薏米又名薏苡仁、苡仁、米仁、川谷，既是一种中药，又是一种天然美容食品。《中国食疗大典》记载：薏米含蛋白质14%，脂肪5%，碳水化合物65%，钙0.7%，磷0.242%，人体必需的8种氨基酸齐全且比例接近人体需要[1-3]。薏米有健脾补胃，清热祛湿，降血脂，抗氧化、抗病毒、抗细菌感染，减轻炎症活性的功效[4]。
近年来，随着人们保健意识的增强，再加上薏米的药食同源特性，相关产品的研究与开发也逐渐深入和广泛。在国外，特别是日本开发出新型薏米食品，其中80%是发酵饮料。我国目前以薏米为原料的加工产品主要有饮料和发酵制品，如薏米酒、薏米乳酸饮料、薏米发酵饮料和薏米醋等[5-6]。国内对薏米中的淀粉大多是采用淀粉酶进行水解得到酶解液，制备薏米饮料。旷慧等[7]以薏米的焙烤温度、焙烤时间、淀粉酶用量、酶解时间、酶解温度、酶解pH为实验因素建立了制备薏米汁的工艺，在此条件下得到的薏米汁中还原糖含量达到1.4818 g/100 g，呈乳白色，香味浓郁、味道纯正。周辉[8]研究表明，薏米淀粉糖化的最佳酶解工艺条件为温度55℃，pH值为6.6，酶添加量300 U/g，在此条件下可生产出品质优良、稳定性好的澄清型薏米汁。薏米中的蛋白质是优质蛋白[9]，韩丽丽[10]对薏米蛋白进行超声提取，通过中性蛋白酶和碱性蛋白酶联合酶解薏米得到薏米抗氧化肽，DPPH自由基清除率达到93.21%，证明薏米蛋白酶解后抗氧化活性更强，因而对薏米蛋白进行酶解具有重要的意义。木瓜蛋白酶对许多蛋白质都有水解作用，具备酶活性高、热稳定性好、无毒副作用、天然卫生安全等特点，并且资源丰富，取材简便[11-13]，因此，可利用木瓜蛋白酶对薏米蛋白进行水解。
本项目通过采用α-淀粉酶和木瓜蛋白酶先后对薏米中富含的淀粉及蛋白质进行水解，以还原糖含量和氮溶解指数（nitrogen solubility index，NSI）为检测指标，采用单因素及正交试验优化淀粉酶及蛋白酶酶解工艺条件，获得富含还原糖和可溶性氮的薏米汁。初步探讨两种酶的联合应用，为薏米饮品深加工技术提供参考。
1 材料与方法
1.1 材料与试剂
薏米（荆门市东宝区种植）：市售；α-淀粉酶（1000U/g）：北京索莱宝科技有限公司；木瓜蛋白酶（酶活10 000 U/g）：郑州升达食品添加剂有限公司；邻苯二甲酸氢钾（分析纯）：天津市福晨化学试剂厂。
1.2 仪器与设备
DK-98-11A电热恒温水浴锅：天津市泰斯特仪器有限公司；JY1002电子天平：上海上天精密有限公司；KDN-103F凯氏定氮仪：上海纤检仪器有限公司。
1.3 方法
1.3.1 薏米汁加工工艺流程及操作要点
薏米→筛选→清洗→烘干→粉碎→调浆→淀粉酶酶解→灭酶→木瓜蛋白酶酶解→灭酶→离心→成品
新鲜薏米，将其洗净后进行烘干，将薏米颗粒粉碎至80目，用纯水将薏米粉调成浆，分别用α-淀粉酶和木瓜蛋白酶进行两步酶解，灭酶后离心，过滤，所得滤液即薏米汁终产品。
操作要点[14-16]：
筛选：要求薏米仁粒饱满，色白，无虫蛀，无霉斑，脱壳完全，除去残留壳和砂砾等杂质。
清洗：将筛选过的薏米用清水洗净，进一步除去细小杂质，将水沥干。
烘干：将薏米在烘盘上摊薄，放入烘箱，在60℃条件下干燥备用。
粉碎：将薏米用粉碎机粉碎，再过80目筛，过筛后的薏米粉置于干燥的容器中，低温避光保藏。
调浆：将薏米粉按料水比为1∶10（g∶mL）调成浆，于90℃水浴加热至完全糊化，冷却得到薏米浆。
淀粉酶酶解：向冷却至室温的薏米浆中加入300 U/g的α-淀粉酶，在65℃条件下酶解3 h。
灭酶：将淀粉酶酶解薏米浆置于100℃水浴中，将淀粉酶灭活。
木瓜蛋白酶酶解：将前述得到的淀粉酶酶解薏米浆中加入100 U/g的木瓜蛋白酶，在50℃条件下酶解6 h。
灭酶：将木瓜蛋白酶酶解薏米浆置于100℃水浴中，将木瓜蛋白酶灭活。
离心：木瓜蛋白酶酶解后，4 000 r/min离心10 min，取上清液，得到薏米汁。
1.3.2 分析检测
还原糖含量的测定采用碱性铜盐法中的直接滴定法[17]；氮溶解指数（NSI）的测定[18-20]：取10 mL薏米汁，采用凯氏定氮法测定薏米汁中总氮含量，氮溶指数计算公式如下：
1.3.3 淀粉酶酶解工艺优化单因素试验
以薏米汁中还原糖含量为评价指标，分别考察酶解温度（40℃、50℃、60℃、70℃、80℃），酶解时间（1 h、2 h、3 h、4 h、5 h）及酶添加量（100 U/g、200 U/g、300 U/g、400 U/g、500 U/g），通过单因素试验来确定α-淀粉酶酶解薏米的最适酶解温度、酶解时间和酶添加量。
1.3.4 淀粉酶酶解工艺优化正交试验
采用正交试验设计，用酶解时间（A），酶解温度（B），酶添加量（C）这3个因素，以酶解后薏米汁中还原糖含量为评价标准，优化酶解工艺条件，正交试验因素与水平表见1。
表1 淀粉酶酶解条件优化正交试验因素与水平
Table 1 Factors and levels of orthogonal experiments for enzymatic hydrolysis conditions optimization by α-amylase
水平A酶解温度/℃B酶解时间/hC酶添加量/（U·g-1）1 2 3 60 65 70 2.5 3.0 3.5 200 250 300
1.3.5 蛋白酶酶解工艺优化单因素试验
向经过α-淀粉酶最佳条件酶解得到的薏米汁中加入木瓜蛋白酶，以氮溶解指数为评价指标，通过单因素试验分别考察木瓜蛋白酶的酶解温度（30℃、40℃、50℃、60℃、70℃），酶解时间（2 h、3 h、4 h、5 h、6 h）及酶添加量（40 U/g、80 U/g、120 U/g、160 U/g、200 U/g），进一步确认木瓜蛋白酶酶解薏米的最适酶解温度、酶解时间、酶添加量。
1.3.6 蛋白酶酶解工艺优化正交试验
采用正交试验设计，以酶解时间（A），酶解温度（B），酶添加量（C）为评价因素，以酶解后薏米汁中氮溶解指数为评价标准，优化蛋白酶酶解工艺条件，正交试验因素与水平表见2。
表2 蛋白酶酶解条件优化正交试验因素与水平
Table 2 Factors and levels of orthogonal experiments for enzymatic hydrolysis conditions optimization by protease
水平A酶解温度/℃B酶解时间/hC酶添加量/（U·g-1）1 2 3 45 50 55 5.0 5.5 6.0 60 80 100
2 结果与分析
2.1 淀粉酶酶解工艺优化单因素试验结果
2.1.1 酶解温度对薏米汁中还原糖含量的影响
α-淀粉酶添加量为250 U/g，酶解时间为2 h的条件下，设置酶解温度依次为40℃、50℃、60℃、70℃、80℃，考察酶解温度对薏米汁中还原糖含量的影响，结果见图1。
由图1可知，在α-淀粉酶添加量为250 U/g，酶解时间为2 h的条件下，酶解温度在40～80℃时，随着温度的不断升高，薏米汁中还原糖的含量也在慢慢升高，并在60℃时达到顶峰。随后，随着温度的升高，薏米汁中还原糖含量逐渐降低，这可能是当温度高于60℃时，α-淀粉酶部分失活。因此制备薏米汁的最佳淀粉酶酶解温度为60℃。
图1 不同酶解温度对α-淀粉酶酶解薏米汁中还原糖含量的影响
Fig.1 Effect of different enzymatic hydrolysis temperature on reducing sugar contents in coix seed juice hydrolyzed by α-amylase
2.1.2 酶解时间对薏米汁中还原糖含量的影响
在α-淀粉酶添加量为250 U/g，酶解温度为70℃的条件下，设置酶解时间依次为1 h、2 h、3 h、4 h、5 h，考察酶解时间对薏米汁中还原糖含量的影响，结果见图2。
图2 不同酶解时间对α-淀粉酶酶解薏米汁中还原糖含量的影响
Fig.2 Effect of different enzymatic hydrolysis time on reducing sugar contents in coix seed juice hydrolyzed by α-amylase
由图2可知，在α-淀粉酶添加量为250 U/g，酶解温度为70℃的条件下，酶解时间为1～3 h时，随着时间的延长，还原糖含量呈上升趋势，并在3 h时达到顶峰，酶解时间3～5 h时，还原糖含量呈下降趋势。因此，可以得知制备薏米汁的最佳酶解时间为3 h。
2.1.3 α-淀粉酶添加量对薏米汁中还原糖含量的影响
在温度70℃，酶解3 h的条件下，设置α-淀粉酶添加量依次为100 U/g 、200 U/g、300 U/g、400 U/g、500 U/g，考察酶添加量对薏米汁中还原糖含量的影响，结果见图3。
由图3可知，在酶解温度70℃，酶解时间3 h的条件下，当α-淀粉酶添加量为100～500 U/g时，随着α-淀粉酶添加量的增多，薏米汁的还原糖含量也在慢慢增多，并在α-淀粉酶添加量为300 U/g时达到顶峰，此时薏米汁中还原糖含量为18.9 mg/mL。随后，当α-淀粉酶添加量继续增大，薏米汁中还原糖含量并不增加。因此，可以得知制备薏米汁的最佳α-淀粉酶添加量为300 U/g。
图3 不同α-淀粉酶添加量对酶解薏米汁中还原糖含量的影响
Fig.3 Effect of different α-amylase addition on reducing sugar contents in coix seed juice
2.2 淀粉酶酶解工艺优化正交试验结果
根据单因素试验结果，以酶解时间，酶解温度，酶添加量为试验因素，还原糖的含量为评价指标，利用正交试验优化用淀粉酶酶解制备薏米汁的最佳酶解条件，正交试验结果与分析见表3，方差分析见表4。
表3 α-淀粉酶酶解条件优化正交试验结果与分析
Table 3 Results and analysis of orthogonal experiments for enzymatic hydrolysis process optimization by α-amylase
试验号 A B C 还原糖含量/（mg·mL-1）1 2 3 4 5 6 7 8 9 k1 k2 k3 R 1 1 1 2 2 2 3 3 3 1 2 3 1 2 3 1 2 3 1 2 3 2 3 1 3 1 2 17.32 19.35 20.48 20.00 22.22 21.98 19.35 20.69 20.81 19.05 21.40 20.28 2.35 18.89 20.75 21.09 2.20 20.00 20.05 20.68 0.68
由表3可知，3个因素对酶解的效果影响顺序是A＞B＞C，其中酶解温度（A）对试验效果影响最大，酶解时间（B）其次，酶添加量（C）对酶解的效果影响最小。综合考虑各因素k值和R值比较，得到最佳因素水平为A2B3C3，即酶解温度65℃，酶解时间3.5 h，淀粉酶添加量300 U/g。在此最佳条件下进行3次平行验证试验，结果薏米汁中还原糖含量平均值为23.26 mg/mL。由表4可知，酶解温度和酶解时间对结果有显著影响（P＜0.05），而酶添加量对结果没有显著影响（P＞0.05）。
表4 α-淀粉酶酶解工艺优化正交试验结果方差分析
Table 4 Variance analysis of orthogonal experiments results of enzymatic hydrolysis process optimization by α-amylase
方差来源 平方和 自由度 均方 F值 P值校正模型截距酶解时间酶解温度酶添加量误差总计校正的总计17.588 3 688.538 8.425 8.291 0.872 0.113 3 706.239 17.701 6 1 2 2 2 2 9 8 2.931 3 688.538 4.213 4.145 0.436 0.057 51.657 65 002.624 74.239 73.052 7.680 0.019 0.000 0.013 0.014 0.115
2.3 木瓜蛋白酶酶解工艺优化单因素试验结果
2.3.1 酶解温度对薏米汁中氮溶解指数的影响
将经过淀粉酶最佳酶解条件所得的薏米汁在木瓜蛋白酶添加量为120 U/g，酶解时间为3 h条件下，设置酶解温度依次为30℃、40℃、50℃、60℃、70℃，以酶解后薏米汁中氮溶解指数为评价指标，结果见图4。
图4 不同酶解温度对木瓜蛋白酶酶解薏米汁氮溶解指数的影响
Fig.4 Effect of different enzymatic hydrolysis temperature on nitrogen solubility index of coix seed juice hydrolyzed by papain
由图4可知，经过淀粉酶最佳酶解条件所得的薏米汁在木瓜蛋白酶添加量为120 U/g，酶解时间为3 h的条件下，随着温度的不断升高，薏米汁中氮的含量也在慢慢升高，并在50℃时达到顶峰。随后，随着温度的升高，薏米汁中氮溶解指数逐渐降低。因此，制备薏米汁的最佳酶解温度为50℃。
2.3.2 酶解时间对薏米汁中氮溶解指数的影响
将经过淀粉酶最佳酶解条件所得的薏米汁在木瓜蛋白酶添加量为120 U/g，酶解温度为50℃的条件下，设置酶解时间依次为2 h、3 h、4 h、5 h、6 h，以酶解后薏米汁中总氮溶解指数为指标，结果见图5。
图5 不同酶解时间对木瓜蛋白酶酶解薏米汁氮溶解指数的影响
Fig.5 Effect of different enzymatic hydrolysis time on nitrogen solubility index of coix seed juice hydrolyzed by papain
由图5可知，将经过淀粉酶最佳酶解条件所得的薏米汁在木瓜蛋白酶添加量为120 U/g，酶解温度为50℃条件下，随着时间的提高，氮溶解指数呈上升趋势，并在5 h时达到平衡，之后一直处于平衡状态，氮溶解指数不变。因此，可以得知木瓜蛋白酶最佳酶解时间为5 h。
2.3.3 酶添加量对薏米汁中氮溶解指数的影响
经过淀粉酶最佳酶解条件所得的薏米汁在木瓜蛋白酶酶解时间为3 h，酶解温度为50℃条件下，设置木瓜蛋白酶添加量依次为40 U/g、80 U/g、120 U/g、160 U/g、200 U/g，以酶解后薏米汁中氮溶解指数为评价指标，结果见图6。
图6 不同木瓜蛋白酶添加量对酶解薏米汁氮溶解指数的影响
Fig.6 Effect of different papain addition on nitrogen solubility index of coix seed juice
由图6可知，经过淀粉酶最佳条件酶解所得的薏米汁在木瓜蛋白酶酶解时间为3 h，酶解温度为50℃的条件下，随着木瓜蛋白酶添加量的增多，薏米汁的氮溶解指数也在增大，并在酶添加量为80 U/g时达到顶峰，此时薏米汁中氮溶解指数为82%。随后，当蛋白酶的添加量继续增大，薏米汁中氮溶解指数并不增加，因此，可以得知制备薏米汁的最佳木瓜蛋白酶添加量为80 U/g。
2.4 木瓜蛋白酶酶解工艺优化正交试验结果
根据单因素的试验结果，再以酶解时间，酶解温度，酶添加量为试验因素，以氮溶解指数为评价指标，利用正交试验优化用木瓜蛋白酶酶解制备薏米汁的最佳酶解条件，所得的正交试验结果见表5，方差分析见表6。
表5 木瓜蛋白酶酶解工艺优化正交试验结果与分析
Table 5 Results and analysis of orthogonal experiments for enzymatic hydrolysis process optimization by papain
试验号 A B C 氮溶解指数/%1 2 3 4 5 6 7 8 9 k1 k2 k3 R 1 1 1 2 2 2 3 3 3 1 2 3 1 2 3 1 2 3 1 2 3 2 3 1 3 1 2 72.28 72.45 78.21 74.35 76.22 77.43 73.20 71.87 75.26 74.31 76.00 73.44 2.56 73.27 73.51 76.97 3.70 73.86 74.02 75.88 2.02
表6 木瓜蛋白酶酶解工艺优化正交试验结果方差分析
Table 6 Variance analysis of orthogonal experiments results for enzymatic hydrolysis process optimization by papain
方差来源 III型平方和 自由度 均方 F值 P值校正模型截距酶解温度酶解时间酶量误差总计校正的总计43.276 50 067.046 10.138 25.598 7.540 0.304 50 110.625 43.579 6 1 2 2 2 2 9 8 7.213 50 067.046 5.069 12.799 3.770 0.152 47.490 329 653.532 33.376 84.270 24.822 0.021 0.000 0.029 0.012 0.039
由表5可知，3个因素对酶解的效果影响顺序为B＞A＞C，即酶解时间＞酶解温度＞酶添加量。综合考虑各因素k值和R值比较，得到最佳酶解工艺组合为A2B3C3，即酶解温度50℃，酶解时间6 h，蛋白酶添加量100 U/g。在此最佳条件下进行3次平行验证试验，结果薏米汁中氮溶解指数平均值为79.58%。由表6可知，3个因素均对结果有显著影响（P＜0.05）。
3 结论
通过单因素试验和正交试验，采用淀粉酶和木瓜蛋白酶结合的两步酶解法制备薏米汁的最佳工艺条件为：α-淀粉酶酶解时间3.5 h，酶解温度65℃，α-淀粉酶添加量300 U/g；木瓜蛋白酶酶解时间为6 h，酶解温度为50℃，木瓜蛋白酶添加量为100 U/g。在此最佳酶解工艺条件下，薏米汁中还原糖含量达23.26 mg/mL，氮溶解指数达到79.58%。
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