红曲霉（Monascus）是三囊菌目的曲霉科红曲霉属腐生真菌，在我国已有上千年的应用历史[1]。红曲米是以大米为原料，使用红曲霉发酵生产而来的红色米粒，又被称为红曲、赤曲、红米。近些年来，人们发现红曲产品对高血压、高血脂具有良好的治疗效果。红曲在发酵过程中能产生多种代谢产物，其中莫那可林K（Monacolin K）是主要的降脂因子[2]。莫那可林K对胆固醇的合成具有抑制作用，这是由于莫那可林K的结构与3-羟基-3-甲基戊二酸单酰辅酶A还原酶的结构相似，对3-羟基-3-甲基戊二酸单酰辅酶A还原酶具有了竞争性抑制作用，从而能抑制胆固醇的合成[3]，且并无明显毒副作用[4]。
目前我国生产的红曲米中莫那可林K的含量一般为8 mg/g左右，因此使用高产莫那可林K菌株，先通过单因素试验确定了7个红曲霉发酵的影响因素的大致范围，进而通过正交试验确定红曲米发酵的最佳条件，以提高红曲米中莫那可林K的产量。
1 材料与方法
1.1 材料与试剂
红曲霉（红色红曲种）K10403：山东中惠生物科技股份有限公司；莫那可林标准品：美国Sigma公司；大米、麸皮、马铃薯、豆粕：市售；蛋白胨、葡萄糖、玉米浆、麦芽糖、丙三醇、可溶性淀粉、蔗糖、硝酸钠、硝酸铵、酵母粉、乳酸、氢氧化钠、琼脂：北京奥博星科技有限公司。所用试剂均为分析纯或生化试剂。
斜面培养基[5]：马铃薯20%，葡萄糖2%，琼脂1.5%，121℃灭菌20 min。
种子培养基：蛋白胨0.4%，大米粉4%，豆粕1%，硝酸钠0.3%，丙三醇3%，pH 4.4，121℃灭菌20 min。
固态发酵培养基：大米50%，麸皮5%，甘油3.5%，蛋白胨1.5%，初始含水量40%，pH5，121℃灭菌20 min。
1.2 仪器与设备
HNY-2102C恒温培养振荡器：天津欧诺仪器股份有限公司；TDL-40B离心机：上海安亭科学仪器厂；KS-080数显式超声清洗仪：洁康洗净电器有限公司；LC-15C高效液相色谱：日本岛津有限公司；SW-CJ-2G超净工作台：苏州净化设备有限公司；SHB-III循环水式多用真空泵：郑州长城科工贸有限公司；BSY-200T高速粉碎机：溪岸五金药具厂；YXQ-LS-50SII立式压力蒸汽灭菌器：上海博讯实业有限公司医疗设备厂。
1.3 方法
1.3.1 红曲霉发酵生产莫那可林K工艺流程及操作要点
将红曲霉的孢子从斜面上刮下至于无菌水中，制备孢子悬浮液，并稀释至5.7×103个/mL。将15%孢子悬浮液接种到200mL种子培养基上[6]。将种子液在30℃条件下160 r/min摇床培养36h。将三角瓶中的种子液按照一定的接种量接种到装有固体发酵培养基的500mL培养容器中，低温发酵3d，高温发酵15d。将发酵18d的红曲米置于50℃烘箱中烘干。
1.3.2 种子液条件的优化
菌种的生长曲线及种龄的确定：配制种子培养基，30℃恒温培养，定时取样测定干质量，确定种子液中菌体的生长状况。
1.3.3 单因素试验
发酵温度对莫那可林K产量的影响：用固体发酵培养基进行摇瓶发酵，分别选择恒温发酵（恒温26℃、28℃、30℃、32℃）18 d和变温发酵（前3 d 30℃、后15 d 26℃）[7]。测定红曲米中莫那可林K的含量，考察不同温度对莫那可林K产量的影响。
发酵时间对莫纳可林K产量的影响：用固体发酵培养基进行摇瓶发酵，每24 h取样一次，测定红曲米中莫那可林K的含量，考察发酵时间对莫那可林K产量的影响。
初始含水量的影响：在保持其他因素不变的前提下，分别考察固体发酵培养的含水量20%、30%、40%、50%、60%对莫那可林K产量的影响。
不同碳源及其含量的影响：分别以3.5%的葡萄糖[8]、麦芽糖[9]、蔗糖[10]、可溶性淀粉[11]替代初始培养基中的甘油，以初始培养基作为对照；分别向固体发酵培养基中添加2.0%、2.5%、3.0%、3.5%、4.0%的葡萄糖，以初始培养基作为对照，考察发酵培养基碳源种类及其含量对莫那可林K产量的影响。
不同氮源及其含量的影响：分别以1.5%的玉米浆[12]、酵母粉[13]、硝酸铵、硝酸钠[14]替代初始培养基中的蛋白胨，以初始培养基作为对照；分别向固体发酵培养基中添加0.5%、1.0%、1.5%、2.0%、2.5%的蛋白胨，以初始培养基作为对照，考察发酵培养基氮源种类及其含量对莫那可林K产量的影响。
不同初始pH值的影响：使用乳酸[15]调节固体发酵培养基初始pH值分别为4、5、6、7、8、9，考察发酵培养基初始pH值对莫那可林K产量的影响。
麸皮添加量的影响：在保持其他因素不变的前提下，分别考察固体发酵培养基麸皮含量2.5%、5.0%、7.5%、10.0%、12.5%对莫那可林K产量的影响[16]。
1.3.4 正交试验优化红曲霉产莫那可林K
根据单因素试验试验结果，以莫那可林K产量为评价指标，选取培养基初始pH值（A）、初始含水量（B）、葡萄糖含量（C）、蛋白胨含量（D）4个因素进行L（934）的正交试验，因素及水平见表1。
表1 红曲霉产莫那可林K条件优化正交试验因素与水平
Table1 Factors and levels of orthogonal experiments for Monacolin K production byMonascus
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1.3.5 莫那可林K含量的测定方法
样品处理：将红曲米粉碎过40目筛，称取400～600 mg样品至50 mL容量瓶中，用体积分数75%的乙醇定容提取，将提取物过0.45 μm滤膜后采用高效液相色谱对提取的莫那可林K的含量进行测定。
色谱条件：KromasilC18色谱柱（250mm×4.6mm，5μm）；流动相为甲醇∶水∶磷酸=385∶115∶0.14（V/V）；柱温20～25 ℃；进样量20 μL；流量1 mL/min；紫外检测波长238 nm[17]。
莫那可林K含量的计算公式如下：
式中：X为莫那可林K的含量，mg/g；h1、h2为样品中莫纳可林K的峰面积；c为莫那可林标准液的质量浓度，μg/mL；50为定容体积，mL；h3为莫那可林标准品的峰面积；m为样品称取质量，g。
2 结果与分析
2.1 种子液培养时间的选择
图1 种子生长曲线
Fig.1 The growth curve of seeds
由图1可知，培养36 h时为菌体的对数生长期，是接种的最佳时期。培养时间过短，菌种量少、生长缓慢；培养时间过长，菌种衰老，不利于莫那可林K的生产。因此选择培养时间为36 h。
2.2 单因素试验结果分析
2.2.1 发酵温度对莫那可林K产量的影响
温度是影响红曲霉的生长和莫纳可林K的产量，寻找适合红曲霉生长和代谢产物合成的温度至关重要[18]。由图2可知，变温发酵的红曲米中莫那可林K含量为10.48 mg/g，明显高于恒温培养的红曲米莫那可林K含量。因此选择变温发酵（前3 d 30℃、后15 d 26℃）。
图2 不同发酵温度对莫那可林K产量的影响
Fig.2 Effects of different fermentation temperatures on the yield of Monacolin K
2.2.2 发酵时间对莫那可林产量K的影响
由图3可知，发酵初期莫那可林K含量增长较慢，从第8天开始莫那可林K含量快速增长，第18天时发酵产物莫那可林含量最高，为10.68 mg/g，18 d以后莫那可林K含量开始降低。因此选择最佳发酵时间为18 d。
图3 不同发酵时间对莫那可林K产量的影响
Fig.3 Effects of different fermentation time on the yield of Monacolin K
2.2.3 初始含水量对莫那可林K产量的影响
由表2可知，当固体发酵培养基初始含水量过少时，不能为红曲霉的生长提供足够的水分；随着含水量的增加，莫那可林K含量也增加，初始含水量为40%时，莫那可林K含量最高，为8.24 mg/g；当含水量过高时，培养基中的游离水增加，不利于红曲霉对氧气的吸收，莫那可林产量随初始含水量的增加而降低[19]。因此选择固体发酵培养基的初始含水量为40%。
表2 不同初始含水量对Monacolin K含量的影响
Table2 Effects of different initial water content on the yield of Monacolin K
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2.2.4 不同碳源及其含量对莫那可林K产量的影响
由图4a可知，葡萄糖作为培养基碳源时，红曲米中莫那可林K含量高于其他碳源，总体上碳源结构越简单，对于红曲米中莫那可林K含量的提高效果越明显。这是由于红曲霉可以将多糖转化为可以利用的单糖[20]，但是在发酵初期菌种量少，淀粉酶的活力低，碳源无法满足红曲霉生长代谢的需要。由图4b可知，当葡萄糖添加量为3.0%时莫那可林K含量最高，为11.19 mg/g。因此选择培养基的碳源为3.0%葡萄糖。
图4 不同碳源（a）及葡萄糖添加量（b）对莫那可林产量的影响
Fig.4 Effects of different carbon sources(a)and addition of glucose(b)on the yield of Monacolin K
2.2.5 不同氮源及其含量对莫那可林K产量的影响
由图5a可知，蛋白胨作为培养基氮源时，红曲米中莫那可林K的产量最高。有机氮源作为附加氮源比无机氮源作为附加氮源对于莫那可林K的生产更加有利，可能是由于有机氮源中含有红曲霉所需的必需氨基酸[21]。由图5b可知，当蛋白胨的含量为1.5%时莫那可林K含量最高，为13.14 mg/g。因此选择培养基的氮源为1.5%蛋白胨。
图5 不同氮源（a）及蛋白胨添加量（b）对莫那可林产量的影响
Fig.5 Effects of different nitrogen sources(a)and addition of peptone(b)on the yield of Monacolin K
2.2.6 不同初始pH值对莫纳可林K产量的影响
由图6可知，红曲米中莫那可林K含量随初始pH值的升高呈先增加后加少的趋势，初始pH值为5时，红曲米中莫那可林K含量最高，为11.44 mg/g，当pH＞5时莫那可林K含量随pH值的升高而降低。酸性条件比碱性更适合红曲霉的生长和莫纳可林K的生产，红曲霉是一种嗜酸菌[22]。因此选择培养基的初始pH值为5。
图6 不同初始pH对莫那可林K产量的影响
Fig.6 Effects different initial pH values on the yield of Monacolin K
2.2.7 麸皮含量对莫纳可林产量K的影响
由图7可知，红曲米的莫那可林K含量随麸皮含量的增加呈先增加后减少的趋势，当麸皮含量为7.5%时莫那可林K的产量最高，为11.27 mg/g；当麸皮含量＞7.5%时莫那可林K含量随麸皮含量的升高而降低。在基础培养基里添加一定量的麸皮可以起到支撑培养基的作用，通过提高培养基通透性、减少培养基中的游离水以提高莫那可林K的产量。因此选择培养基的麸皮含量为7.5%。
图7 不同麸皮含量对莫那可林K产量的影响
Fig.7 Effects of different bran content on the yield of Monacolin K
2.3 正交试验结果分析
由表3可知，对红曲霉产莫那可林K的影响依次为B＞D＞C＞A，即初始含水量是影响固体发酵的最重要因素。最佳发酵条件组合为A2B3C1D2，即初始含水量50%、蛋白胨含量1.5%、葡萄糖含量2.5%、初始pH值5。在最佳条件下进行3组验证试验，红曲米中莫那可林含量为14.22 mg/g。
表3 红曲霉产莫那可林K条件优化正交试验结果与分析
Table3 Results and analysis of orthogonal experiments for Monacolin K yield byMonascus
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由表4可知，初始加水量对红曲米中莫那可林K的含量有显著影响（P＜0.05），其他因素不显著（P＞0.05）。
表4 正交试验结果方差分析
Table4 Variance analysis of orthogonal experiments results
注：“*”表示对结果影响显著（P＜0.05）。
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3 结论
在单因素试验的基础上，采用正交优化试验对红曲霉发酵条件进行优化，获得红曲霉的最佳培养培养基组成是大米38.5%、麸皮7.5%、蛋白胨1.5%、葡萄糖2.5%、初始含水量50%，最佳培养条件为初始pH 5、30℃培养3 d转入26℃培养15 d。在此优化条件下，发酵的红曲米中莫那可林K含量为14.05 mg/g。
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