茶叶是世界三大饮料之一，而我国是世界茶叶产量第一大国，茶叶出口第二大国[1]，为了提高茶叶产量，农药在茶叶病虫防治中得到了广泛使用，但由于使用过程中存在滥用、误用等现象，时常有残留农药检出或超标的情况发生[2]。气相色谱-质谱联用（gas chromatography-mass spectrometry，GC-MS）法结合了气相色谱的高分辨率和质谱的高灵敏度的特点，能同时进行定性、定量检测分析，主要适用于分析沸点较低、热稳定性好且分子质量较小的化合物[3]。近年来已有大量文献报道气相色谱-质谱联用法检测茶叶中农药多残留的分析研究，如苏建峰等[4]采用气相色谱-质谱法检测茶叶及茶叶加工品中295种农药多残留；荣杰峰等[5]采用羟基化多管壁碳纳米管分散固相萃取-气相色谱-质谱法测定茶叶中21种有机磷农药；在茶叶农药多残留检测中建立快速、准确的检测方法，对正确合理使用农药、提升茶叶品质具有重大意义。本实验建立气相色谱-质谱联用法测定茶叶中21种农药残留，以期满足日常的茶叶农药残留检测。
1 材料与方法
1.1 材料与试剂
乙腈、正己烷（均为色谱纯）：德国Merck公司；丙酮、甲苯（均为色谱纯）：美国Tedia试剂公司；氯化钠、无水硫酸镁（分析纯）：国药集团化学有限公司；Cleanert TPT固相萃取柱：美国Agela公司。
21种农药标准物质（100 μg/mL，1.2 mL）：中国计量院；水城春茶叶：水城县茶叶发展有限公司。
1.2 仪器与设备
GCMS-TQ8050气相色谱-质谱联用仪（配AOC-20i+s自动进样器）、AUX220分析天平：日本岛津公司；Talboys数显型多管式旋涡混合器：美国Troemner公司；3-18K台式高速冷冻离心机：德国Sigma公司；HG200均质机：普利赛斯国际贸易（上海）有限公司；Hei-VAP旋转蒸发仪：德国Heidolph公司；HSE-12B固相萃取仪：天津市恒奥科技发展有限公司；TWS-12电热恒温水浴锅：上海喆图科学仪器有限公司；MM400混合研磨仪：德国ReTsch莱驰公司。
1.3 方法
1.3.1 标准曲线的绘制
分别取单个农药标准液（100 μg/mL，1.2 mL）各1 mL于3个10 mL容量瓶中，用丙酮稀释至刻度，即得质量浓度为10 μg/mL混合农药标准储备液，放于冰箱中冷藏，有效期为3个月。
分别移取标准储备液50 μL、100 μL、200 μL、500 μL、1 000 μL于10 mL容量瓶中，并用丙酮定容至刻度，即得质量浓度为0.05μg/mL、0.10μg/mL、0.20μg/mL、0.50μg/mL、1.00 μg/mL的标准工作液。以质量浓度（x）为横坐标，定量离子对的峰面积（y）为纵坐标进行线性回归，得到各组分线性方程及相关系数。
1.3.2 样品前处理
称取5 g试样（精确至0.000 1 g），于50 mL离心管中，加入15 mL乙腈，分别以回流法、超声法、旋涡振荡法提取，提取液以5 000 r/min离心5 min，取上清液于250 mL茄型瓶中。残渣再次用15 mL乙腈重复提取一次，离心，合并提取液，40℃水浴旋转蒸发浓缩至1 mL，待净化。
在CleanertTPT固相萃取柱中加入约2cm无水硫酸钠，用10 mL乙腈-甲苯（3+1，体积比）预洗Cleanert TPT固相萃取柱，弃去流出液，放入固定架上。将上述样品浓缩液转移至Cleanert TPT固相萃取柱中，用2 mL乙腈-甲苯洗涤样品瓶，并将洗涤液移入柱中，重复3次，再用25 mL乙腈-甲苯洗涤小柱，收集上述所有流出溶液于茄型瓶中，40℃水浴旋转蒸发至0.5mL左右，加入5mL正己烷进行溶剂交换，重复上述操作两次，最终的样品液体积约为1 mL，用于气相色谱-质谱联用仪测定。
1.3.3 气相色谱-质谱条件
色谱柱：DB-5MS毛细管柱（30 m×0.25 mm×0.25 μm）；升温程序：初始温度60℃，保持1 min，以25℃/min的速率升温至160℃，再以5℃/min的速率升温至250℃，最后以10℃/min的速率升温至300℃，保持10min；载气为氦气（He）（纯度≥99.999%），流速1.2 mL/min；进样口温度290℃；进样量1.0 μL；进样方式：不分流进样。电离方式为电子电离（electronic ionization，EI）源；电子能量70 eV；离子源温度230℃；GC-MS接口温度280℃；驻留时间2.5 min；溶剂延迟时间3 min；质谱多反应监测（multiple reaction monitoring，MRM），参数见表1。
表1 21种农药组分CAS号、MRM参数
Table1 CAS No.and MRM parameters for 21 kinds of pesticides
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续表
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1.3.4 回收率[6-7]
采用加标回收率对提取方法、提取溶剂、样品浓缩方法进行评价，其计算公式：
式中：X为回收率，%；As为各农药添加到样品中所测得实际含量，mg/kg；Ap为空白样品中各农药的含量，mg/kg；Aa为各农药的标准添加量，mg/kg。
2 结果与分析
2.1 21种农药混标溶液总离子流色谱图及线性回归方程
21种农药混标溶液总离子流色谱图（total ions chromatogram，TIC）如图1所示；保留时间和线性回归方程及相关系数R2见表2。
图1 21种混合农药标品GC-MS分析总离子流色谱图
Fig.1 Total ion chromatogram of the 21 kinds of pesticides mixture standards analysis by GC-MS
表2 21种农药标品的保留时间、线性回归方程及相关系数
Table2 Retention time,linear regression equation and correlation coefficient of 21 kinds of pesticides standards
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由表2可知，在确定色谱柱及仪器分析条件下，21种农药标准品在0.05～1.00 μg/mL质量浓度范围内线性关系良好，相关系数（R2）均＞0.998。
2.2 提取方法的考察
超声提取是利用超声波的机械效应和空化效应使其样品细胞破裂[8-12]，从而使提取物溶于溶剂达到提取目的；旋涡振荡提取是利用旋涡混合器剧烈振荡，加速提取物溶于溶剂；回流浸提是利用溶质通过细胞壁的渗透作用，从而完成提取。在相同时间内采取不同的提取方法提取，各农药回收率如表3所示。由表3可知，超声提取回收率在3种提取方法中最高，其次是旋涡振荡提取，回流法提取回收率最低，因此，选超声提取为宜。
表3 不同提取方法对回收率的影响
Table3 Effect of different extraction methods on recovery rate
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2.3 提取溶剂的考察
茶叶中农药检测常用的提取溶剂有乙腈、正己烷-丙酮混合溶剂、乙酸乙酯等，不同溶剂对农药残留的提取效率有一定影响[13-14]。本研究采用超声提取方法及等剂量的提取溶剂，对比乙腈、正己烷-丙酮（1∶1，V/V）混合溶剂、乙酸乙酯这3种溶剂的提取效果，得到了不同提取溶剂与相应农药的回收率如表4所示。由表4可知，乙腈与正己烷-丙酮（1∶1，V/V）混合溶剂提取效果相当，乙酸乙酯次之，平均回收率分别是89.24%、90.05%、86.81%，但因乙腈浓缩速度慢、毒性高，故正己烷-丙酮（1∶1，V/V）混合溶剂为优选提取溶剂。
表4 不同提取溶剂对回收率的影响
Table4 Effect of different extraction solvents on recovery rate
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2.4 样品浓缩方式的考察
样品浓缩方式不同对农药的测定有较大影响[15-17]。本试验分别考察水浴蒸发浓缩、旋转蒸发浓缩、氮吹浓缩等对茶叶回收率的影响，如表5所示。由表5可知，3种不同浓缩方式得到的平均回收率分别是80.62%、82.81%、88.19%，氮吹浓缩得到的平均回收率最高，旋转蒸发浓缩次之，水浴蒸发浓缩最低。水浴蒸发浓缩因温度过高可能导致农药发生降解，故回收率在3种浓缩方式中最低；旋转蒸发浓缩可能因浓缩过程中提取液与浓缩瓶壁接触面积过大，一部分农药附着在瓶壁上而未被最终的溶剂冲洗下来，从而导致回收率相对较低。故选择氮吹浓缩为宜。
表5 不同浓缩方法对回收率的影响
Table5 Effect of different concentration methods on recovery rate
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2.5 茶叶中21种农药残留检出限、精密度和回收率试验
以空白基质产生3倍信噪比（signal-to-noise ratio，S/N）计算检出限[18-22]，用mg/kg表示。分别向空白茶叶基质中添加1 mL 0.25 μg/mL、1.00 μg/mL及2.00 μg/mL的21种农药混合标准溶液，使其样品中分别含有0.05、0.20和0.40 mg/kg的3个水平，每个水平重复测定6次，检出限、回收率和精密度测定结果见表6。由表6可知，茶叶样品中21种农药残留的检出限为0.002 7～0.021 7 mg/kg，平均回收率为83.46%～92.13%，相对标准偏差（relative standard deviation，RSD）为4.88%～8.51%。
表6 茶叶中21种有机农药检出限、回收率和精密度试验
Table6 Detection limits,recovery rates and precision of 21 kinds of organic pesticides in tea
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续表
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2.6 实际样品的检测
选水城春茶叶作为检测样品，按照所建立检测方法对其进行21种农药测定，检测结果见表7。由表7可知，水城春茶叶中检出5种农药，分别是速灭磷0.023 mg/kg、甲胺磷0.043 mg/kg、毒死蜱0.038 mg/kg、喹硫磷0.013 mg/kg、哒螨灵0.021 mg/kg。
表7 实际茶叶样品的检测结果
Table7 Determination results of tea samples
注：N.D表示未检出。
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3 结论
通过对茶叶提取方法、提取溶剂、浓缩方式步骤的优化，建立了一种高效、简单的测定茶叶中21种农药残留检测方法。该方法选用正己烷-丙酮（1∶1，V/V）混合溶剂进行超声提取，提取液用氮吹仪进行浓缩至1～2 mL过Cleanert TPT固相萃取柱净化，用乙腈-甲苯（3∶1，V/V）洗脱，浓缩至1 mL进行GC-MS分析。该方法的平均回收率为83.46%～92.13%，RSD为4.88%～8.51%，检出限为0.002 7～0.021 7 mg/kg。与其他农药残留检测方法比，具有提取效率高、溶剂用量少、操作简单等优点，在实际茶叶农药残留检测中得到了广泛应用，能满足日常的茶叶农药残留检测。
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