酸菜是日常生活中常见的发酵类食品，含有大量的可食用营养成分，浸制的过程能产生天然的植物酵素，具有保持胃肠道正常生理功能的作用[1]，酸菜发酵中乳酸菌起重要的作用[2-6]。酸菜发酵过程中会产生硝酸盐和亚硝酸盐，亚硝酸盐是一种化学致癌物，医学研究证明，人体摄入的硝酸盐在细菌的作用下，可以还原成亚硝酸盐，亚硝酸盐可使血液的运氧能力下降，还会形成强致癌物亚硝胺。亚硝酸盐的形成与发酵蔬菜中微生物密切相关[7]，因此，微生物多样性是研究酸菜的焦点。
变性梯度凝胶电泳（denaturinggradientgelelectrophoresis，DGGE）是将同一种属的不同长度的脱氧核糖核酸（deoxyribonucleic acid，DNA）片段分开[8]，其原理是根据DNA在不同浓度的变性剂中解链行为的不同而导致电泳迁移率发生变化，从而将片段大小相同而碱基组成不同的DNA片段分开[9-11]。在凝胶成像系统中观察到的条带的荧光强度反映了该菌的丰富度，条带越亮，表示该种菌的数量越多[12]。该技术被广泛应用于各种环境微生态的研究，如高温热泉等[13]。DGGE在国外还被广泛用于食品微生态的研究，鉴定微生物种类，评估食品质量，如益生制品、酸面团、干酪等[14]。
有研究报道，酸菜中含有丰富的细菌和真菌，其中，细菌主要有干酪乳杆菌（Lactobacillus casei）、植物乳杆菌（Lactobacillus plantarum）、醋酸杆菌（Acetobacter aceti）等，真菌主要为德巴利汉逊酵母（Debaryomyces hansenii），酸菜发酵过程中真菌种类比细菌种类少[4]。刘晓辉等[15-16]采用传统培养方法从酸菜中分离乳酸菌，并鉴定为短乳杆菌（Lactobacillusbrevis）、植物乳杆菌（Lactobacillusplanetarium）和肠膜明串珠菌（Leuconostocmesen teroides）；丛敏等[17]采用聚合酶链式反应（polymerase chain reaction，PCR）结合DGGE技术对发酵第40天的酸菜分析得出，酸菜的主要优势菌群为乳杆菌属，包括植物乳杆菌、鼠李糖乳杆菌（Lactobacillus rhamnosus）、短乳杆菌（Lactobacillus brevis）、干酪乳杆菌、棒状乳杆菌（Lactobacillus coryniformis）、戊糖乳杆菌（Lactobacillus pentosus）、唾液乳杆菌（Lactobacillus salivarius）等。
本研究以市售散装酸菜SA和袋装酸菜SB、SC为研究对象，采用PCR-DGGE的方法分析酸菜中乳酸菌的多样性，为探究酸菜发酵机理奠定研究基础。
1 材料与方法
1.1 材料与试剂
1.1.1 材料
散称酸菜（SA）、广乐牌泡酸菜（SB）、松源牌酸菜（SC）：均购买于太原美特好超市长风店。
1.1.2 试剂
细菌基因组DNA提取试剂盒：索莱宝生物有限公司；N,N,N',N'-四甲基乙二胺、去离子甲酰、过硫酸铵、尿素（均为分析纯）：美国AMRESCO公司；2×TaqMaster Mix、DH5a感受态细胞：天根生物技术有限公司；引物：由上海生物工程公司合成。
1.2 仪器与设备
TC-96（G）H（b）B Life Touch基因扩增仪：杭州博日科技有限公司；DcodeTM凝胶成像系统、DcodeTM浓度梯度电泳仪：美国Bio-Rad公司；DYY-6C电泳仪：北京六一仪器厂。
1.3 方法
1.3.1 酸菜中食盐及亚硝酸盐含量的测定
食盐含量：采用硝酸银滴定法进行测定[18]；亚硝酸盐含量：按照国标GB/T 5009.33—2008《食品中亚硝酸盐和硝酸盐的测定方法》进行测定[19]。
1.3.2 酸菜汤汁中细菌总DNA的提取
分别取3种酸菜汤汁32 mL，10 000 r/min离心10 min。弃去废液，收集沉淀，用滤纸小心吸干，按照细菌基因组DNA提取试剂盒的说明书提取3种酸菜中细菌的总DNA。
1.3.3 PCR扩增
分别以3种酸菜中细菌的总DNA为模板，WBAC1（5′-CGCCCGCCGCGCCCCGCGCCCGGCCCGCCGCCCCCGCCCCCCCGGGAACGTATTCACCGCG-3′）和 WBAC2（5′-GTCGTCAGCTCGTGTCGTGAGA-3′）为引物对细菌的16S rDNA V7-V8基因序列进行PCR扩增。
PCR扩增体系：引物WBAC1和WBAC2各1 μL、模板DNA 1.5 μL、2×TaqMaster Mix 12.5 μL，加双蒸水（ddH2O）补充至25 μL。
PCR扩增程序：95℃预变性5 min；95℃变性30 s，50℃退火30 s，72℃延伸30 s，共30个循环；72℃再延伸8 min，最后于4℃保存。
PCR扩增产物经1.2%琼脂糖凝胶电泳进行检测。
1.3.4 变性剂梯度凝胶电泳
变性梯度凝胶的配方见表1。
表1 变性梯度凝胶的配方
Table 1 Formula of denaturing gradient gel
试剂40%双丙烯酰胺/mL 50倍TAE Buffer/mL去离子甲酰胺/mL尿素/g ddH2O补至/mL下层胶浓度35%60%上层胶浓度8%20 2 14 14.7 100 20 2 20 21.0 100 2 0.2 10
PCR扩增产物经DGGE后，切割回收电泳条带，将其作为模板进行PCR扩增，16S rDNA V7-V8的PCR扩增产物与pGM-T Vector连接，转化至感受态细胞DH5a。挑取阳性克隆子送至上海生物工程公司测定基因序列。
1.3.5 DGGE图谱分析
DGGE条带结构多样性分析：采用Quantity One软件自动分析确定DGGE图谱上每个条带的位置和相对光密度值。DGGE泳道内的电泳条带数量用以计算物种丰富度（R），运用电泳条带相对密度值计算物种均匀度（E）及物种多样性（H）[19]。多样性指数（H）、均匀度指数（E）及丰富度指数（R）的计算公式：
式中：ni为单一条带的峰面积；N为某一泳道所有峰面积；S为某一泳道的总条带数。
2 结果与分析
2.1 食盐含量的测定
3种酸菜食盐及亚硝酸盐含量测定结果见表2。
表2 3种酸菜食盐及亚硝酸盐含量
Table 2 Salt and nitrite contents in three kinds of sauerkraut
注：同行不同小写字母表示差异显著（P＜0.05）。
SA SB SC食盐含量/（mol·L-1）亚硝酸盐含量/（mg·kg-1）0.73±0.12a 8.40±1.11a 0.17±0.08b 1.20±0.07b 0.30±0.01b 1.20±0.07b
由表2可知，在3种不同厂家的酸菜中，散装酸菜的食盐含量（0.73 mol/L）显著高于两种袋装酸菜（0.17 mol/L、0.30 mol/L）（P＜0.05）；两种袋装酸菜中食盐含量无显著差异（P＞0.05）。散装酸菜的亚硝酸盐含量（8.40 mg/kg）显著高于两种袋装酸菜（1.20 mg/kg、1.20 mg/kg）（P＜0.05），是袋装酸菜的7倍。两种袋装酸菜食盐含量无显著差异（P＞0.05）。我国国标规定的酱腌菜中的亚硝酸盐含量应≤20 mg/kg[20]，说明3种酸菜的亚硝酸盐含量均符合国家标准，均可放心食用。
2.2 PCR-DGGE结果
2.2.1 琼脂糖凝胶电泳分析
对16S rDNA V7-V8片段的PCR扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳，结果如图1所示。
图1 PCR扩增产物琼脂糖凝胶电泳结果
Fig.1 Results of agarose gel electrophoresis of PCR amplification products
由图1可知，3种酸菜的16S rDNA V7-V8 PCR扩增产物的琼脂糖凝胶电泳条带清晰，纯度高，说明提取的DNA可以用于DGGE分析。
2.2.2 变性剂梯度凝胶电泳分析
由于PCR扩增产物分别是3种酸菜中所有微生物16SrDNA V7-V8片段基因的混合，为了鉴定酸菜中原核微生物多样性，因此，需要使用DGGE技术进行分离，DGGE结果见图2。
图2 PCR扩增产物DGGE结果
Fig.2 DGGE results of PCR amplification products
由图2可知，每个酸菜样品中都有不同的条带，酸菜SA有3条电泳带（SA1、SA2、SA3）；酸菜SB有两条电泳带（SB1、SB2）；酸菜SC有3条电泳带（SC1、SC2、SC3）。
采用Quantity One软件对8条电泳带进行分析，经过数据处理得到3种酸菜样品DGGE条带的多样性指数（H）、均匀度指数（E）、丰富度指数（R），结果见表3。
表3 3种酸菜样品DGGE条带的指数分析结果
Table 3 Indexes analysis results of DGGE band of three kinds of sauerkraut samples
注：同列小写字母不同表示差异显著（P＜0.05）。
样品 H E R SA SB SC 3.198a 2.826b 3.082b 1.376a 1.285a 1.357a 8.132a 6.443b 7.964a
由表3可知，3种酸菜样品DGGE条带的均匀度指数无显著差异（P＞0.05）。散装酸菜样品DGGE条带的多样性指数显著大于两种袋装酸菜（P＜0.05），两种袋装酸菜样品DGGE条带的多样性指数无显著差异（P＞0.05）。散装酸菜样品DGGE条带的丰富度指数显著大于袋装酸菜SB（P＜0.05），与袋装酸菜SC无显著差异（P＞0.05）。结果表明，酸菜的包装影响乳酸菌的多样性和丰富性。
2.2.3 测序结果分析
3种酸菜的DGGE条带数量和迁移率均不同，为了研究酸菜中乳酸菌的种类，回收DGGE结果的每个电泳条带，经克隆、测序后，测序结果与美国国立生物技术信息中心（national center for biotechnology information，NCBI）中的GenBank库序列进行比对分析，结果见表4。
表4 发酵酸菜细菌群落的DGGE图谱条带测序结果
Table 4 Sequencing results of DGGE band of bacterial community in fermented sauerkraut
测序条带 登录号 亲缘性最近的菌株 相似度/%SA1 SA2 SA3 SB1 SB2 SC1 SC2 SC3 KR149354.1 LN567195.1 AB749370.1 JX441600.1 AB819503.1 AY733084.2 KC336486.1 LC055606.1 Lactobacillussp.uncultured bacterium unculturedLactococcussp.Lactobacillus homohiochii Lactobacillus curvatus Lactobacillus oligofermentans Lactobacillus homohiochii unculturedLactobacillussp.97 96 98 98 98 96 95 97
由表4可知，散装酸菜SA的3条回收带即SA1、SA2、SA3分别与乳杆菌属（Lactobacillussp.）、非培养细菌（uncultured bacterium）、非培养乳球菌属（unculturedLactococcussp.）的相似度较高，为97%、96%、98%；袋装酸菜SB的两条回收带即SB1、SB2分别与Lactobacillus homohiochii、弯曲乳杆菌（Lactobacillus curvatus）的相似度较高，为98%、98%；袋装酸菜SC的3条回收带即SC1、SC2、SC3分别与寡发酵乳杆菌（Lactobacillus oligofermentans）、Lactobacillus homohiochii、非培养乳杆菌属（unculturedLactobacillussp.）的相似度较高，为96%、95%、97%。结果表明，散装酸菜中非培养微生物含量比袋装酸菜中多，两种袋装酸菜均含有乳杆菌属（Lactobacillussp.）和Lactobacillushomohiochii，散装酸菜与袋装酸菜乳酸菌系不同。
3 结论
采用PCR-DGGE技术对3种酸菜中乳酸菌的多样性进行研究。结果表明，散装酸菜中乳酸菌的多样性指数显著高于袋装酸菜（P＜0.05）。散装酸菜与袋装酸菜乳酸菌系不同，散装酸菜SA中含有Lactobacillussp.、uncultured bacterium、unculturedLactococcussp.；袋装酸菜SB中含有Lactobacillus homohiochii、Lactobacillus curvatus；袋装酸菜SC中含有Lactobacillus oligofermentans、Lactobacillus homohiochii、unculturedLactobacillussp.，两种袋装酸菜中均存在乳酸杆菌属（Lactobacillussp.）和L.homohiochii。
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