.1 生物胺标准系列溶液的配制
7种生物胺标准储备溶液制备：分别称取色胺3.4 mg、酪胺2.6mg、组胺二盐酸盐3.4mg、精胺5.1mg、亚精胺4.6mg、腐胺1.8 mg、尸胺1.7 mg于10 mL的容量瓶中，定容，配成340 mg/L（色胺）、260 mg/L（酪胺）、205 mg/L（组胺）、510 mg/L（精胺）、460 mg/L（亚精胺）、180 mg/L（腐胺）、170 mg/L（尸胺）标准储备溶液。使用超纯水将混合标准溶液按1∶2的稀释度稀释成系列浓度标准溶液。
1.3.2 样品的前处理
准确量取1mL各品牌的食醋样品，超纯水定容至10mL，0.45 μm滤膜过滤，直接进样分析。
1.3.3 色谱条件与质谱条件
色谱条件：Agilent XDB-C3（4.6 mm×250 mm，5 μm）色谱柱，柱温30℃，进样量5μL，流动相A为0.1%甲酸水溶液，流动相B为0.1%的甲酸乙腈溶液；0～5 min时，5%～20%的B溶液；流速为0.3mL/min。
质谱条件：电喷雾离子源（electrosprayionization，ESI），正离子扫描；干燥气为氮气（N2），干燥气温度为300℃，干燥气流量为8 L/min；雾化气压力为30 psi，鞘气温度为300℃，鞘气流量为11 L/min；毛细管电压为4000 V（正离子模式）；锥孔电压为500V（正离子模式）；检测方式为多反应监测模式（multiple reaction monitoring，MRM）。
取生物胺标准品，进行子离子优化。母离子为M+1，毛细管出口电压50～150 V，步长为5 V，碰撞能量5～50 V，步长为4 V，加速电压为4 V。
1.3.4 数据处理
定性分析：在相同的色谱和质谱条件下，对照7种生物胺标准品定性离子，以及出峰时间，对样品中各生物胺进行定性分析。
定量分析：通过不同生物胺定量离子的峰面积，根据7种生物胺标准曲线的回归方程，计算食醋样品中各生物胺的含量。
试验结果采用Minitable（17.0版）计算平均值与相关性分析[16]。
2 结果与分析
2.1 质谱条件的选择结果
生物胺是一类具有生物活性的小分子碱类化合物，极性较大，因此，实验中选用C3柱，以此实现7种生物胺的分离和检测。优化后的子离子见表1，加速电压为4V。其中，丰度最大为定量离子，丰度次大为定性离子。5min内7种生物胺全部岀峰（见图1）。生物胺色谱出峰顺序为亚精胺、腐胺、尸胺、组胺、精胺、酪胺、色胺，出峰时间分别为0.959min、0.996 min、1.004 min、1.012 min、1.098 min、1.892 min、4.064 min。
表1 多反应监测参数
Table 1 Parameters of multistage reaction monitoring
生物胺种类母离子（m/z）毛细管出口电压/V子离子（m/z）碰撞能量/eV 丰度组胺112.1190色胺161.2365酪胺138.1970精胺203.3191亚精胺146.2181腐胺89.2045尸胺103.2165 95.1 68.1 83.1 54.1 144.0 117.0 115.0 91.1 121.0 77.1 91.1 103.0 112.1 84.1 129.1 58.1 72.1 84.1 112.1 58.1 72.1 55.1 53.1 86.1 69.1 67.1 53.1 13 25 17 49 9 29 40 40 9 33 25 21 21 37 9 29 17 25 13 21 9 21 29 9 17 21 33 1 264 657 239 108 89 109 94 931 5 653 843 752 668 710 345 568 440 4 500 999 2 167 613 650 831 721 366 3 513 725 3 229 546 3 699 181 548 605 2 669 754 448 188 636 047 205 739 2 115 448 25 421 2 048 2 215 099 225 153 6 810 1 548
图17 种生物胺dMRM色谱图
Fig.1 Chromatogram of dMRM for 7 kinds of biogenic amines
2.2 标准曲线回归方程、检出限和定量限
按照各标准品峰面积（y）对相应的标准溶液质量浓度（x）作标准曲线，得到标准曲线的回归方程及相关系数。以信噪比（S/N）=3作为检出限，信噪比（S/N）=10作为定量限，7种生物胺的最低检出限见表2。各生物胺线性回归方程在0.50～20 mg/L范围内，线性相关系数R2均≥0.990，符合测定的要求。结果表明，该方法对生物胺灵敏度高，可以满足样品测定的要求。
表2 生物胺标准曲线的回归方程、相关系数、线性范围及检出限
Table 2 Regression equations of the standard curve,correlation coefficients,linearity range and limits of detection of biogenic amines
生物胺种类线性范围/（mg·L-1）线性方程相关系数R2检出限/（mg·L-1）定量限/（mg·L-1）精胺亚精胺腐胺尸胺组胺酪胺色胺0.204～5.1 0.036 8～4.6 0.07～0.877 2 0.006 9～0.866 0.027 2～3.4 0.020 8～13 0.027 2～17 y=412 731.272x-122 532.488 y=14 820.428x+23 059.422 y=611 208.031x+15 133.247 y=708 916.532x+8 969.926 y=969 030.583x+167 439.829 y=1 395 356.99x+364 984.258 y=898 918.595x+19 010.606 0.991 0.992 0.991 0.998 0.993 0.992 0.994 0.200 0 0.020 0 0.006 0 0.001 8 0.001 7 0.009 6 0.020 0 0.660 0 0.066 0 0.019 8 0.006 0 0.056 0 0.031 7 0.066 0
2.3 方法的回收率
方法的回收率试验结果见表3。从表3可看出，7种生物胺的相对标准偏差（relative standard deviation，RSD）在0.31%～3.29%，表明具有良好的重复性，7种生物胺的回收率也均在91.1%～102.17%。可见该方法回收率高，可用于检测食醋中生物胺的含量。
表3 生物胺的加标回收率结果
Table 3 Results of recovery rate of biogenic amines
生物胺种类本底值/（mg·L-1）加标量/（mg·L-1）测定平均值/（mg·L-1）RSD/%回收率/%精胺亚精胺组胺腐胺尸胺酪胺色胺3.51 5.22 4.71 6.71 10.98 21.56 0 4.50 7.19 6.25 8.23 10.92 32.50 42.50 7.86 12.48 10.47 14.74 21.10 54.93 41.37 1.40 3.29 1.05 0.75 0.81 0.31 2.59 96.67±2.40 100.97±5.66 92.11±1.71 97.61±1.34 92.64±1.54 102.67±0.52 97.33±2.52
2.4 8种食醋样品中生物胺的测定
不同品牌食醋中的生物胺含量见表4。
表4 食醋中的生物胺含量
Table 4 Contents of biogenic amines in vinegar samples mg/L
注：“-”表示未检出。
样品编号 精胺 亚精胺 腐胺 尸胺 组胺 酪胺 色胺1 2 3 4 5 6 7 8 5.49 3.01 3.51 5.67 8.78 5.45 9.44 6.53 4.47 3.37 5.22 50.39 50.87 4.66 69.10 56.50 20.16 5.72 37.1 35.14 61.02 22.8 11.70 37.86 7.18 1.38 10.98 13.31 15.40 7.42 5.24 13.25 0.80-4.71 2.23 9.08 0.48-0.42 16.02-21.56 8.09 84.83 17.47 0.96 11.67- - - - - - - -
生物胺的种类和含量因食醋的品种和制作方法的不同而有所差别，由表4可知，本研究的每一个样品中至少含有4种生物胺，所有样品中均未检出色胺，表明在酸性条件不利于色胺的形成。少部分食醋样品中未检出组胺和酪胺。
食醋中不同生物胺的含量见图2。由图2可知，8种样品中亚精胺的平均含量高于其他生物胺的平均含量，除色胺外，组胺的平均含量最低。精胺、亚精胺、腐胺和尸胺是食醋中主要的生物胺，所有样品中都能检出上述4种生物胺，组胺、酪胺和色胺的检出率分别为75%、87.5%和0%。已知7种生物胺毒性最强的是组胺[17]，而食醋中组胺的含量并不高，表明食醋的低pH抑制了组胺的形成。
图2 食醋中不同生物胺含量
Fig.2 Contents of different biogenic amines in vinegar samples
不同种类食醋样品中生物胺含量测定结果见图3。由图3可知，陈醋、米醋和香醋3类食醋样品中6种生物胺的含量有明显差别。香醋中6种生物胺含量均高于陈醋和米醋，陈醋次之，米醋各生物胺含量最低。3类食醋中总生物胺含量的变化也较大，其中陈醋中总生物胺含量为77.58 mg/L，米醋总生物胺含量为13.48 mg/L，香醋的总生物胺含量为150.87 mg/L，这可能是与3类食醋的生产工艺和微生物种类不同有关。
图3 不同种类食醋样品中生物胺含量
Fig.3 Contents of biogenic amines in different kinds of vinegar samples
2.5 样品中生物胺含量的相关性分析
为寻找生物胺相互之间的关系，采用Minitable软件对食醋中不同种类生物胺含量之间的相关性进行分析，结果见表5。由表5可知，组胺除了与酪胺显著相关外（P＜0.01），与其他5种生物胺之间均没有显著相关性（P＞0.01）；腐胺与尸胺之间具有显著相关性（P＜0.01），与其他5种生物胺也均没有显著相关性（P＞0.01）。其他生物胺之间没有显著的相关性（P＞0.01）。原因可能是不同酿造工艺中产生的游离氨基酸含量不同，各底物浓度之间没有相关性；产脱羧酶具有多种底物[18-19]，如一些乳杆菌（Lactobacilli）发酵可生成组胺、酪胺，这就造成了酪胺和组胺具有一定的相关性，而肠杆菌科（Enterobacteriaceae）微生物则有同时生成腐胺和尸胺的能力[20]。一些外界因素也会影响组胺的形成，此外，温度也会影响生成生物胺各个不同的组分，如合成组氨酸脱羧酶的最适温度为30℃，产生组胺的嗜温细菌生存所需要的温度须高于14℃，低温冷藏不利于组胺的形成。
表5 生物胺各组分之间的相关性
Table 5 Correlation between components of the biogenic amines mg/L
注：Pearson相关系数（上行为相关系数）及P值（下行为P值）；P值≤0.01，表示显著相关。
项目 精胺 亚精胺 腐胺 尸胺 组胺亚精胺-腐胺- -尸胺- - -组胺- - - -酪胺0.817 0.013 0.322 0.436 0.337 0.448 0.250 0.551 0.403 0.322 0.329 0.427 0.944 0.414 0.136 0.748 0.148 0.727 0.266 0.000 0.858 0.006 0.831 0.011 0.674 0.067 0.623 0.099 0.919 0.001
3 结论
采用液相色谱-串联质谱（LC-MS/MS）测定8种食醋品牌中7种生物胺含量，所有样品中均检出精胺、亚精胺、腐胺和尸胺，酪胺和组胺存在于大多数食醋中，部分样品中未检出，此外，食醋样品中均未检出色胺。结果表明，食醋中所含生物胺的种类及含量因食醋的品种而异，除色胺外，其他6种生物胺总量的范围为47.88～244.58mg/L，亚精胺，腐胺和酪胺的含量较高。组胺与酪胺，腐胺与尸胺含量具有显著的相关性。
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