米酒是以糯米为主要原料，经过蒸煮、接种拌曲、微生物糖化发酵酿造而成的中国传统发酵米制品[1]，其也是作为馒头制作所添加的传统发酵剂之一。米酒营养价值很高，除含有20种氨基酸外，还含有丰富的生物短肽和适量的有机酸、酒精、维生素[2-3]。甜酒曲是制作米酒不可缺少的发酵剂，其质量的高低直接影响米酒的滋味和品质[4]，进一步影响馒头的品质。甜酒曲中主要的菌种为根霉菌，主要起糖化作用[5]。用酵母作为发酵剂蒸制出的馒头能最大限度地保留面粉中的营养成分，而且生产周期短，但是人们普遍反映纯酵母馒头风味不足[6-7]。
米酒因其含有丰富的菌种，用其作为发酵剂蒸制馒头，使得馒头口感更加香甜。吴进菊等[4]考察了7种甜酒曲对甜酒酿品质和滋味的影响，发现各种甜酒酿在感官特性、糖度、酸度、色度、滋味等各方面均有明显差异。蔡敏等[8]采用孝感酒曲、安琪酒曲和宜昌土家酒曲及对应4种酒曲用量0.5%、0.7%、0.9%和1.1%制作米酒，研究发现，3种米酒曲不同用量发酵的米酒成品风味特征表现明显。孙祥祥等[9]研究米酒制作酵子的工艺对酵子馒头品质的影响，得到最佳工艺为米酒量6.97%、小曲量1.52%、大曲量0.70%。石飞[10]研究发现，米酒馒头与普通酵母馒头相比，硬度和咀嚼性较小，挥发性物质种类和含量明显增加。李志建等[6]研究了米酒酿与酵母以不同比例混合发酵对馒头品质的影响，发现米酒酿与酵母以1∶2混合时，馒头品质最好。
本实验以东北糯米为原料，分别选用西王甜酒酒曲、苏州蜂蜜甜酒曲、双龙甜酒曲、尚川甜酒曲、安琪甜酒曲制作米酒，并将米酒作为发酵剂制作馒头。对制作的5种米酒的还原糖、总糖、pH值、总酸（totalacid，TA）、蛋白酶活性、淀粉酶活性、酵母菌和乳酸菌总数进行测定，以及馒头的比容、硬度、白度和感官评分各项试验指标进行综合性分析，为进一步研究米酒馒头奠定理论基础。
1 材料与方法
1.1 材料与试剂
糯米：吉林市永鹏农副产品开发有限公司；西王甜酒曲：西安市国亨食品批发市场；苏州蜂蜜甜酒曲：苏州粮油食品有限公司；双龙甜酒曲：湖北省随州市炎帝大道南郊区毛家棚；尚川甜酒曲：广东顺德尚川生物科技有限公司；安琪甜酒曲、高活性干酵母：安琪酵母股份有限公司；特一粉：郑州金苑面业有限公司；氢氧化钠：洛阳昊华化学试剂有限公司。
3,5-二硝基水杨酸、福林酚试剂（均为分析纯）：国药集团化学试剂有限公司；可溶性淀粉（生化试剂）：天津市天力化学试剂有限公司；结晶酚、亚硫酸钠（均为分析纯）：天津市科密欧化学试剂有限公司。
MRS固体培养基：蛋白胨10 g，牛肉膏10 g，酵母膏5 g，葡萄糖20 g，柠檬酸三铵2 g，乙酸钙5 g，吐温80 1 mL，磷酸氢二钾2 g，硫酸镁0.58 g，硫酸锰0.25 g，碳酸钙5 g，琼脂粉19 g，纳他霉素30 mg，蒸馏水1 000 mL。孟加拉红培养基：北京奥博星生物技术有限责任公司。
1.2 仪器与设备
SZH-20双速双动和面机：广州旭众食品机械有限公司；BS600L电子天平：上海友声衡器厂；WFX-12-15-24-0豪华型雾化面食发酵箱：中山市丰盛电器厂；JBDZ-20白度仪：上海嘉定粮油仪器有限公司；硬度仪：自制（小麦和玉米深加工国家工程实验室）；DHP030恒温培养箱：上海实验仪器总厂；S-25 pH计：上海精密科学仪器有限公司；HJ-3数显恒温磁力搅拌器：金坛市华锋仪器有限公司；722S可见分光光度计：尤尼柯（上海）仪器有限公司。
1.3 试验方法
1.3.1 米酒制作工艺及操作要点
糯米、水→浸泡→蒸制→甜酒曲→发酵→成品
糯米与水按照料水比1∶1（g∶mL）浸泡12 h，进行蒸制45 min，然后冷却至室温，将甜酒曲1.5%溶解在水中，与蒸熟糯米搅拌混匀后放入恒温箱（30℃、72 h），即得米酒（各配料比例均以第一次添加糯米总质量为基准）。
1.3.2 米酒老面馒头制作
面粉、米酒、水→和面→发酵→老面、水、酵母→和面→压面→成型→醒发→蒸制→米酒老面馒头
将面粉300 g、米酒24 g（8%）、水120 mL（40%）加入和面机，搅拌10 min，发酵10 h（25℃），做成米酒老面。
将面粉500 g、米酒老面300 g（60%）、酵母1 g（0.2%）、水200 mL（40%）加入和面机，搅拌12 min做成面团；自动压面20次；手工成型；醒发40 min（温度35℃、湿度85%）；电蒸锅蒸25 min。
1.3.3 待测液的制备
称取1.3.1制作的米酒样品10 g，加入90 mL蒸馏水，在磁力搅拌器上搅拌30 min，离心取上清液，所得为原液，然后取10 mL原液，加入至50 mL容量瓶中，用蒸馏水定容，摇匀后即得待测液。
1.3.4 米酒理化指标的测定
还原糖的测定：采用3,5-二硝基水杨酸分光光度法[11]测定米酒中还原糖含量；米酒总糖的测定：采用蒽酮比色法[11]测定米酒中总糖含量；米酒pH值和总酸度（TA）的测定：取1.3.1制作的米酒样品10 g，加入90 mL无CO2蒸馏水，在磁力搅拌器上搅拌30 min。取上清液50 mL，使用S-25 pH计测定pH值，记录读数。滴加0.1 mol/L NaOH，记录所消耗的NaOH体积V1，总酸度TA=2×V1。
1.3.5 米酒淀粉酶及蛋白酶活性的测定
采用3,5-二硝基水杨酸分光光度法[11]测定淀粉酶活性；按照GB/T 23527—2009《蛋白酶制剂》[12]测定蛋白酶活性。
1.3.6 米酒中酵母菌和乳酸菌总数的测定
取10 g米酒，加入90 mL无菌生理盐水，混合，制备成10-1菌悬液，并梯度稀释到10-7，选取10-2～10-6稀释梯度进行酵母菌和乳酸菌计数。分别将200 μL不同稀释梯度的悬浮液于倒有孟加拉红培养基的培养皿和MRS固体培养基的培养皿，均匀涂布。孟加拉红培养基的培养皿倒置在30℃培养箱中48 h，MRS固体培养基的培养皿倒置在36℃培养箱中培养48 h。
1.3.7 馒头质构的测定
白度的测定：采用白度仪测定[13]；硬度的测定：采用自制硬度仪测定[14]；比容的测定：采用小米容积置换法测定[15]；感官评价：选5名经过培训的评价员根据馒头感官评分表1的标准进行感官评定（满分100分）。
表1 馒头感官评价标准
Table 1 Sensory evaluation standards of steamed bread
项目 总分100 感官评分/分10 乳白（8～10）；洁白或稍黄（6～7）；灰暗（0～5）外观（20分）10结构（8分）挺立、饱满、表面光滑（8～10）；轻微塌陷、表面微皱、有轻微收缩现象（6～7）；萎缩、与品种造型不一致（0～5）8 12纵剖面气孔小而均匀（6～8）；中等（4～5）；气孔大而不均匀（0～3）有令人愉悦的香味（8～12）；适中（4～7）；有不可接受的气味（0～3）
续表
项目 总分100 感官评分/分风味（36分）12 12 12口感（36分）12 12口味淡香，有发酵香味，米酒香味（8～12）；稍带甜味（4～7）；略带咸味（0～3）酸碱适中（8～12）；稍带碱味（4～7）；稍带酸味（0～3）咀嚼适口，较柔软，易下咽（8～12）；软硬适中（4～7）；咀嚼干硬，下咽困难（0～3）回弹快，能复原，压1/2以上（8～12）；回弹稍差，压1/4以上（4～7）；回弹弱或不回弹（0～3）品尝时爽口不粘牙、不牙碜（8～12）；品尝时稍粘或稍碜（4～7）；品尝时粘牙或牙碜（0～3）
1.3.8 数据处理
所有的实验进行3次。使用SPSS 21.0软件中的单向方差分析（analysis of variance，ANOVA），Duncan检验进行统计分析，P＜0.05认为有统计学意义。使用Origin2017作图。
2 结果与分析
2.1 甜酒曲对米酒的影响
2.1.1 不同甜酒曲对米酒还原糖和总糖含量的影响
还原糖含量的变化一定程度上反映了糖化与发酵速度的平衡和协调关系[17]。不同甜酒曲对米酒还原糖和总糖含量的影响结果见图1。由图1可以看出，安琪甜酒曲制作的米酒中还原糖的含量显著高于其他4种甜酒曲制作的米酒（P＜0.05），为19.08 mg/g。西王、苏州蜂蜜、尚川甜酒曲制作的米酒中还原糖含量没有显著性差异（P＞0.05）。安琪甜酒曲制作的米酒中总糖含量显著高于其他4种甜酒曲制作的米酒（P＜0.05），为3.67%。安琪甜酒曲制作的米酒中双龙甜酒曲制作的米酒中还原糖和总糖含量相对较低。
图1 不同甜酒曲对米酒还原糖和总糖含量的影响
Fig.1 Effect of different sweet koji on reducing sugar and total sugar content of rice wine
2.1.2 不同甜酒曲对米酒pH值和总酸的影响
pH值和总酸是非常重要的发酵参数，不仅在一定程度上反应了酒中微生物的生长代谢情况，而且影响着微生物的生长及代谢产物的形成[18]。不同甜酒曲对米酒pH值和总酸的影响结果见图2。从图2可以看出，安琪甜酒曲制作的米酒pH值显著高于其他4种甜酒曲制作的米酒（P＜0.05），为3.70。而西王、苏州蜂蜜、尚川甜酒曲制作的米酒的pH值在3.24～3.27之间，没有显著性差异（P＞0.05），可能由于在酵母的快速生长和所产生酒精的共同作用下，抑制有害微生物的侵入、生长和自身的产酸[19]，使得pH值较低。总酸度（TA）是指酒醅中所有酸性成分的总量，包括未解离酸的浓度和已解离酸的浓度[20]。安琪甜酒曲制作的米酒TA显著低于其他4种甜酒曲制作的米酒（P＜0.05）。
图2 不同甜酒曲对米酒pH值和总酸的影响
Fig.2 Effect of different sweet koji on pH and total acid of rice wine
2.1.3 不同甜酒曲对米酒淀粉酶活力和蛋白酶活力的影响
图3 不同甜酒曲对米酒淀粉酶活和蛋白酶活的影响
Fig.3 Effect of different sweet koji on amylase activity and protease activity of rice wine
不同甜酒曲对米酒淀粉酶活力和蛋白酶活力的影响见图3。淀粉酶的主要功能是将原料中的大分子淀粉水解，最终生成葡萄糖[21]。由图3可以看出，安琪甜酒曲制作的米酒中淀粉酶活性显著高于其他4种甜酒曲（P＜0.05）。说明安琪甜酒曲中淀粉酶分解淀粉的能力更强，能产生更多的还原糖，为根霉菌、酵母菌、乳酸菌等的生长繁殖提供充足的营养原料。双龙甜酒曲制作的米酒中淀粉酶活性相对较低，说明淀粉产生还原糖的能力较弱。苏州蜂蜜、双龙、尚川甜酒曲制作的米酒中蛋白酶活力没有显著性差异（P＞0.05）。安琪甜酒曲制作的米酒中蛋白酶活性显著高于其他4种甜酒曲（P＜0.05），为22.5 U/g。蛋白水解对改善制品风味和质地是必不可少的，水解后的蛋白质比原蛋白质有更好的营养特性，易被人体吸收[22-23]。
2.1.4 不同甜酒曲对米酒中酵母菌和乳酸菌总数的影响
不同甜酒曲对米酒中酵母菌和乳酸菌总数的影响结果见图4。由图4可知，双龙、尚川甜酒曲制作的米酒中酵母菌总数显著高于其他3种甜酒曲（P＜0.05），其对数值分别为7.90、7.64。乳酸菌在人体内具有抑制病原微生物生长、产生有利于宿主代谢的酶和B族维生素等诸多“益生”功能，也会影响米酒的风味和香味[24-25]。这5种甜酒曲制作的米酒中，乳酸菌总数对数值为3.78～6.67。安琪、尚川甜酒曲制作的米酒中乳酸菌总数没有显著性差异（P＞0.05），其对数值分别为4.44、4.18。
图4 不同甜酒曲对米酒中酵母菌和乳酸菌总数的影响
Fig.4 Effect of different sweet koji on total number of yeast and lactic acid bacteria in rice wine
2.2 不同甜酒曲对馒头的影响
2.2.1 不同甜酒曲对米酒馒头硬度和比容的影响
图5 不同甜酒曲对米酒馒头硬度和比容影响
Fig.5 Effect of different sweet koji on hardness and specific volume of rice wine steamed bread
馒头硬度越大，其比容相对较小。不同甜酒曲对米酒馒头硬度和比容的影响结果见图5。由图5可知，尚川米酒馒头、安琪米酒馒头比容显著高于其他3种馒头（P＜0.05），比容分别达到了2.45 mL/g、2.64 mL/g。由于安琪米酒中，还原糖含量较高，为酵母的生长提供更充足的营养物质，酵母菌产气量增加，使得馒头的比容相对较大。尚川米酒馒头、安琪米酒馒头硬度显著低于其他3种馒头（P＜0.05）。
2.2.2 不同甜酒曲对米酒馒头白度和感官评分的影响
馒头白度与其内部结构有关，当其内部孔洞太小或太大时馒头白度都降低[26]。不同甜酒曲对米酒馒头白度和感官评分的影响见图6。由图6可知，尚川米酒馒头、安琪米酒馒头的白度与感官评分都显著高于其他3种馒头（P＜0.05），尚川米酒和安琪米酒中还原糖含量相对较高，由于面团在发酵过程中产生更多的CO2，面筋网络结构得到扩展，馒头的白度相对提高，吃起来爽口不粘牙，咀嚼不费力，拥有更好的口感和米酒风味，馒头的感官评分分别达到了81.8分、85.2分。
图6 不同甜酒曲对米酒馒头白度和感官评分的影响
Fig.6 Effect of different sweet koji on whiteness and sensory score of rice wine steamed bread
3 结论
本实验选用5种不同的甜酒曲制作米酒，并将米酒作为发酵剂制作馒头。对制作的5种米酒的还原糖、总糖、pH值、总酸、蛋白酶活性、淀粉酶活性、酵母菌和乳酸菌总数，以及馒头的比容、硬度、白度和感官评分进行分析。研究发现安琪甜酒曲制作的米酒与其他4种米酒在还原糖、总糖、pH值、总酸、蛋白酶活性和淀粉酶活性6个指标上存在着显著性差异（P＜0.05）；双龙、尚川甜酒曲制作的米酒中酵母菌总数没有显著性差异（P＞0.05）；安琪、尚川甜酒曲制作的米酒中乳酸菌总数没有显著性差异（P＞0.05）。尚川米酒馒头、安琪米酒馒头比容、硬度、白度、感官评分没有显著性差异（P＞0.05）。尚川米酒和安琪米酒中馒头白度相对较高，吃起来爽口不粘牙，咀嚼不费力，拥有更好的口感和米酒风味，馒头的感官评分分别达到了81.8分、85.2分。进一步为米酒馒头的制作、加工提供一定的参考价值。
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