豆酱是一类传统发酵食品[1]，以大豆为主要原料，经煮制、压块、制曲发酵制成。其中含有多种人体所需营养成分[2]，经微生物发酵后使其容易被人体消化，并可改善人体肠道功能[3]。许多微生物在豆酱发酵过程中起着重要作用，包括芽孢杆菌、乳杆菌、霉菌、酵母菌等[4-5]，其中米曲霉（Aspergillus oryzae）是发酵过程中的主要微生物[6]。
王哲等[7]研究发现，传统豆酱制作工艺制曲时间长且受季节限制，通常需要2～4个月，后续为达到最佳风味还需充分发酵3个月。虽然有文献报道[8-9]，利用传统方法制酱，控制发酵条件，使得酱发酵至成品的时间大大缩短，由180d缩短至50 d，但还是较酶法制酱时间长。何立涛等[10]研究发现，利用酶法制酱去除制曲步骤，可以使豆酱出品率提高20%。目前，用于制酱的商品酶制剂大多来源于青霉（Penicillium）、黑曲霉（Aspergillusniger）、枯草杆菌（Bacillussubtilis）。CASTRO R J S D等[11]通过使用分离的米曲霉LBA01产生的蛋白酶对大豆分离蛋白进行催化，结果显示，该蛋白酶具有很好的催化活性；曾小波[12]通过研究两株米曲霉蛋白酶在酸性条件下对大豆蛋白的水解能力，结果显示，两株米曲霉所产的蛋白酶均具有较强的水解能力，且均随着pH值的升高，水解程度提高。目前，关于应用米曲霉蛋白酶制酱的研究还未见报道。
本研究以传统豆酱中筛选得到的米曲霉HDF-7为出发菌株，通过盐析、凝胶过滤对其所产的蛋白酶进行分离纯化，利用纯化后的蛋白酶对大豆蛋白进行水解，分析蛋白质的降解情况及氨基酸含量的变化，并将其应用于豆酱的制作，为其在工业制酱的研究发展提供依据，同时促进酶制剂市场的发展。
1 材料与方法
1.1 材料与试剂
1.1.1 样品与试剂
米曲霉HDF-7：黑龙江大学微生物重点实验室，分离自豆酱；大豆蛋白粉：淘宝商城；氢氧化钠（分析纯）：天津市光复科技发展有限公司；盐酸（分析纯）：沈阳市派尔精细化工制品厂；氨水（分析纯）：北京化工厂。其他试剂均为国产分析纯。
1.1.2 培养基
查氏琼脂培养基：蔗糖30 g/L，硫酸镁0.5 g/L，硝酸钠2 g/L，硫酸亚铁0.01 g/L，磷酸氢二钾1 g/L，琼脂20 g/L，氯化钾0.5 g/L。
发酵培养基：酵母提取物3 g/L，葡萄糖10 g/L，麦芽浸膏3 g/L，大豆蛋白胨5 g/L。
以上培养基pH值均自然，用蒸馏水配制，121℃高温湿热灭菌20 min。
1.2 仪器与设备
Air TECH超净工作台：苏净集团安泰有限公司；HQL300A柜式恒温冷冻摇床：中国科学院武汉科学仪器厂；TGL-16B台式离心机：上海安亭科学仪器厂；BG-verMINI迷你垂直电泳仪：北京百晶生物技术有限公司；L-8800氨基酸自动分析仪：日本HiTACHI公司；凝胶层析介质Sephedex G-50：瑞典Amersham公司；732湿强酸性阳离子交换树脂：美国Sigma公司。
1.3 方法
1.3.1 粗酶液的制备
将米曲霉HDF-7斜面于28℃培养箱中培养5 d，加入10 mL无菌生理盐水，洗脱孢子。孢子悬液经无菌擦镜纸过滤于无菌三角瓶（含玻璃珠）中，28℃、300 r/min条件下振荡0.5 h，孢子浓度调至107个/mL。
按1%的接种量将孢子悬液接种于发酵培养基中，28℃、180 r/min条件下培养2 d，离心，上清液即为粗酶液，采用福林-酚试剂测定其蛋白酶活力[13]，重复测定3次。
1.3.2 蛋白酶的分离纯化
采用不同饱和度的硫酸铵（0、10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%）对粗酶液进行盐析，确定最适硫酸铵饱和度；采用葡聚糖凝胶G-50层析法对硫酸铵盐析沉淀进行分离、纯化；采用十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳（sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis，SDS-PAGE）对纯化的米曲霉HDF-7蛋白酶进行检测；回收纯化后的单一蛋白条带，送至上海基康公司进行N端氨基酸测序，测序结果在美国国立生物技术信息中心（national center for biotechnology information，NCBI）进行比对，具体步骤参照文献[14]。
1.3.3 蛋白酶水解大豆蛋白的研究
将2 g大豆蛋白粉加入10 mL去离子水中，50℃条件下水浴溶解10 min，然后加入5 mL蛋白酶酶液（40 U/mL），迅速混匀，反应2 h。待反应结束后，煮沸10 min，使蛋白酶完全变性失活。煮沸后样品静置、冷却，10 000 r/min条件下常温离心20 min，弃沉淀，取上清液待测，以不加酶液的样品作为空白对照。
大豆蛋白质降解分析：利用SDS-PAGE对酶解前后大豆蛋白成分的分子质量大小的分布进行比较。具体步骤参照文献[15]。
氨基酸含量的变化：参照文献[16]对732湿强酸性阳离子交换树脂进行前处理。取5 g处理后的树脂于烧杯中，加入20 mL大豆蛋白水解液，37℃水浴振荡1 h，弃样液。去离子水清洗树脂2～3次，树脂中加入15 mL氨水（5 mol/L），37℃水浴振荡10 min，取清液。氨水洗脱一次，融合两次洗液并采用沸水浴蒸干。用0.02 mol/L HCl定容至50 mL，混匀，获得样品。以原盐酸溶液为空白对照组，利用氨基酸自动分析仪进行检测。
1.3.4 酶法制酱初步研究
原料预处理：100 g大豆蛋白粉中加入15%的盐水100 mL，充分搅匀后于121℃条件下高压灭菌15 min。
豆酱的发酵：原料冷却至40～45℃后，按照15 U/g原料加入纯化的蛋白酶，充分搅拌均匀，保温发酵。发酵3 d后升温至50℃，继续保温发酵4 d，期间每天搅拌一次。
1.3.5 豆酱的感官评价
以曲法制得的豆酱（宝泉牌）作对照，邀请数位试吃人员对豆酱的色、香、味及发酵形态进行整体性评价[17]。
1.3.6 豆酱理化指标的测定
总酸的测定：参照GB/T 5009.39—2003《酱油卫生标准的分析方法》；食盐的测定：参照GB5009.42—2016《食品安全国家标准食盐指标的测定》；铅的检测：参照GB5009.12—2010《食品安全国家标准食品中铅的测定》；总砷的测定：参照GB 5009.11—2014《食品安全国家标准食品中总砷及无机砷的测定》；总氨基酸态氮的测定：参照GB/T5009.40—2003《酱卫生标准的分析方法》；总黄曲霉毒素B1的测定：参照GB 5009.22—2016《食品安全国家标准食品中黄曲霉毒素B族和G族的测定》。
1.3.7 豆酱微生物指标的测定
大肠菌群的测定：参照GB 4789.3—2016《食品安全国家标准食品微生物学检验大肠菌群计数》；致病菌的测定：参照GB 4789.4—2016《食品安全国家标准食品微生物学检验沙门氏菌检验》、GB4789.10—2010《食品安全国家标准食品微生物学检验金黄色葡萄球菌检验》、GB 4789.5—2012《食品安全国家标准食品微生物学检验志贺氏菌检验》。
2 结果与分析
2.1 蛋白酶纯化结果
2.1.1 （NH4）2SO4盐析饱和度的确定
（NH4）2SO4沉淀蛋白酶的盐析曲线见图1。
图1 蛋白酶硫酸铵盐析曲线
Fig.1 Salting-out curve of ammonium sulfate of protease
由图1可知，随着硫酸铵溶液饱和度逐渐上升，上清液中剩余酶活也逐渐降低，当饱和度达到70%时，剩余酶活最低，为（3.34±0.24）U/mL，相对酶活为（13.53±0.96）%；当饱和度达到80%时，剩余酶活为（3.39±0.25）U/mL，相对酶活为（13.73±1.01）%，变化不明显，因此，硫酸铵沉淀蛋白酶的最佳饱和度是70%。
2.1.2 Sephadex G-50层析
利用Sephadex G-50对盐析沉淀进行层析，结果见图2。
图2 蛋白酶Sephadex G-50层析柱洗脱曲线
Fig.2 Elution profile of protease on Sephadex G-50 column
由图2可知，盐析沉淀经Sephadex G-50层析后得到洗脱峰1和2，根据层析原理可知，洗脱峰1的分子质量大于洗脱峰2，对两峰的收集液的蛋白酶活进行测定发现，酶活主要集中在洗脱峰1中，留存洗脱峰1的收集液以备后续检测。
2.1.3 SDS-PAGE结果
将纯化后的蛋白酶进行SDS-PAGE，经染色脱色后得到图3。
图3 纯化后蛋白酶的SDS-PAGE结果
Fig.3 SDS-PAGE result of protease after purification
由图3可知，洗脱峰1经SDS-PAGE检测后，为单一条带，说明此蛋白酶已达到电泳纯。根据蛋白质Marker可推测，此蛋白酶分子质量为30 kDa左右。
2.1.4 氨基酸序列分析
切下目标条带（30kDa）送至上海基康公司进行N端氨基酸测序，得到含12个氨基酸的序列：GGGNDYVILNAQ。将此氨基酸序列在NCBI上比对后发现，其与米曲霉（Aspergillus oryzae）RIB40的中性蛋白酶（ACCESSION：AAT68480）的N端序列具有很高的相似度。
2.2 蛋白酶水解大豆蛋白的研究
2.2.1 大豆蛋白质降解产物的分析
大豆蛋白主要是球蛋白，根据不同分子质量可分为2S、7S、11S和15S四组[18]，其中以7S和11S为主。主要成分有胰蛋白酶抑制剂、细胞色素C、大豆凝集素、解脂酶、β-淀粉酶、7S球蛋白、11S球蛋白[19]。大豆蛋白经水解后，产物以糖基化氨基酸和氨基酸为主。刘汝萃等[20]利用碱性蛋白酶水解大豆分离蛋白发现，酶解主要发生在7S和11S的酸性亚基上，但随着酶解时间的延长，7S亚基条带变化并不显著。
利用纯化的米曲霉蛋白酶HDF-7对大豆蛋白进行水解，采用SDS-PAGE对水解产物进行分析，结果见图4。
图4 酶解前后大豆蛋白的SDS-PAGE结果
Fig.4 SDS-PAGE results of soybean protein before and after enzymatic hydrolysis
由图4可知，根据蛋白分子质量推测大豆蛋白经米曲霉HDF-7蛋白酶酶解后，其中大豆凝集素、解脂酶及一些球蛋白被水解，而胰蛋白酶抑制剂和β-淀粉酶无明显变化，且一些小分子蛋白也未被水解。
大豆凝集素是一种糖蛋白，是一种抗营养因子，具有凝集和促分裂的生物学活性，可由小肠上皮进入循环系统进而诱发免疫反应，破坏机体正常代谢，导致小肠粘膜损伤，内源氮的大量损失，体蛋白加强分解等一系列反应[21]。本实验提取的米曲霉HDF-7蛋白酶能有效水解大豆凝集素，阻止其抗营养作用，使大豆蛋白营养成分更易被吸收，并大大减少对机体的不良影响。
2.2.2 氨基酸含量的变化
由于氨基酸是一种多官能团分子，食用后可与风味受体结合产生特定风味。因此，豆酱中的游离氨基酸的种类和数量对其品质显得尤为重要[22-23]。利用732湿强酸性阳离子交换树脂提取大豆蛋白的水解产物，用氨基酸自动分析仪测定水解产物中各种氨基酸的含量，大豆蛋白酶解前后氨基酸种类的谱图分别见图5和图6。酶解前后各种氨基酸含量的变化结果见表1。
图5 大豆蛋白酶解前氨基酸分析色谱图
Fig.5 Chromatogram of amino acid analysis before enzymatic hydrolysis of soybean protein
图6 大豆蛋白酶解后氨基酸分析色谱图
Fig.6 Chromatogram of amino acid analysis after enzymatic
hydrolysis of soybean protein
由表1可知，大豆蛋白经米曲霉HDF-7蛋白酶酶解后，总氨基酸含量较酶解前增加18.2%，其中半胱氨酸、丙氨酸、缬氨酸、精氨酸含量明显提高（P＜0.01）。立体构型不同的氨基酸含有不同的味道[24]，丙氨酸含有很强的甜味，而精氨酸有苦味，缬氨酸有微甜但略苦的味道，因此，米曲霉HDF-7蛋白酶是一种有潜在应用价值的生物催化剂。
表1 大豆蛋白酶解前后氨基酸含量的变化
Table1 Changes of amino acid contents of before and after enzymatic hydrolysis of soybean protein
氨基酸种类 大豆蛋白酶解前/% 大豆蛋白酶解后/%天冬氨酸（Asp）苏氨酸（Thr）丝氨酸（Ser）谷氨酸（Glu）甘氨酸（Gly）半胱氨酸（Cys）丙氨酸（Ala）缬氨酸（Val）异亮氨酸（Ile）亮氨酸（Leu）酪氨酸（Tyr）苯丙氨酸（Phe）赖氨酸（Lys）精氨酸（Arg）总氨基酸7.81±0.05 2.42±0.05 3.04±0.04 4.96±0.04 6.44±0.04 4.86±0.04 4.92±0.04 2.28±0.02 1.50±0.03 6.13±0.03 12.03±0.03 7.85±0.03 10.47±0.03 3.87±0.03 78.58±0.49 9.76±0.07 2.76±0.12 3.75±0.10 5.42±0.07 7.64±0.09 9.72±0.08 7.45±0.10 6.56±0.08 1.55±0.08 6.23±0.05 11.54±0.06 10.21±0.03 4.93±0.04 9.26±0.10 96.79±1.04
2.3 豆酱的感官评价
传统豆酱色泽大体呈深红或深棕褐色、酱体光亮细腻，酱香浓香绵柔，无不良刺激气味，鲜味突出、咸甜适宜，粘稠适度、均匀、无杂质。但是传统豆酱制作耗时费工（20 d），因此，尝试直接将纯化的蛋白酶加入大豆豆粉中制酱，对其进行感官评价，结果见表2。
表2 豆酱的感官品评结果
Table 2 Results of sensory evaluation of soybean sauce
项目 曲法制酱 酶法制酱色泽滋味香气体态红褐色，有光泽鲜味突出，细滑绵柔、甜咸适中无异味酱香、酯香、醇香浓郁柔和粘稠适度，均匀无杂质酱褐色，有光泽有鲜味，咸甜适宜，柔滑细腻有酱香和酯香，无不良气味偏稀，无杂质
由表2可知，与传统的曲法制得的豆酱相比，酶法制得的豆酱呈酱褐色，口感适宜，咸而不腻，具有酱、酯香，且酱整体偏稀，鲜味也比较适中。总体来说，其风味、外观与传统豆酱差别不大，但传统曲法制酱耗时长，酶法制酱时间短（7 d），工艺较简单。
2.4 豆酱理化指标的测定
豆酱中总酸含量为1.78g/100g，符合国标中总酸含量≤2.0 g/100 g的要求；食盐含量为45 g/100 g，符合国标中食盐含量≥12.0 g/100 g的要求；铅含量为0.02 mg/kg，符合国标中铅含量≤0.5 mg/kg的要求；总砷含量为0.1 mg/kg，符合国标中总砷含量≤0.5 mg/kg的要求；总氨基酸态氮含量为0.97g/100g，符合国标中氨基酸态氮含量≥0.3 g/100 g的要求；黄曲霉毒素B1含量＜5 μg/kg，符合国标中黄曲霉毒素B1含量≤5 μg/kg的要求。
2.5 豆酱微生物指标的测定
豆酱中大肠菌群呈阴性，符合国标中大肠菌群量≤30 MPN/100 g的要求；未检出沙门氏菌、金黄色葡萄球菌、志贺氏菌等致病菌，符合豆酱中致病菌不得检出的要求。
3 结论
采用盐析法、凝胶过滤法分离纯化得到米曲霉HDF-7蛋白酶，该蛋白酶对大豆蛋白水解后，大豆凝集素、解脂酶及一些球蛋白被水解，且总氨基酸含量较水解前增加18.2%，其中丙氨酸、缬氨酸、半胱氨酸和精氨酸的含量明显提高。采用该蛋白酶制作的豆酱除粘着性不高，呈现稀态外，其风味、外观与传统豆酱差别不大，理化指标和微生物指标均符合相关国标要求，且大大缩短了制酱时间（7d），为其在工业制酱的研究发展中提供依据，同时对酶制剂市场的发展具有促进作用。
[1]WANG Y,LI F,CHEN M,et al.Angiotensin I-converting enzyme inhibitory activities of Chinese traditional soy-fermented douchi and soypaste:Effects of processing and simulated gastrointestinal digestion[J].Int J Food Prop,2015,18(4):11.
[2]高秀芝，艾启俊，仝其根，等.传统豆酱和商品豆酱发酵过程中营养及理化指标动态[J].中国食品学报，2013，13（2）：205-210.
[3]李清，王英，刘小莉，等.一株广谱抑菌活性乳酸菌的筛选及特性研究[J].微生物学通报，2015，42（2）：332-339.
[4]辛星，宋刚，周晓杭，等.传统发酵豆酱中乳酸菌的分离、筛选及鉴定[J].中国食品学报，2014，14（9）：202-207.
[5]ZHU L,FAN Z,KUAI H,et al.Batch-batch stable microbial community in the traditional fermentation process of huyumei broad bean pastes[J].Lett Appl Microbiol,2017,65(3):226.
[6]高秀芝，易欣欣，刘慧，等.东北传统豆酱发酵过程中微生物的多样性[J].生物技术通报，2016，32（4）：251-255.
[7]王哲，王思明.传统发酵技术在东北豆酱加工中的利用与发展[J].中国农史，2017，36（2）：118-124.
[8]赵建新.传统豆酱发酵过程分析与控制发酵的研究[D].无锡：江南大学，2011.
[9]李倩.发酵酶解法制备酱香风味基料的研究[D].天津：天津科技大学，2015.
[10]何立涛，刘瑞钦.酶法制酱[J].中国酿造，2005，24（4）：50-51.
[11]CASTRO R J S D,SATO H H.Protease fromAspergillus oryzae:Biochemical characterization and application as a potential biocatalyst for production of protein hydrolysates with antioxidant activities[J].J Food Process,2014,2014:1-11.
[12]曾小波.两株米曲霉蛋白酶及发酵特性研究[D].广州：华南理工大学，2016.
[13]孙晓东，吕国忠，栾雨时，等.传统发酵豆酱中产蛋白酶菌株的筛选[J].中国酿造，2015，34（7）：32-35.
[14]于艳颖，董海莉，平文祥，等.米曲霉HDF-7蛋白酶的分离纯化及酶学性质研究[J].黑龙江大学工程学报，2011，2（2）：74-79.
[15]高莹.副干酪乳杆菌（Lactobacillus paracasei）HD1.7产肽条件优化及肽类分离研究[D].哈尔滨：黑龙江大学，2008.
[16]张俊理.耐冷菌Pseudomonassp.W7产低温蛋白酶水解牛骨蛋白研究[D].哈尔滨：黑龙江大学，2012.
[17]何天明，刘章武.苦荞麦豆酱自然发酵工艺研究[J].中国酿造，2013，32（10）：57-60.
[18]杨光胜，陈复生，张丽芬，等.大豆蛋白改性技术研究进展[J].粮食与油脂，2013，26（11）：1-3.
[19]杜振亚，陈复生.大豆蛋白保健功能研究进展[J].食品与机械，2014，30（6）：247-250.
[20]刘汝萃，曲玲玲，牛祥臣，等.不同水解度的大豆分离蛋白结构与功能性关系探究[J].食品研究与开发，2018，39（11）：22-36.
[21]赵文文，袁慧坤，袁文华，等.大豆凝集素的研究进展[J].黑龙江畜牧兽医，2018（5）：42-44.
[22]田甜，武俊瑞，岳喜庆.豆酱自然发酵过程中质地变化及相关性分析[J].食品与发酵工业，2014，40（2）：27-31.
[23]武俊瑞，岳喜庆，张苗，等.东北传统发酵豆酱中游离氨基酸分析及综合评价[J].食品与生物技术学报，2015，34（2）：158-164.
[24]蒋滢，徐颖，朱庚伯.人类味觉与氨基酸味道[J].氨基酸和生物资源，2002，24（4）：1-3.