以小麦为原料制成的酱香型高温大曲含有多种菌种及酶类[1-2]，在酱香型白酒生产过程中起着菌种剂、糖化、发酵、生香以及提供营养底物的功能，大曲的质量直接关系着酒的风格和质量[3-6]。在制曲的过程中，由于发酵仓内温度、水分等参数指标的差异，使得大曲拆仓时易形成三种类别的大曲，即白曲、黄曲和黑曲[7-9]。在实际生产中，白曲、黄曲和黑曲经过存储后混合磨碎投入制酒生产使用，因此大曲质量的评判对制酒生产有重要影响[10]。
在制曲过程中，大曲中的游离氨基酸和碳水化合物作用产生美拉德反应，使大曲颜色加深，美拉德反应是大曲色泽形成的重要原因[11]，从而影响大曲质量的感官判别。同时，游离氨基酸是微生物生长代谢赖以生存的氮源来源之一，影响着微生物的生长情况和代谢物的产生[12]。氨基酸还可作为高级醇、酯类等大曲香气物质形成的重要前体物质[13-14]，不同的氨基酸能呈现甜、鲜、苦等味道，对白酒的风味及口感形成起着重要作用。
吴光斌等[15]对不同等级中温大曲的氨基酸含量进行了研究，并发现游离氨基酸与大曲质量有一定的关系。龚士选等[16]曾提出用α-氨基酸态氮含量评价大曲质量。炊伟强[17]通过分析浓香型高温大曲和中高温大曲的游离氨基酸，发现优质大曲中游离氨基酸总量均高于普级大曲，高温优质大曲中鲜味氨基酸显著高于普级大曲。该研究结合感官评价分类结果，采用茚三酮衍生法对酱香型白酒高温大曲拆仓大曲进行游离氨基酸分析，以探讨大曲游离氨基酸与大曲质量的关系，为进一步揭示不同类别大曲的功能奠定基础，同时为酱香型大曲制曲标准化发展提供理论依据。
1 材料与方法
1.1 材料与试剂
酱香型白酒高温大曲：经感官评价分类的高温拆仓大曲，其中白曲16个，黄曲19个，黑曲21个，均取自贵州茅台酒股份有限公司。
酸性和中性氨基酸及相关化合物标准品（β-丙氨酸、L-丙氨酸、α-氨基己二酸、α-氨基丁酸、α-氨基异丁酸、天冬酰胺、天冬氨酸、瓜氨酸、胱硫醚、半胱氨酸、谷氨酸、甘氨酸、羟脯氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、蛋氨酸、苯丙氨酸、磷酸丝氨酸、脯氨酸、磷酸乙醇胺、苏氨酸、牛磺酸、苏氨酸、酪氨酸、缬氨酸）、生理和碱性氨基酸及相关化合物标准品（γ-氨基丁酸、鹅肌肽、精氨酸、肌肽、乙醇胺、组氨酸、同半胱胺酸、羟赖氨酸、赖氨酸、1-甲基组氨酸、3-甲基组氨酸、鸟氨酸、色氨酸）：美国Sigma Aldrich公司；磺基水杨酸（分析纯）：中国BBI生命科学公司；Ultra Physiological Fluid Chenical Kit：英国Biochrmo公司。
1.2 仪器与设备
Biochrom30+氨基酸分析仪：英国Biochrom公司；MIKRO 220R台式高速冷冻离心机：德国Hettich公司。
1.3 方法
1.3.1 样品制备
取1g大曲加入至10mL纯净水中，剧烈振荡混匀10min，4℃放置过夜，浸出其可溶性成分，10000r/min离心15min。取滤液5 mL于离心管中，加入5 mL 10%的磺基水杨酸，振荡混匀后12000r/min离心15min，取上清液1mL，用0.45μm微孔滤膜过滤后，上机检测。
1.3.2 测定方法
测定条件：Peeku-1884离子分离柱，锂型Ultropac8阳离子交换树脂，梯度洗脱，分离柱柱温31～67℃，反应单元温度135℃；泵Ⅰ（缓冲液）流速35mL/h，泵压力1.5～14.5MPa，泵Ⅱ（反应液）流速25 mL/h，泵压力0.2～1.2 MPa；检测波长：一通道570 nm，二通道440 nm。
1.3.3 分析方法
采用外标法定量并计算各种氨基酸的含量[18-19]；应用SPSS软件对数据进行统计及student's-ttest（非成对数据比较分析）；应用xlstat软件（2015试用版）对大曲进行判别分析。
2 结果与分析
2.1 氨基酸标准曲线的建立
混合氨基酸标准品中含有酸性、中性、碱性氨基酸及相关化合物，对混合标准氨基酸样品分析检测，检测结果见图1。由图1可知，570 nm通道可检测36种氨基酸及相关化合物，440 nm通道可检测出羟脯氨酸和脯氨酸2种氨基酸。所有的氨基酸及相关化合物能够在125 min内得到较理想的分离效果。根据标准游离氨基酸测定结果计算得到各种氨基酸的校正因子，各氨基酸质量浓度Y（mg/L）对峰面积X的标准曲线回归方程见表1。由表1可知，相关系数R2均＞0.99，结果表明，各氨基酸质量浓度与峰面积在一定范围内线性关系良好。
图1 氨基酸混合标准品色图谱
Fig.1 Chromatogram of mixed amino acids standards
表1 游离氨基酸标准曲线回归方程
Table 1 Standard curve regression equation of free amino acids
氨基酸 标准曲线回归方程 相关系数R2天冬氨酸（Asp）苏氨酸（Thr）丝氨酸（Ser）天冬酰胺（Asn）谷氨酸（Glu）甘氨酸（Gly）丙氨酸（Ala）α-氨基丁酸（Aaba）缬氨酸（Val）蛋氨酸（Met）异亮氨酸（Ile）亮氨酸（Leu）酪氨酸（Tyr）苯丙氨酸（Phe）γ-氨基丁酸（GABA）氨（Amm）鸟氨酸（Orn）赖氨酸（Lys）组氨酸（His）精氨酸（Arg）脯氨酸（Pro）Y=54.82X+252.37 Y=51.16X+137.32 Y=59.99X+93.72 Y=24.45X+43.02 Y=43.27X+123.48 Y=80.35X+98.48 Y=66.16X+78.37 Y=60.65X+68.63 Y=52.64X+91.65 Y=39.50X+129.18 Y=44.33X+51.425 Y=39.90X+395.42 Y=29.30X+300.69 Y=34.01X+225.85 Y=51.04X+240.45 Y=108.77X+222.99 Y=45.05X+210.24 Y=38.47X+153.93 Y=42.99X+42.27 Y=33.11X+130.85 Y=6.59X-12.70 0.996 4 0.999 5 0.999 3 0.999 6 0.999 7 0.998 7 0.998 9 0.999 7 0.999 8 0.999 3 0.999 2 0.998 2 0.998 6 0.999 7 0.999 7 0.999 2 0.997 0 0.997 9 0.997 8 0.999 9 0.993 3
2.2 大曲游离氨基酸含量分析
大曲样品经过处理进样后，游离氨基酸分析图谱见图2，从图2可看出，峰型及分离效果良好。从拆仓大曲中共检出氨基酸及相关化合物21种。
图2 大曲氨基酸色图谱
Fig.2 Chromatogram of amino acids in Daqu
对白曲、黄曲和黑曲游离总氨基酸含量（不含α-氨基丁酸、γ-氨基酸丁酸）进行分析，结果见图3。由图3可知，不同类别拆仓大曲氨基酸总量存在极显著差异（P＜0.01），拆仓大曲游离氨基酸总量大小顺序为黑曲＞黄曲＞白曲，白曲游离总氨基酸含量为9.65 mg/g，黄曲游离氨基酸总量为10.57 mg/g，黑曲游离总氨基酸含量为12.52 mg/g。
图3 不同类别大曲游离总氨基酸含量
Fig.3 Total content of free amino acids in different types of Daqu
白曲、黄曲和黑曲中均检测出天冬氨酸、苏氨酸、丝氨酸、天冬酰胺、谷氨酸、甘氨酸、丙氨酸、缬氨酸、蛋氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、酪氨酸、苯丙氨酸、鸟氨酸、赖氨酸、组氨酸、精氨酸和脯氨酸共18种氨基酸，未检出色氨酸和瓜氨酸。根据标准曲线获得大曲游离氨基酸的含量，白曲、黄曲和黑曲游离氨基酸（不含氨）平均含量及占比见表2。
从表2可看出，黄曲和白曲中谷氨酸含量最高，平均含量分别为1.24 mg/g、1.30 mg/g，占总氨基酸的11.51%及13.18%，其次为脯氨酸、丙氨酸。在黑曲中脯氨酸含量最高，平均含量为1.58 mg/g，占总氨基酸的12.36%，其次为丙氨酸、异亮氨酸和谷氨酸。此外，在3种大曲中均检测出了γ-氨基丁酸，平均含量均为0.13 mg/g。
表2 不同类别大曲游离氨基酸平均含量及占比
Table 2 Average content and distribution of free amino acids in different types of Daqu
类别 氨基酸名称白曲含量/（mg·g-1）黄曲含量/（mg·g-1）黑曲含量/（mg·g-1）占比/%酸性氨基酸中性氨基酸羟基氨基酸碱性氨基酸含硫氨基酸芳香族氨基酸杂环氨基酸其他氨基酸及化合物天冬氨酸谷氨酸甘氨酸丙氨酸缬氨酸亮氨酸异亮氨酸丝氨酸苏氨酸精氨酸赖氨酸蛋氨酸苯丙氨酸酪氨酸脯氨酸组氨酸鸟氨酸天冬酰胺γ-氨基丁酸α-氨基丁酸0.37 1.30 0.32 1.20 0.64 0.46 0.80 0.36 0.39 0.29 0.42 0.07 0.74 0.53 1.24 0.26 0.20 0.13 0.13 0.14占比/%3.74 13.18 3.30 12.23 6.51 4.67 8.11 3.62 3.92 2.95 4.28 0.69 7.55 5.36 12.64 2.60 2.02 1.29 1.36 1.40 0.58 1.24 0.34 1.08 0.84 0.58 0.92 0.53 0.52 0.42 0.43 0.07 0.68 0.62 1.20 0.12 0.19 0.27 0.13 0.05占比/%5.39 11.51 3.20 10.02 7.78 5.36 8.53 4.96 4.86 3.89 4.02 0.62 6.34 5.72 11.17 1.15 1.76 2.54 1.18 0.46 0.83 1.10 0.39 1.26 1.06 0.76 1.20 0.64 0.65 0.46 0.44 0.07 0.84 0.62 1.58 0.14 0.16 0.30 0.13 0.05 6.22 4.68 12.36 0.86 6.22 4.68 12.36 0.86 6.22 4.68 12.36 0.86 6.22 4.68 12.36 0.86 1.39 2.54 0.66 0.43
在18种氨基酸中，中性氨基酸含量最高（含甘氨酸、丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸），占游离氨基酸总量的34.89%（白曲）～38.68%（黑曲），其次为酸性氨基酸（天冬氨酸、谷氨酸）、杂环氨基酸（脯氨酸、组氨酸）以及芳香族氨基酸（苯丙氨酸、酪氨酸），含硫氨基酸含量最低。
2.3 大曲游离氨基酸差异性比较
为了进一步了解白曲、黄曲和黑曲之间游离氨基酸的差异，基于大曲游离氨基酸含量进行了student's-t test（非成对数据比较）差异性分析，结果见图4。由图4可知，白曲、黄曲、黑曲在不同游离氨基酸含量上存在显著性差异（P＜0.05），大曲氨基酸差异具体为白曲和黄曲在苏氨酸、丝氨酸上存在显著性差异（P＜0.05），天冬氨酸、天冬酰胺、缬氨酸、组氨酸和精氨酸上存在极显著性差异（P＜0.01）。白曲和黑曲在谷氨酸、甘氨酸、脯氨酸和鸟氨酸含量上存在显著性差异（P＜0.05），天冬氨酸、苏氨酸、丝氨酸、天冬酰胺、缬氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、组氨酸、精氨酸差异极显著（P＜0.01）。黄曲和黑曲在丙氨酸、苏氨酸、丝氨酸、苯丙氨酸和脯氨酸上差异显著（P＜0.05），天冬氨酸、缬氨酸、异亮氨酸、亮氨酸有极显著差异（P＜0.01）。其中天冬氨酸、苏氨酸、丝氨酸、缬氨酸、异亮氨酸、亮氨酸和精氨酸在大曲中均随着大曲颜色加深而上升，这几类氨基酸在黑曲中含量最高，在白曲中含量最低。谷氨酸则呈相反趋势，在白曲中含量最高，黑曲中含量最低，同时白曲中的组氨酸含量也显著高于黑曲和黄曲（P＜0.05）。除了上述几种氨基酸，黄曲的丙氨酸、苯丙氨酸含量显著低于黑曲（P＜0.05），而黑曲的脯氨酸则显著高于黄曲和白曲（P＜0.05）。
图4 不同类别大曲氨基酸差异性分析
Fig.4 Difference analysis of amino acids in different types of Daqu
在发酵过程中，氨基酸为酵母代谢提供氮源，氨基酸的碳骨架可参与酵母细胞内其他氨基酸或蛋白的合成[20]。天冬氨酸、苏氨酸、丝氨酸、天冬酰胺、谷氨酸、脯氨酸的碳骨架来源于糖类化合物[21]，同时脯氨酸在整个发酵过程中不能被酵母利用[22]，因此，虽然在三类大曲中这几种氨基酸存在显著差异，但是其初始浓度可能对酿造过程风味影响相对较小。而甘氨酸、丙氨酸、缬氨酸、异亮氨酸、酪氨酸和苯丙氨酸的碳骨架虽能由糖类合成，但在发酵后期主要来自于原料中的此类氨基酸，这几类氨基酸的差异可能影响发酵过程中风味物质的形成。组氨酸、亮氨酸、赖氨酸和精氨酸的碳骨架则几乎不由糖类物质合成，完全来自于原料中相应的氨基酸，这几类氨基酸的差异可能对酵母氮代谢产生影响并影响白酒品质。缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、苯丙氨酸等氨基酸可作为高级醇的前体物质同时也会影响乙醇的生成[23-25]。甘氨酸、丙氨酸、缬氨酸、异亮氨酸、苯丙氨酸、组氨酸、亮氨酸、赖氨酸和精氨酸在三种大曲中均存在不同程度的差异性，可能导致三类大曲的功能存在差异并影响大曲的风味及制酒发酵过程酵母氮代谢及风味物质代谢。
2.4 判别分析
为了进一步了解游离氨基酸与大曲类别之间的关系，基于天冬氨酸、苏氨酸、丝氨酸、天冬酰胺、谷氨酸、甘氨酸、丙氨酸、缬氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、酪氨酸、苯丙氨酸、鸟氨酸、赖氨酸、组氨酸、精氨酸和脯氨酸含量，利用xlstat软件对56个拆仓大曲对大曲进行判别分析，建立判别模型见图5。由图5可知，利用上述氨基酸能将白曲、黄曲和黑曲进行区分，分别位于不同的维度，利用该模型对大曲进行判别，判别正确率为86.79%。
图5 不同类别大曲判别模型图
Fig.5 Discriminant model of different types of Daqu
3 结论
本研究结合感官评价分类结果对高温拆仓大曲的游离氨基酸进行分析比较，结果表明，大曲中能检测出天冬氨酸、苏氨酸、丝氨酸、天冬酰胺、谷氨酸、甘氨酸、丙氨酸、缬氨酸、蛋氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、酪氨酸、苯丙氨酸、鸟氨酸、赖氨酸、组氨酸、精氨酸和脯氨酸共18种氨基酸和活性物质γ-氨基酸丁酸，色氨酸及瓜氨酸未检出。黑曲游离总氨基酸含量最高（12.52 mg/g），黄曲次之（10.57 mg/g），白曲最低（9.65 mg/g）。白曲、黄曲、黑曲在氨基酸含量上存在显著性差异（P＜0.05），其中天冬氨酸、苏氨酸、丝氨酸、缬氨酸、异亮氨酸、亮氨酸和精氨酸在大曲中均随着发酵程度升高而上升，这几类氨基酸在黑曲中含量最高，在白曲中含量最低。谷氨酸则呈相反趋势，在白曲中含量最高，黑曲中含量最低，同时白曲中的组氨酸含量也显著高于黑曲和黄曲（P＜0.05）。除了上述几种氨基酸，黄曲中的丙氨酸、苯丙氨酸含量显著低于黑曲（P＜0.05），而黑曲的脯氨酸则显著高于黄曲和白曲（P＜0.05）。进一步运用xlstat软件基于上述18种氨基酸建立判别模型，可利用氨基酸浓度对大曲类别进行有效判别。通过分析不同类别高温拆仓大曲中游离氨基酸，为大曲分类评价标准的完善和提升提供理论基础，并为研究大曲功能提供了新思路。
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