铁皮石斛（Dendrobium officinaleKimura et Migo）是兰科石斛属多年生草本植物，其主要药用部位是新鲜或干燥的茎，是传统名贵中药材[1-2]。铁皮石斛含有多糖、芪类、生物碱、氨基酸和矿物质元素等多种成分[3]，具有增强免疫、抗疲劳、抗氧化、促消化、促进唾液分泌、降血糖、降血压、抗肝损伤、抗肿瘤等方面药理作用[4-6]。目前，铁皮石斛的食用方法主要有鲜食[7]、泡茶[8]、煲汤[9]、浸酒[10]、榨汁[11]等。其中铁皮石斛酒多为简单泡制，石斛浸泡酒往往采用酒精度较高的酒浸泡，因此存在口感较刺激等问题，而且难以将活性成分完全溶出，不易被消费者接受[12]。而发酵酒酒精度适宜，口感酸甜可口，而且能更好的溶出有效活性物质，适宜人群较为广泛[13-15]。但是目前在发酵酒方面，单用酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）往往存在发酵后酒精度高，酸度不足，风味欠缺。产乳酸芽孢杆菌（Bacillussp.）DU-106是好氧菌，主要产物是乳酸[16]，将产乳酸芽孢杆菌与酿酒酵母菌按照一定比例混合，能够更好的调节发酵酒的口感。因此，本试验通过单因素试验、正交试验设计优化铁皮石斛发酵酒工艺，以期为铁皮石斛的深加工提供参考依据。
1 材料与方法
1.1 材料与试剂
铁皮石斛：云南芒市红河群鑫石斛种植有限公司；芽孢杆菌（Bacillussp.）DU-106：筛选自传统发酵奶酪，现由华南农业大学新资源食品与功能性原料评价及研究中心鉴定及保藏，菌粉浓度达1012CFU/g；酿酒酵母菌（Saccharomyces cerevisiae）171：安琪酵母公司，本实验室保藏，菌粉浓度为108CFU/g。
1.2 仪器与设备
DHP-600电热恒温培养箱：北京市永光明医疗仪器厂；BS110S精密电子天平：北京赛多利斯天平有限公司；WYT手持糖量计：早州中友光学仪器有限公司；VD-650桌上式洁净式工作台：苏州净化设备有限公司；SHZ-Ⅲ循环水真空泵：上海亚荣生化仪器厂。
1.3 试验方法
1.3.1 铁皮石斛发酵酒的工艺流程及操作要点
操作要点：
原料预处理：将铁皮石斛干条洗净后切成1 cm左右的小段，100℃热烫2～3 min，沥干水，按料液比1∶4的比例加入20 g/L白砂糖溶液，制得发酵体系。
菌种活化、配比：将0.1g产乳酸芽孢杆菌菌粉加入50mL已灭菌的生理盐水中，30℃活化30 min，得产乳酸芽孢杆菌活化液；将0.5 g酿酒酵母菌加入50 mL的5 g/L白砂糖溶液中，30℃活化30 min，得酿酒酵母菌活化液。将两种菌种活化液以一定比例混合，得到菌种活化液。
发酵：在之前制得的发酵体系中添加一定量的菌种活化液，一定条件下进行发酵。
过滤：用0.22 μm微孔滤膜过滤。
1.3.2 铁皮石斛发酵酒工艺优化单因素试验
固定其他条件不变，分别考察菌种配比（芽孢杆菌活化液：酿酒酵母菌活化液（V/V））：1∶1、1∶5、1∶10、1∶15、1∶20；菌种活化液添加量：1.0%、1.5%、2.0%、2.5%、3.0%；发酵温度：26℃、28℃、30℃、32℃、34℃；发酵时间：1d、2d、3d、4d、5d、6d、7 d、8 d、9 d、10 d、11 d，对铁皮石斛发酵酒的总酸、酒精度和感官评分的影响。
1.3.3 铁皮石斛发酵酒工艺优化正交试验设计
在单因素试验的基础上，设计正交试验对铁皮石斛发酵酒的品质进行综合评价，以确定最佳的发酵工艺。正交试验因素及水平见表1。
表1 铁皮石斛发酵酒发酵工艺优化正交试验因素与水平
Table1 Factors and levels of orthogonal experiments for fermentation process optimization of fermentedDendrobium candidumwine
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1.3.4 测定方法
酒精度[17]：按GB 5009.225—2016《酒中乙醇浓度的测定》测定；总酸[18]：按照GB/T 15038—2006《葡萄酒、果酒通用分析方法》测定；可溶性固形物[19]：采用手持糖度计测试。
感官评价标准：随机选择10名食品专业人员，从铁皮石斛发酵酒产品的色泽、香气、口感、组织状态4个指标进行评定，满分100分，感官评分结果取平均值，评价标准见表2。
表2 铁皮石斛发酵酒的感官评分标准
Table2 Sensory evaluation standards of fermentedDendrobium candidumwine
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续表
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2 结果与分析
2.1 铁皮石斛发酵酒工艺优化单因素试验
2.1.1 菌种配比对产品品质的影响
图1 菌种配比对铁皮石斛发酵酒感官评分的影响
Fig.1 Effect of strains ratio on sensory evaluation of fermentedDendrobium candidumwine
由图1可知，随着芽孢杆菌活化液与酿酒酵母菌活化液配比的变化，铁皮石斛发酵酒的感官评分则呈现先上升后下降的趋势，当菌种配比（芽孢杆菌活化液∶酿酒酵母菌活化液为1∶10（V/V））时，感官评分最高，为90.4分。
两种菌的发酵产物不同，发挥的作用不同，其产物可能互相影响，且对铁皮石斛发酵酒的风味的影响也不同[20]。当芽孢杆菌的比例过大时，铁皮石斛发酵酒中的总酸含量高，风味过酸，口感粗糙且略刺激，因此，感官评分较低；而当酿酒酵母菌的比例过大时，铁皮石斛发酵酒的色泽偏黄较深，酸度不足，酒味偏重，口感不柔和，因此，感官评分也有所降低。芽孢杆菌活化液∶酿酒酵母菌活化液的比例为1∶10（V/V）时，铁皮石斛发酵酒的口感良好，酒体呈浅红色，酒精度适宜，感官评分最高。因此，确定芽孢杆菌和酿酒酵母菌的比例为1∶10（V/V）。
2.1.2 菌种活化液添加量对产品品质的影响
由图2可知，随着菌种活化液添加量不断增加，铁皮石斛发酵酒的感官评分呈先上升后趋于平稳的趋势。当菌种活化液添加量为1.0%，铁皮石斛发酵酒的总酸和酒精度均稍显不足，口感粗糙，色泽不佳，因此，感官评分较差；菌种活化液添加量为1.5%时，铁皮石斛发酵酒酸度不足，整体口感偏苦涩；菌种活化液添加量为2.0%时，甜酸适度，酒味适宜，因此，感官评分较佳，为90.2分。而继续增大菌种活化液的添加量，其风味差异不显著。
图2 菌种活化液添加量对铁皮石斛酒感官评分的影响
Fig.2 Effect of strain activation solution addition on sensory evaluation of fermentedDendrobium candidumwine
在一定程度上，菌种的增加，有利于发酵产物的增加，但当添加量超过一定量的时候，发酵产物的累积可能趋于稳定，甚至减少。这是因为当添加量过多时，导致微生物繁殖过快，反而造成营养物质的缺乏，影响其生长发酵[21]。而且过快的产生过多的酸性物质或酒精，也会抑制菌种自身的生长和繁殖，对发酵同样不利。不断的增加菌种活化液的添加量也会增大在实际生产中的生产成本。因此，综合考虑，确定最佳菌种活化液添加量为2.0%。
2.1.3 发酵温度对产品品质的影响
图3 发酵温度对铁皮石斛酒感官评分的影响
Fig.3 Effect of fermentation temperature on sensory evaluation of fermentedDendrobium candidumwine
由图3可知，随着发酵温度的升高，铁皮石斛酒的感官评分呈现先上升后下降的趋势，当发酵温度为30℃时，感官评分最高，为91.2分。
当发酵温度低于30℃时，铁皮石斛发酵酒的酸度和酒精度都稍显不足，口感过甜，因此感官评分偏低；发酵温度高于30℃时，口感偏酸且略刺激，产品风味也较差。两种菌的最适温度存在差异，所以对于不同温度环境的适应程度不同，生长繁殖和代谢的速度不同，温度可能是影响铁皮石斛发酵酒的品质的重要因素之一。因此，综合感官品质考虑，确定最佳发酵温度为30℃。
2.1.4 发酵时间对产品品质的影响
图4 发酵时间对铁皮石斛酒感官评分的影响
Fig.4 Effect of fermentation time on sensory evaluation of fermentedDendrobium candidumwine
由图4可知，随着发酵时间的延长，铁皮石斛发酵酒的感官评分呈现先上升后下降的趋势，当发酵时间为7 d时，感官评分最高，为90.5分。这是由于前期铁皮石斛发酵酒仍处于酸度和酒精度不断增加的过程，因此整体呈现风味不足，酸甜比失调，口感较差，而随着发酵时间的延长，酸度和酒精度不断增加，产品的香气较为浓郁，色泽浅红，酸味适中，酒味适宜，感官品分最佳，而其后延长发酵时间，产品的组织状态较差，因此，感官稍有下降。结合生产成本的因素综合考虑，确定最佳的发酵时间为7 d。
2.2 铁皮石斛发酵酒工艺优化正交试验
由单因素试验结果可知，菌种活化液添加量对铁皮石斛酒的感官评分影响相对较小，而且当添加量达到2%时，其后增大菌种活化液添加量，铁皮石斛发酵酒的感官评分变化不明显，因此，选定菌种活化液添加量为2%。选取菌种配比（芽孢杆菌：酿酒酵母菌）（A）、发酵温度（B）、发酵时间（C）3个因素进行L9（34）正交试验，结果见表3，方差分析见表4。
由表3可知，3个因素对铁皮石斛发酵酒感官评分影响的主次顺序为A＞B＞C，即菌种配比的影响最大，其次是发酵温度，影响最小的为发酵时间。最优组合为A2B2C2，即选用菌种配比为芽孢杆菌∶酿酒酵母菌为1∶10（V/V），发酵温度为30℃，发酵时间为7 d，此时铁皮石斛发酵酒的感官评分最高。
由表4可知，对于感官评分而言，仅有菌种配比对感官评分的影响显著（P＜0.05），而发酵温度和发酵时间的影响均不显著。
表3 铁皮石斛发酵酒发酵工艺优化正交试验结果与分析
Table3 Results and analysis of orthogonal experiments for fermentedDendrobium candidumwine fermentation process optimization
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表4 正交试验方差分析
Table4 Variance analysis of orthogonal experiments
注：“*”表示影响显著（P＜0.05）。
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由于感官评分的最优组合A2B2C2未出现在正交试验组合中，因此，进行验证性试验，结果表明，A2B2C2组合处理下的铁皮石斛发酵酒的总酸为9.3 g/L，酒精度为5.13%vol，感官评分可达97.5分，优于正交试验表中各项处理组合，故A2B2C2为铁皮石斛发酵酒的最佳工艺，即芽孢杆菌∶酿酒酵母菌的比例为1∶10（V/V），发酵温度为30 ℃、发酵时间为7 d，按照此工艺条件生产的铁皮石斛发酵酒口感酸味纯正、酒度适宜、入口柔和；色泽呈现均匀的浅红色，澄清透明、无杂质；具有铁皮石斛和发酵特有的风味，香气协调柔和宜人；组织状态无分层，均匀一致，可溶性固形物含量为8%。
3 结论
通过单因素试验与正交试验优化铁皮石斛发酵酒的发酵工艺条件为产乳酸芽孢杆菌∶酿酒酵母菌=1∶10（V/V），菌种活化液添加量2%，发酵温度30℃，发酵时间7 d，此条件下发酵所得的铁皮石斛发酵酒色泽均匀，呈浅红色，酸度适宜，酒精度适宜，口感入口柔和，无分层无杂质，具有铁皮石斛发酵后特有的风味，感官评分为97.5分，总酸含量9.3 g/L，酒精度5.13%vol。
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