随着社会经济的迅速发展、工业现代化程度的提高，人们的生活节奏明显加快。现代都市中青年普遍使用电脑办公，工作压力大，节奏快，夜生活不节制，经常熬夜，极易造成便秘的情况[1-4]。便秘会加重患者的思想负担，增添焦虑紧张情绪，并对人体内环境、内分泌系统均有一定影响，日久也可能诱发或加重其他疾病，影响患者的生活质量[5-7]。因此，润肠通便，防治大便秘结对于保持身体健康，延年益寿具有十分重要的意义。
果醋是以果实或果酒为原料，通过微生物发酵成的酸性饮料或者调味品，兼具食醋和水果的双重营养保健功能[8]。果醋含有丰富的有机酸、氨基酸、维生素及矿物质，具有食疗保健，美白护肤、抗病、抗衰老、抗疲劳等功能，被誉为“21世纪的食品”[9-13]。目前市场上的果醋多为单一品种的水果果醋，而对于采用两种或两种以上水果为原料酿制复合果醋的产品并不常见。如果能充分利用丰富的水果资源开发果醋及果醋饮料产品，就可以有效解决鲜果滞销的问题，为果蔬深加工提供广阔地发展空间[14-15]。
含果醋乳饮料的开发是近年来研究的热点，较之于单纯的传统食醋或者果醋开发，以及单纯酸性乳饮料开发，含果醋乳饮料兼具了果醋保健和酸乳营养丰富的优点[16-17]。但目前市场上含果醋乳饮料的开发主要是将发酵型的果醋和乳制品进行调配，如将成品果醋和牛奶按一定比例调配或者将发酵型苹果醋和酸奶进行调配制成苹果醋酸奶乳饮料。但调配型果醋乳饮料原料利用率较低，质量不稳定，风味物质损失严重[18-19]。
针对当前果醋乳饮料存在的问题，本研究研发一种具有润肠通便功能的发酵型复合果醋乳饮料，以茶淀葡萄、苹果和柚子为原料经过酒精发酵、醋酸发酵、益生菌发酵后调配成发酵型复合果醋乳饮料，并研究其对小鼠润肠通便功能的影响，为果蔬深加工以及果醋乳产品的开发提供新的思路。
1 材料与方法
1.1 材料与试剂
1.1.1 原料与试剂
茶淀葡萄、苹果、柚子、脱脂牛奶：天津市蔬菜水果批发市场；白砂糖（一级）：市售；柠檬酸钠、羧甲基纤维素钠、果胶（均为食品级）：国药集团（天津自贸区）供应链有限公司；阿拉伯胶（分析纯）：天津市福晨化学试剂厂；活性炭：广州舒野环保材料有限公司；复方地芬诺酯片、盐酸洛哌丁胺：长春长红制药有限公司。
1.1.2 菌株
巴氏醋杆菌（Acetobacter pasteurianus）AS1.41：天津科技大学微生物制药研究室；酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）CICC 1012、嗜酸乳杆菌（Lactobacillus acidophilus）CICC 22150：中国工业微生物菌种保藏管理中心；葡萄酒酵母RW：安琪酵母有限公司。
1.1.3 动物
健康雄性昆明小鼠[体质量（20±2）g，100只]：中国食品药品检定研究院，许可证号：SCXK（京）2014-0013。
1.1.4 培养基
醋酸菌培养基：30 g葡萄糖、10 g酵母膏、10 g蛋白胨溶解于1 000 mL水中，于115℃条件下灭菌20 min，冷却后在无菌条件下加入35 mL无水乙醇。
MRS乳酸菌培养基：10 g蛋白胨、10 g酵母膏、20 g葡萄糖、1.0 mL吐温80、2 g K2HPO4、5 g醋酸钠、2 g柠檬酸二铵、0.58 gMgSO4·7H2O、0.25 gMnSO4·4H2O溶解于1 000 mL水中，pH 6.2～6.6，121℃灭菌20 min。
1.2 仪器与设备
BG2004型电子分析天平：南京安铎贸易有限责任公司；TGL-16B型高速台式离心机：上海安亭科学仪器；WE-3型水浴恒温振荡器：天津市欧诺仪器仪表有限公司；WYT型手持式糖度计：上海天垒仪器公司；JYL-C60T榨汁机：九阳股份有限公司。
1.3 方法
1.3.1 复合果醋乳饮料加工工艺流程及操作要点
操作要点：
原料制浆：根据前期预实验结果，茶淀葡萄12 kg、苹果6 kg及柚子（含皮）3 kg破碎榨汁，添加适量抗坏血酸，以防止褐变。
酶解：于复合果汁中添加0.018 g/L果胶酶，45℃酶解2 h，在70℃钝化酶，杀菌、冷却待用。
酒精发酵：用蔗糖调节总糖质量浓度至250g/L，按0.2g/L的接种量接入已经用30℃1%蔗糖水溶液活化20min后的活性干酵母RW，25℃进行酒精发酵，当发酵液中的总糖质量浓度低于5 g/L时终止发酵，得到复合果酒醪液，此时酒精度为（8.5±0.5）%vol。
醋酸发酵：将酒精发酵获得的果酒醪液中酒精浓度用纯净水稀释至7.5%vol后，接入巴氏醋杆菌AS1.41种子液（10%接种量），30℃、180 r/min条件下进行醋酸发酵，当发酵液中的总酸含量达到（6.5±0.5）g/100 mL，终止发酵得到复合果醋醪液。
混合：将复合果醋醪液稀释至酸度为（0.5±0.1）g/100mL后按70%的添加量加入已灭菌的脱脂生牛乳液得到混合液，经过滤、均质、灭菌备用。
益生菌发酵：混合液中接入植物乳杆菌种子液（10%接种量），42℃条件下静置发酵3 d。
调配：发酵完成的复合果醋乳中加入（10±2）%原料果汁后，再加入蔗糖、柠檬酸钠、羧甲基纤维素钠和果胶进行调配。
灌装、成品：将调配得到的复合果醋乳经超高温瞬时灭菌后在无菌条件下灌装入250 mL无菌纸盒（康美包：采用PE/白纸板/PE/Al/粘合层/PE 6层复合结构），即得复合果醋乳饮料成品。
1.3.2 复合果醋乳饮料配方优化单因素试验
为使复合果醋乳饮料在口感上更加柔和，风味上更加突出，对其配方进行优化，选取2.5%、5.0%、7.5%、10.0%、12.5%蔗糖添加量调整甜度，0.25‰、0.50‰、0.75‰、1.00‰、1.25‰柠檬酸钠添加量调节酸度，0.5‰、1.0‰、1.5‰、2.0‰、2.5‰果胶添加量和0.25‰、0.50‰、0.75‰、1.00‰、1.25‰羧甲基纤维素钠添加量调节黏稠度及稳定性，调配后进行感官评价。
1.3.3 复合果醋乳饮料配方优化正交试验
在单因素试验基础上，采用4因素3水平的正交设计L9（34）优化复合果醋乳饮料配方，正交试验因素与水平见表1。
表1 复合果醋乳饮料配方优化正交试验因素与水平
Table 1 Factors and levels of orthogonal experiments for formula optimization of compound fruit vinegar milk beverage
水平 A蔗糖/% B柠檬酸钠/‰ C果胶/‰ D羧甲基纤维素钠/‰1 2 3 5.0 7.5 10.0 0.75 1.00 1.25 1.5 2.0 2.5 0.75 1.00 1.25
1.3.4 复合果醋乳饮料品质分析
感官评定：复合果醋乳饮料感官评分标准见表2，随机抽取10名食品专业学生组成评分小组按照感官评分标准进行打分，取平均值作为感官评分结果，满分100分。
表2 复合果醋乳饮料感官评分标准
Table 2 Sensory evaluation standards of compound fruit vinegar milk beverage
项目 评分标准 级别 分值/分色泽（24分）香气（24分）口味（28分）组织形态（24分）呈淡紫色，色泽均匀黄色，棕色，褐色色泽发暗，呈褐色有奶香味，果乳特有的香味，无不良气味酸味过重或无香气有难以接受的气味细腻顺滑，酸甜适宜，没有苦涩，爽口细腻酸甜失调，口感一般酸味过重，无味或有异味组织细腻，体态均匀，允许有少量乳清析出质地不均匀，稍有分层明显分层，质地很不均匀优中差优中差优中差优中差16～24 8～16 0～8 16～24 8～16 0～8 16～28 8～16 0～8 16～24 8～16 0～8
理化指标：蛋白质和苯甲酸含量测定参照GB/T21732—2008《含乳饮料》中方法进行[20]。
微生物测定：大肠杆菌采用菌落计数法；致病菌参照GB/T 22429—2008《食品中沙门氏菌、肠出血性大肠埃希氏菌O157及单核细胞增生李斯特氏菌的快速筛选检验酶联免疫法》中的方法测定[21]。
1.3.5 润肠通便功能评价动物试验
参考《保健食品检验与评价技术规范实施手册》中规定的通便功能检验方法，考察复合果醋乳饮料润肠通便的功能。
（1）动物分组及饲养
健康雄性昆明小鼠，体质量18～22g，饲养温度（24±1）℃，相对湿度40%～60%，昼夜间隔12 h；设置空白组、模型组、高、中、低剂量组，每组20只。
（2）动物给药方式及剂量
墨汁的配制：阿拉伯胶100 g，加水800 mL，煮沸至透明溶液，称取活性炭粉末50 g，加入上述溶液煮沸3次，冷却至室温后补水至1 000 mL，4℃保存，用前摇匀。
剂量计算：按照成人（体质量按70 kg计算）每天饮用1瓶，即100 mL计算，小鼠折算剂量按人体10倍计，即小鼠每天饮用1 000 mL/70 kg，每只小鼠按20 g计，即每只小鼠每天饮用0.33 mL。
空白组受试小鼠，每天灌胃1次，每次0.33 mL生理盐水，连续灌胃14 d；模型组受试小鼠，利用盐酸洛哌丁胺建立便秘模型组；实验组受试小鼠，给已建立的便秘模型组受试小鼠灌胃复合果醋乳饮料，高剂量组每天灌胃0.6 mL，低剂量组每天灌胃0.3 mL，连续灌胃14 d。
（3）小鼠小肠运动实验
连续灌胃14 d后，各组小鼠禁食不禁水12 h；模型组和高、中、低剂量组分别灌胃给予复方地芬诺酯5 mg/kg体质量，空白组给蒸馏水；复方地芬诺酯灌胃30 min后，各组进行最后一次剂量灌胃；灌胃后空白组、模型组和高、中、低剂量组分别灌胃0.4 mL墨汁；30 min后立即处死各组受试小鼠，分离获取幽门至盲部的肠管，拉直后分别测量肠管总长度、幽门至墨汁前沿的墨汁推进长度，并计算每只受试小鼠墨汁推进率，其计算公式为小鼠墨汁推进率=墨汁推进长度/肠管总长度×100%。
（4）小鼠排便实验
连续灌胃14 d后，各组小鼠禁食不禁水12 h；模型组和高、中、低剂量组分别灌胃给予复方地芬诺酯5 mg/kg体质量，空白组给蒸馏水；复方地芬诺酯灌胃30 min后，各组进行最后一次剂量灌胃；灌胃后空白组、模型组和高、中、低剂量组分别灌胃0.4 mL墨汁，灌胃后各组动物单独饲养，自由摄食摄水，并记录自灌胃墨汁起，每只动物排首粒黑便的时间。
1.3.6 统计分析
采用SPSS 13.0软件进行数据分析，以“平均值±标准偏差”表示，多组数据比较采用方差分析，组间比较采用t检验，以P＜0.05为差异显著；P＜0.01为差异极显著。
2 结果与分析
2.1 复合果醋乳饮料配方优化结果
以感官评分为评价指标，采用单因素试验和正交试验对复合果醋乳饮料调配工序中蔗糖、柠檬酸钠、羧甲基纤维素钠和果胶的添加量进行优化，以期得到一种风味较好、符合大众口味的复合果醋乳饮料。
2.1.1 复合果醋乳饮料配方优化单因素试验
由图1A可知，当果醋乳饮料蔗糖添加量在5.0%～10.0%时感官评分较高，蔗糖较多时，口感甜度太浓；含量较少时，酸味的刺激较明显，酸味较重。因此，蔗糖添加量选择7.5%较合适。由图1B可知，当果醋乳饮料柠檬酸钠添加量在0.50‰～1.00‰时感官评分较高，添加量过低时酸味明显，刺激感较大；添加量较高时，口味较涩。因此，柠檬酸钠添加量选择1.00%较合适。由图1C可知，当果醋乳饮料羧甲基纤维素钠添加量在0.75‰～1.25‰时感官评分较高，此时果醋乳的体态均匀，口感润滑；添加量过低时，产品太稀，有颗粒；添加量较高时，产品过于黏稠，无爽滑感；因此，羧甲基纤维素钠添加量选择1.00%较合适。由图1D可知，当果醋乳果胶添加量在1.5‰～2.5‰时感官评分较高，组织细腻，无分层和沉淀现象；添加量较低时，产品有轻微分层现象；添加量较高时，产品涩感明显；因此，果胶添加量选择2.0‰较合适。
图1 各组分添加量对复合果醋乳饮料感官品质的影响
Fig.1 Effect of each component addition on sensory quality of compound fruit vinegar milk beverage
2.1.2 复合果醋乳饮料配方优化正交试验
以感官评分为评价指标，采用L9（34）正交试验对蔗糖（A）、柠檬酸钠（B）、果胶（C）及羧甲基纤维素钠（D）和的添加量进行优化，正交试验结果与分析见表3。由表3可知，对复合果醋乳饮料影响因素由大到小的顺序依次为蔗糖添加量（A）＞羧甲基纤维素钠添加量（D）＞柠檬酸钠添加量（B）＞果胶添加量（C）；由k值确定最优配方组合为A2B2C3D2，即蔗糖7.5%、柠檬酸钠1.00‰、果胶2.5‰、羧甲基纤维素钠1.00‰。在此优化配方条件下，感官评分为95分。
表3 复合果醋乳饮料配方优化正交试验结果与分析
Table 3 Results and analysis of orthogonal experiments for formula optimization of compound fruit vinegar milk beverage
试验号 A蔗糖/%B柠檬酸钠/‰C果胶/‰D羧甲基纤维素钠/‰感官评分/分1 2 3 4 5 6 7 8 9 k1 k2 k3 R 1（5.0）1 1 1（0.75）2（1.00）3（1.25）1（1.5）2（2.0）3（2.5）1（0.75）2（1.00）3（1.25）2（7.5）2 2 3（10.0）3 3 1 2 3 1 2 3 2 3 1 3 1 2 3 2 1 2 3 1 84.71 87.14 82.64 89.81 94.55 91.48 83.82 81.06 82.68 84.83 91.95 82.52 9.43 86.11 87.58 85.60 1.98 85.75 86.54 87.00 1.25 87.31 87.48 84.50 2.98
2.2 产品质量评价
感官指标：色泽为淡紫色、液体澄清，无沉淀、口味清新，具有酸乳独特的口感，感官评分为95分。
理化指标：乳蛋白质含量为1.3 g/100 g，苯甲酸含量为0.01 g/kg，符合GB/T 21732—2008《含乳饮料》中乳蛋白质≥1.0 g/100 g、苯甲酸≤0.03 g/kg的规定。
微生物指标：细菌总数＜100 CFU/mL，大肠杆菌＜3 MPN/100 mL，致病菌未检出。
2.3 润肠通便功能评价
2.3.1 复合果醋乳饮料对小鼠小肠运动的影响
复合果醋乳饮料对小鼠小肠运动的影响结果见表4。
表4 复合果醋乳饮料对小鼠小肠运动的影响
Table 4 Effect of compound fruit vinegar milk beverage on small intestine movement of mice
注：“#”表示与空白组比较差异显著（P＜0.05），“*”表示与模型组比较差异显著（P＜0.05），“**”表示与模型组比较差异极显著（P＜0.01）。
组别 肠管总长/cm 推进长度/cm 推进率/%空白组模型组低剂量实验组高剂量实验组42.16±4.06 44.61±3.69 41.96±4.75 45.87±5.08 34.02±5.16 31.00±6.28 35.56±3.21 42.39±3.84 80.69±6.18 69.49±5.69#84.75±5.47*92.42±4.49**
由表4可知，与空白组相比，模型组墨汁推进率显著降低（P＜0.05）；与模型组相比，低剂量组墨汁推进率有显著提高（P＜0.05），高剂量组墨汁推进率有极显著提高（P＜0.01）。
2.3.2 复合果醋乳饮料对小鼠排便的影响
复合果醋乳饮料对小鼠排便的影响结果见表5。由表5可知，与空白组相比，模型组首次排黑便时间极显著延长（P＜0.01）；与模型组相比，高、低剂量组首次排黑便时间极显著缩短（P＜0.01），且高剂量组排黑便时间与空白组相近。
表5 复合果醋乳饮料对小鼠排便的影响
Table 5 Effect of compound fruit vinegar milk beverage on defecation of mice
注：“##”表示与空白组比较差异极显著（P＜0.01），“**”表示与模型组比较差异极显著（P＜0.01）。
组别 首次排黑便时间/min空白组模型组低剂量组高剂量组72.9±10.6 118.2±8.9##75.7±7.6**70.5±8.1**
综上所述，该发酵型复合果醋乳饮料连续灌胃14 d后，在各组动物单独饲养，自由摄食摄水，无人为影响其活动的基础上，模型组与空白组存在极显著差异（P＜0.01），即复方地芬诺酯可显著抑制空白组动物的正常排便行为。而剂量组动物的排便行为与模型组存在极显著差异（P＜0.01），与空白组无显著性差异（P＞0.05），结果表明，剂量组动物在复方地芬诺酯刺激后，其被抑制的排便行为得以恢复至正常水平，该结果与程阳等[22]针对羊栖菜褐藻酸钠对便秘模型小鼠的润肠通便的研究相符。因此，通过小鼠小肠推进实验和小鼠排便实验相关结果结果，表明该复合果醋乳饮料具有良好的促进润肠通便的功能。
3 结论
本研究结合当前市场要求，首次以茶淀葡萄、苹果、柚子和牛奶为原料，经过微生物三次发酵开发出了的一种新型的复合果醋乳饮料，通过单因素和正交试验对该饮料的调配工艺进行优化，最终确定复合果醋乳饮料的配方为：蔗糖7.5%、柠檬酸钠1.00‰、果胶2.5‰、羧甲基纤维素钠1.00‰。在此优化条件下，感官评分为95分。该饮料产品在色泽、香气和滋味等方面均能显示其产品特色，其理化指标和微生物指标均符合国家标准。同时考察该饮料对小鼠机体润肠通便功能的影响，进一步证明该复合果醋乳饮料具有良好的润肠通便的功能，是一种具有开发潜力的发酵型饮品。
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