大曲提供了白酒发酵所需要的微生物，也是一种复合酶制剂、形成白酒复杂风味成分的前驱物质[1]。大曲品质对曲酒的出酒率和酒质都有极大影响，常有“曲为酒之骨”[2]。中国白酒根据风味可分为酱香型、浓香型、清香型和特香型等[3]，白酒特殊风味来源于参与白酒发酵的微生物的种类和数量，大曲的品质直接关系到白酒品质，也直接影响到白酒的风格特征及其风味[4]。而以四特酒为代表的特香型白酒，具有“清香醇纯，回味无穷”特性，深受消费者喜爱。特香型白酒大曲制曲采用的原料为面粉、麦麸和丟糟，在我国独一无二，特色明显[5]。传统大曲品质评定通常局限于感官评定，随着监测手段和科学技术的发展，大曲的理化指标及酶系变化也成为考量大曲质量优劣的重要因素。近年来，专家们研究了不同类型酒曲生产过程中理化指标和水解酶系的动态变化。班世栋等[6]对酱香型的3种大曲的水解酶系进行研究，结果表明，随着贮存时间的延长，大曲的酶活变化趋势不同，大曲酶活大多在新曲和贮存3个月时达到最高，适宜的酶活力决定了白酒的品质，大曲中的酶活力在贮存过程中一般有降低的趋势，但在贮存过程中风味物质也在不断积累。王晓丹等[7]对浓香型大曲中酶系与白酒品质关系进行了研究，结果表明，大曲的生化性能，对酒质的优劣和白酒产量的高低有着决定作用。王俏等[8]对不同香型酒曲的理化性能进行对比分析，结果表明，从水分上看，特香型的水分含量最高，豉香型水分含量最低；从酸度上来看，酱香型曲最高，豉香型最低；从糖化力来看，清香型曲的糖化力最高，酱香型曲的最低等，不同香型的大曲的理化性能各不相同，这也是不同香型大曲特有风格形成的重要原因之一。但是目前国内外对于特香型白酒大曲的研究较少，为了了解特香型大曲在制曲过程中理化指标及其水解酶系的变化规律，本研究以特香型大曲为研究对象，采用国家标准测定方法在夏秋两季对曲块不同层面的各种理化指标及水解酶系进行检测分析，旨在为特香型白酒制曲生产以及工艺优化提供理论依据。
1 材料与方法
1.1 材料与试剂
特香型大曲：四特酒有限公司；碘、干酪素：美国Sigma公司；可溶性淀粉、硫代硫酸钠、乳酸钠：天津大茂化学试剂厂；柠檬酸、乳酸：上海山浦化工有限公司；三氯乙酸、羧甲基纤维素钠：国药集团化学试剂有限公司；L-酪氨酸：上海蓝季科技有限公司；3,5-二硝基水杨酸（dinitrosalicylic acid，DNA）：北京索莱宝生物工程技术有限责任公司；己酸：上海晶纯试剂有限公司；淀粉含量测定试剂盒：苏州科铭生物技术有限公司；液化型淀粉酶（α-淀粉酶）：南京建成生物科技有限公司。实验所用化学试剂均为分析纯或生化试剂。
1.2 仪器与设备
FA2004B电子天平：上海佑科仪器仪表有限公司；PHS-3G雷磁电子pH计：上海精密科学仪器有限公司；TCL20M高速冷冻离心机：常州百密思仪器有限公司；HH-3数显恒温水浴锅：国华电器有限公司；ZFD-5040电热恒温鼓风干燥箱：上海跃进医疗器械厂；T1可见光分光光度计：上海屹谱仪器有限公司。
1.3 方法
1.3.1 样品处理方法
（1）大曲采集
2017年6月份及10月份从四特酒有限责任公司采集特香型大曲（制曲期0～20d）。随机选定3个曲房，每个房间每5d从不同位置选取3块大曲。
（2）大曲样品收集
采集的大曲为砖型（27cm×17cm×7～8 cm），分外、中、内三层收集样品。大曲由外至内1 cm厚区域设为曲表层（曲皮）；曲表与曲心之间颜色较深，设为中层（火圈层）；火圈层以内、曲中心2 cm区域设为内层（曲心）。分别收集三层样品，粉碎，混匀过筛后，称取200 g，置4℃冰箱贮存。
1.3.2 大曲理化指标及水解酶系的测定方法
（1）水分、酸度的测定
水分、酸度的测定方法参照QB/T 4257—2011《酿酒大曲通用分析方法》[9]。水分含量及酸度计算公式如下：
式中：X为水分含量，g/100 g；m1为烘干前称量瓶加试样的质量，g；m2为烘干后称量瓶加试样的质量，g；m为恒质量称量瓶的质量，g。
式中：X为酸度，mmol/10 g；c为氢氧化钠标准溶液的浓度，mo1/L；V1为滴定试样时，消耗氢氧化钠标准溶液的体积，mL；V0为空白试验时，消耗氢氧化钠标准溶液的体积，mL；200为试样稀释体积，mL；20为取样液进行滴定的体积，mL。
（2）淀粉含量的测定
采用淀粉含量试剂盒测定大曲中淀粉含量。即利用体积分数为80%乙醇把样品中可溶性糖与淀粉分开，进一步采用酸水解法分解淀粉为葡萄糖，采用蒽酮比色法测定葡萄糖含量，其计算公式如下：
式中：X为淀粉含量，mg/g；A为620 nm条件下测定的吸光度值；W为样本质量，g。
（3）酸性蛋白酶活力的测定
酸性蛋白酶酶活测定参照SB/T 10317—1999《蛋白酶活力测定法》[10]。酸性蛋白酶酶活定义：1 g干曲，在40℃、pH 3.0条件下，1 min水解酪蛋白生成1 μg酪氨酸所需的酶量为1个酶活力单位（U/g）。
（4）纤维素酶活力的测定
纤维素酶活力的测定采用DNS法，参照QB2583—2003《纤维素酶制剂》[11]。纤维素酶酶活定义：1 g固体酶（或1 mL液体酶），在（50±0.1）℃、指定pH条件下（酸性纤维素酶pH 4.8，中性纤维素酶pH 6.0），1 h水解羧甲基纤维素钠底物，产生出相当于1 mg葡萄糖的还原糖量，为1个酶活力单位（U/g）。
（5）糖化酶活力的测定
采用次碘酸盐法，参照GB8276—2006《糖化酶制剂》[12]。糖化酶酶活定义：在40℃、pH4.6条件下，1h转化可溶性淀粉生成1mg葡萄糖所需的酶量定义为一个酶活力单位（U/g）。
（6）液化型淀粉酶活力的测定
采用α-淀粉酶试剂盒对大曲液化型淀粉酶活力进行测定。液化型淀粉酶酶活定义：1g样本中的淀粉酶，在37℃与底物作用30 min，水解10 mg淀粉为1个酶活单位（U/g）。
（7）酯化力的测定
在大曲中，酯酶的作用是催化一个酸基和一个醇基反应酯化，所以以己酸乙酯的含量来定义大曲的酯化力。酯化力的检测方法参照沈怡方[13]《白酒生产技术全书》。酯化力定义为：1 g大曲在30～32℃，经过100 h催化己酸和乙醇合成1 mg己酸乙酯定义为一个酶活单位（mg/g）。
1.3.3 数据处理
运用Excel2007对实验数据进行整理并进行统计处理，实验结果以平均值表示，并算出其标准偏差，采用Origin9.0软件对理化指标和水解酶系实验数据进行分析。
2 结果与分析
2.1 特香型大曲的理化指标
2.1.1 含水量
大曲含水量是一个非常重要的指标，水分在制曲期与大曲中微生物的生长和各种酶的产生息息相关。由于四特酒厂7、8月份停止生产大曲，6月和10月是夏季和秋季具有代表性的月份，因此，对6月和10月发酵期间大曲不同层面含水量进行测定，结果见图1。
图1 6月（A）及10月（B）大曲样品含水量变化
Fig.1 Changes of water contents of Daqu samples in June(A)and October(B)
由图1可知，6月和10月大曲各层样品含水量均随制曲时间的延长而呈下降趋势。最初含水量在45%左右，20 d出房时，6月、10月大曲样品含水量分别为13.612%、16.37%，此时曲心含水量最多，6月和10月曲心含水量分别为19.34%、24.79%，曲表层含水量最少，6月和10月曲表层含水量分别为7.81%、11.45%。0～5 d，曲表层含水量下降最为剧烈，6月、10月分别下降了58.51%、54.15%。这是由于霉菌等微生物大量生长繁殖产热，曲房温度升高，大曲水分被蒸发和消耗。而曲心位于最里层，微生物生长缓慢，曲心温度相对较低，湿度相对其他两层都较高。在制曲时间内，6月大曲各层含水量均比10月大曲样品低，主要原因是6月的温度比10月高，湿度比10月份低。因此，含水量的变化不仅与大曲分层有关，还与所处季节的温度、湿度有关。
2.1.2 酸度
大曲酸度的形成主要来源于生酸微生物进行的有机酸代谢以及脂肪、淀粉和蛋白质的降解，是大曲微生物综合作用的结果。适宜的酸度可抑制大曲中部分有害杂菌生长，同时也为有益微生物提供营养和参与酯化反应生成香味物质[14]。采用酸碱中和电位滴定法[9]，对6月和10月发酵期间大曲不同层面酸度进行测定，结果见图2。
图2 6月（A）及10月（B）大曲样品酸度变化
Fig.2 Changes of acidity of Daqu samples in June(A)and October(B)
由图2可知，酸度总体趋势先上升后缓慢下降。0～5 d大曲各层酸度值迅速上升，随后曲表层与曲心酸度下降，而火圈层保持缓慢上升趋势。第10天后，表层曲呈现缓慢上升而后略有下降，曲心在第15天后酸度下降趋于缓和。制曲不同时期的酸度测定结果显示，6月出房大曲曲表层、火圈层、曲心的酸度值分别为1.69mmol/10g、4.49mmol/10g、1.98mmol/10g；10月出房大曲曲表层、火圈层、曲心的酸度值分别为0.82 mmol/10 g、2.26 mmol/10 g、0.77 mmol/10 g，6月不同层面酸度明显高于10月。6月曲房温度高，大曲内部散热慢，温度迅速上升，微生物大量生长繁殖，造成曲内部缺氧，酸性物质大量生成。
2.1.3 淀粉含量
淀粉含量也是评价大曲好坏的一个重要指标。采用淀粉含量试剂盒，对6月和10月发酵期间大曲不同层面淀粉含量进行测定，结果见图3。
图3 6月（A）及10月（B）大曲样品淀粉含量变化
Fig.3 Changes of starch contents of Daqu samples in June(A)and October(B)
由图3可知，淀粉含量为曲心＞火圈层＞曲表层，表明曲心淀粉利用率最低，曲表层淀粉利用率最高。大曲淀粉含量在制曲过程中先上升后下降，0～5d淀粉含量上升，6月出房大曲淀粉含量增加了7.24mg/g，10月出房大曲淀粉含量增加了2.09mg/g，推测大曲中部分物质被微生物降解成不溶性多糖，造成淀粉含量的升高假象；在5～10d，下降最为剧烈，6月和10月大曲淀粉利用率分别为39.88%、36.7%，此时淀粉利用率达到最大；10d后，淀粉含量下降减缓，甚至存在上升趋势，说明后期微生物一方面在利用剩余的淀粉，一方面也在将其他物质降解为不可溶性多糖。比较两个月大曲样品淀粉检测结果，6月份大曲各部位淀粉含量大于10月份大曲。
2.2 特香型大曲的水解酶系分析
2.2.1 酸性蛋白酶
采用福林酚法[10]对6月和10月发酵期间大曲不同层面酸性蛋白酶活力测定，结果见图4。
图4 6月（A）及10月（B）大曲样品酸性蛋白酶活力变化
Fig.4 Changes of acid protease activity of Daqu samples in June(A)and October(B)
由图4可知，曲心酸性蛋白的酶活波浪式变化明显，6月和10月出房大曲曲心酶活均在制曲第10天最低，分别为34.61U/g、34.3 U/g，最大值在第20天，分别为80.51 U/g、132.51 U/g；6月份大曲表层酶活呈现先升高后几乎趋于平稳，最大值在第5天，为169.51 U/g，火圈层酶活则先升高后降低，最大值在第15天，为138.64U/g；10月份大曲曲表层和火圈层酶活变化趋势较一致，均为升高后降低，第10天达最大值，分别为220.14 U/g、275.79 U/g；而火圈层酶活显著高于曲表层。10月份大曲样品酸性蛋白酶总体酶活高于6月份。
2.2.2 纤维素酶
纤维素酶可以将原料淀粉中3%左右的纤维素和半纤维素转化成可发酵性糖，再经酵母发酵转化为酒精，从而提高出酒率；纤维素酶对纤维素有降解作用，能破坏间质细胞壁的结构，使其包含的淀粉释放出来，有利于糖化作用[15]。采用DNS法对6月和10月发酵期间大曲不同层面纤维素酶活力测定，结果见图5。
由图5可知，6月大曲不同部位的纤维素酶活呈先上升后下降的趋势，其中曲表层酶活最高，发酵期间最高可达2.67 U/g，曲心最低，发酵期间最低为0.98 U/g，不同部位的酶活均在制曲第15天达到峰值，此时曲表层、火圈层、曲心酶活分别为2.67 U/g、2.37 U/g、1.80 U/g；10月大曲表层和火圈层的酶活呈先上升后下降的趋势，曲心酶活呈波浪形变化趋势，其中火圈层酶活最高，可达2.33 U/g，曲心酶活最低，为0.43 U/g。不同月份的大曲的纤维素酶活变化趋势不一致，导致这种现象的原因有很多。大曲中纤维素酶来源广泛，细菌、真菌和放线菌都有产纤维素酶的能力[16]。不同的温度、湿度以及酸度同样会导致酶活变化。
图5 6月（A）及10月（B）大曲样品纤维素酶活力变化
Fig.5 Changes of cellulase activity of Daqu samples in June(A)and October(B)
2.2.3 液化型淀粉酶
大曲中液化型淀粉酶又称α-淀粉酶，主要作用是将淀粉水解为小分子的糊精。酒曲中液化型淀粉酶主要来源于枯草芽孢杆菌、米曲霉、白曲霉、黑根霉等微生物[17]。采用α-淀粉酶试剂盒，对6月和10月发酵期间大曲不同层面液化型淀粉酶活力进行检测，结果见图6。
图6 6月（A）及10月（B）大曲样品液化型淀粉酶活力变化
Fig.6 Changes of liquefied amylase activity of Daqu samples in June(A)and October(B)
由图6可知，在制曲期0～5 d，6月和10月大曲曲心液化型淀粉酶酶活迅速下降，分别下降了11.07 U/g、11.78 U/g，而外层与火圈层酶活力略有升高；制曲期5～20d，6月大曲曲表层酶活力无明显变化，曲心酶活升高后下降为5.14U/g，火圈层酶活下降后升高为12.30U/g，10月大曲曲表层和火圈层酶活力无明显变化，曲心酶活升高了8.85 U/g。在整个制曲过程中，曲表层酶活最高，曲心酶活最低。
2.2.4 糖化酶
大曲的糖化酶可以直接将淀粉转化为D-葡萄糖。一般在大曲中产生糖化酶的菌类是霉菌[18]。糖化是白酒发酵的基础，糖化酶具有糖化力，糖化力的高低与淀粉的转化率息息相关，而糖化效果也会直接影响白酒的出酒率[19]。采用次碘酸盐法对6月和10月发酵期间大曲不同层面糖化酶活力进行测定，结果见图7。
图7 6月（A）及10月（B）大曲样品糖化酶活力变化
Fig.7 Changes of saccharifying enzyme activity of Daqu samples in June(A)and October(B)
由图7可知，在制曲期0～5 d，大曲各部位糖化酶活力差异显著，其中曲表层酶活力最高，6月和10月大曲表层酶活分别为1801.92U/g、3183.10U/g，曲心酶活力最低，6月和10月大曲曲心酶活分别为163.74 U/g、119.0 U/g。根据其他实验取样检测，0～5d是霉菌生长从快速到平稳的时期，糖化酶活力也随之上升-下降的波动。制曲期5～20d，火圈层和曲心酶活力保持相对平稳状态，表层则呈现先上升、后下降、再趋于平稳的变化。6月与10月大曲糖化酶活力升降变化趋势基本一致，但10月大曲样品各部位糖化酶活力明显高于6月。
图8 6月（A）及10月（B）大曲样品酯化力变化
Fig.8 Changes in esterification power of Daqu samples in June(A)and October(B)
2.2.5 酯化力
大曲的生酯能力（酯化力）来源于大曲中的酯化功能菌和功能酶，是将醇和酸酯化成酯的能力[20]。根据文献[13]中酯化力的测定方法，对6月和10月发酵期间大曲不同层面酯化力进行测定，结果见图8。
由图8可知，6月大曲各部位酯化力大致都表现为先升高、后下降、再略上升的趋势，10月大曲各部位酯化力表现为先略降低、后升高、再下降的趋势。6月样品火圈层酯化力在5d达到顶峰值，为64.09 mg/g，10月样品火圈层酯化力在10 d达到顶峰值为57.23 mg/g，估计与两个季节温度、湿度相差比较大，造成曲霉生长快慢不同有关。制曲前期火圈层酯化力大于大曲各部位，后期曲心酯化力更高，表层酯化力一直处于最低。
2.3 夏秋两季大曲各项检测指标的比较
对夏秋两季大曲从入曲房至出曲房（0～20 d）的曲总样的各项指标进行比较，结果见表1。由表1可知，夏季（6月）大曲各时期含水量低于秋季（10月），而酸度值明显高于10月，淀粉含量同样高于10月；酸性蛋白酶、糖化酶活力则是10月远高于6月；液化型淀粉酶活力、酯化力在制曲5 d前，6月高于10月，10 d以后则是后者高于前者；纤维素酶活力大小情况相反，制曲5d前，6月份低，10d后，6月高于10月。夏季（6月）最高气温平均27.8℃，最低气温平均22.3℃；秋季（10月）最高平均为22.5℃，最低14.7℃。6月份气温明显高于10月，秋季温度更适宜微生物的生长繁殖。从整个制曲过程检测数据及出房新曲（20d）数据看，秋季（10月）大曲优于夏季（6月）大曲。
表1 夏秋两季大曲样品中各项指标的比较
Table 1 Comparison of each index of Daqu samples of summer and autumn
制曲时间/d 含水量/%0 5 1 0 15 20 6月份10月份6月份10月份6月份10月份6月份10月份6月份10月份43.9 45.5 33.5 38.6 20.7 29.9 15.8 24.2 15.7 16.4酸度/（mmol·10 g-1）0.3 0.3 3.2 1.8 3.2 1.4 3.0 1.2 2.7 1.2淀粉含量/（mg·g-1）40.2 37.4 40.2 39.5 47.5 25.0 28.5 20.0 25.1 20.7酸性蛋白酶/（U·g-1）54.4 54.5 144.2 232.3 98.0 180.7 113.9 138.6 78.6 151.1纤维素酶/（U·g-1）0.7 0.7 1.3 1.7 1.4 0.9 2.1 0.9 1.7 1.1液化型淀粉酶/（U·g-1）11.9 12.1 15.2 13.8 13.1 15.1 13.7 15.1 11.1 15.2糖化酶/（U·g-1）3 788.4 4 433.7 755.4 1 157.1 723.3 1 013.7 561.5 1 148.9 665.8 1 206.5酯化力/（mg·g-1）39.0 32.2 55.5 30.2 40.4 49.5 36.1 49.9 40.1 46.0
出房新曲（制曲20 d）不同层次比较，结果见表2。由表2可知，糖化酶活力差异最显著，曲表层＞火圈层＞曲心；其次为含水量差异明显，曲表层＜火圈层＜曲心；酸度值为火圈层最高，曲表层和曲心差异不明显。从总体上看，曲表层糖化酶活力最高；曲心液化型淀粉酶活力、糖化酶活力、酸性蛋白酶活力最低，酯化力、淀粉含量偏高；火圈层居于两者之间。6月新曲各层的酸度值、淀粉含量、纤维素酶活性均高于10月；含水量、酸性蛋白酶、液化型淀粉酶、糖化酶活力和酯化力则均低于10月，尤其是糖化酶活力差异更为显著。进一步表明秋季大曲的质量优于夏季大曲。
表2 新曲样品不同部位各项指标的比较
Table 2 Comparison of each index of different part of new Daqu sample
新曲不同部位 含水量/%曲外层火圈层曲心6月10月6月10月6月10月7.9 11.5 16.0 22.1 18.6 24.8酸度/（mmol·10 g-1）1.7 0.8 4.5 2.3 2.0 0.8淀粉含量/（mg·g-1）21.0 15.1 26.3 22.9 26.9 30.0酸性蛋白酶/（U·g-1）168.9 173.2 85.8 197.4 80.5 132.5纤维素酶/（U·g-1）2.0 1.6 1.9 1.8 1.8 0.9液化型淀粉酶/（U·g-1）14.3 15.0 12.3 15.4 5.1 9.2糖化酶/（U·g-1）2177.4 3056.0 131.2 809.0 8.0 237.6酯化力/（mg·g-1）30.2 31.5 34.8 47.7 47.3 47.4
3 讨论
固态发酵大曲酒的大曲具有糖化、发酵、生香等功能，其质量直接影响大曲酒的产量与品质。大曲曲块不同部位因通气状况、二氧化碳浓度、水分、温度等微环境的差异而呈现不同的理化特性。纵观不同香型大曲酒的大曲研究均显示类似结果。清香型汾酒大曲曲皮糖化力800～1400[mg/（g·h）]较曲心糖化力400～800[mg/（g·h）]整体偏高[21]，浓香型国窖曲曲心的糖化力比曲表层低53.60%，而酯化力较曲表层高116.84%[22]。本研究特香型四特酒的糖化力曲表层2 177～3 056 U/g，显著高于火圈层、曲心，其酯化力则是曲心、火圈层高于曲表层，与其他白酒大曲规律类似。
周国红等[23]认为白酒的质量、香味物质的产生以及风格的形成与美拉德反应产物的种类多少、含量高低密切相关。关于白酒大曲火圈层的水解酶系、酸度、含水量等特性均鲜有报道。本研究显示，特香型白酒大曲火圈层酸度明显高于曲表层、曲心，在制曲前期火圈层酯化力大于大曲各部位，液化力与糖化力低于曲表层、高于曲心。
4 结论
通过对6月和10月特香型大曲制曲期间的各项理化指标和水解酶系的测定显示，6月大曲各层含水量均比10月大曲样品低，酸度明显高于后者，各部位淀粉含量大于10月大曲；而大曲各类水解酶（酸性蛋白酶、液化型淀粉酶、糖化酶、酯化力等）在制曲期均有升降动态变化，但总体水平为10月高于6月大曲。夏季温度高、湿度大，大曲微生物生长过快，造成升温过猛，造成微生物生长繁殖不充分，从而影响大曲质量。
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