石榴（Punica granatum）是石榴科植物石榴的果实，既是优质的无公害绿色食品，又是中医药、藏医药中常用的临床药物[1-2]，具有良好的“药食同源”之性。川产攀西地区会理石榴栽培历史悠久，名优质佳，药食资源道地。现代研究表明，石榴中不仅富含多酚类、黄酮类及有机酸类化合物，还富含多种生物碱成分及类雌激素样成分等[3]，保健开发潜力巨大[4]。目前，市面上关于石榴的加工产品主要有石榴果汁[5-7]、石榴酒[8-9]、石榴茶[10-11]和石榴籽油[12-14]等，而有关石榴果醋鲜有深入研究的报道。早在20世纪90年代，果醋就畅销于欧美等发达国家。近年来，随着深层发酵技术的进步和世界大趋势对绿色健康功能性食品的认同，保健果醋的开发已成为全球醋研究的热点。现阶段我国更多的石榴果醋仍处于实验室试验研究阶段，研究方向集中于生产工艺的优化，对成品运用于生物药理活性研究的较少。因此，该研究为进一步促进特色保健食药资源的开发与产业化发展，以川产药食资源石榴为主要原料制备保健石榴果醋，在单因素试验基础上，运用响应面法对石榴保健果醋的发酵工艺条件进行优化研究，并采用四氧嘧啶复合高脂高糖乳液建立小鼠糖脂代谢紊乱模型探讨其降糖降脂作用，以期为石榴保健产品的进一步开发提供科学依据。
1 材料与方法
1.1 材料与试剂
1.1.1材料与菌种
青皮软籽石榴：采摘于四川省凉山彝族自治州会理县。安琪葡萄酒、果酒专用酵母RW：安琪酵母股份有限公司；巴氏醋杆菌（Acetobacter pasteurianus）SICC1.4：四川省微生物资源平台菌种保藏中心。
美国癌症研究所（institute ofcancer research，ICR）小鼠[无特定病原体（specific pathogenfree，SPF）级，18～22g，全雄，动物生产许可证号：SCXK（川）2015-030]：四川省医学科学院实验动物研究所。
1.1.2 化学试剂
盐酸二甲双胍片（规格0.25 g/片）：北京中惠药业有限公司；四氧嘧啶（分析纯）：美国Amresco公司；血糖测定试剂盒、总胆固醇（total cholesterol，TC）测定试剂盒和甘油三酯（triglyceride，TG）测定试剂盒：南京建成生物工程研究所生产；小鼠胰岛素酶联免疫分析测定试剂盒：美国RD公司；氢氧化钠、亚硫酸氢钠、碳酸钙、碳酸氢钠、葡萄糖（均为分析纯）：成都科龙化工试剂有限公司；果胶酶（40 000 U/g）：宁夏和氏璧生物技术有限公司。
1.1.3 培养基
醋酸菌液体培养基：酵母膏0.5%，葡萄糖1%，碳酸钙2%，乙醇2%（灭菌后加入）。在121℃、0.1 MPa条件下灭菌20 min。
1.2 仪器与设备
ZWY-240恒温培养振荡器：上海智城分析仪器制造有限公司；SW-CJ-1F洁净工作台：苏净安泰空气技术有限公司；PHS-3C-3E数显台式酸度计：上海雷磁仪器有限公司；酒精浓度计：河北武强仪表厂。
1.3 方法
1.3.1 石榴保健果醋加工工艺流程及操作要点
果实的拣选、清洗：挑选果皮鲜红柔软度适中，体积大果皮薄，无腐烂霉变、病虫的新鲜石榴果实，用清水轻缓清洗3～4次。
去皮、榨汁、过滤：将清洗干净的石榴果实去皮后的果粒进行榨汁，出汁率达48%左右加30 mg/L亚硫酸氢钠进行护色，待榨汁完全，用120目的滤布过滤果汁中残留的石榴籽、皮等物质。
酶解、成分调整：在石榴果汁中加入果胶酶0.09 g/L，40℃的条件下酶解2 h，所得果汁较澄清透明[15]。加入10%碳酸氢钠或10%柠檬酸调节果汁pH为4.0。调整糖度至20%，70℃恒温灭菌30 min。
活化酵母菌[16]：将5 g安琪酵母置于50 mL的5%的蔗糖溶液中，摇匀，置于30℃的恒温培养箱中活化30 min，直到蔗糖溶液中出现大量微小气泡为止。
酒精发酵：将活化完成的酵母接种至酶解后的石榴果汁中，摇匀后分罐装瓶，放入29℃恒温培养箱中进行酒精发酵，发酵5 d，直至瓶中完全不再产生气泡为止。
醋酸发酵：取制备好的石榴果酒（酒精度10.6%vol），每瓶装液量50 mL/250 mL，调节酒精度3%vol～11%vol，添加活化醋酸菌，而后使用纱布封口并放入摇床振荡器中，调节实验温度进行有氧醋酸发酵[17]，直至不再产酸为止，获得石榴果醋液。
澄清、陈酿：用2%壳聚糖溶液澄清石榴果醋液。将澄清后的石榴果醋液密封放在避光阴凉的地方陈酿1个月。
过滤、杀菌：用200目滤布过滤。在75℃条件下杀菌5min。
1.3.2 石榴保健果醋醋酸发酵工艺优化单因素试验
分别选取初始酒精度（3%vol、5%vol、7%vol、9%vol、11%vol），接入（4%、6%、8%、10%、12%、14%、16%）的醋酸菌种，于发酵温度（23℃、25℃、27℃、29℃、31℃、33℃）、转速150 r/min的条件下进行醋酸发酵（2 d、4 d、6 d、8 d、10 d），探讨不同初始酒精度、接种量、发酵温度及发酵时间条件下总酸含量变化。
1.3.3 石榴保健果醋醋酸发酵工艺优化响应面试验设计[18-20]
以发酵液总酸含量（Y）为响应值，在单因素试验基础上，进行4因素3水平的响应面分析试验，试验因素与水平见表1。
表1 响应面试验因素与水平
Table1 Factors and levels of response surface tests
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1.3.4 分析检测
酒精度的测定采用酒精度比重法；总酸（以醋酸计）的测定采用电位滴定法。
1.3.5 石榴保健果醋的降糖降脂活性研究
取ICR小鼠，参照文献方法建立小鼠高糖、高脂复合模型[21]，即小鼠尾静脉注射四氧嘧啶溶液60 mg/kg造成血糖升高后（即空腹血糖≥11.0 mmol/L），同时每日灌胃给予高脂高糖乳液（猪油20%、胆固醇10%、猪胆酸钠0.5%、蔗糖20%）0.2 mL/只，连续14 d。试验期间按设计剂量和分组同步灌胃给药，每日1次。各组小鼠末次给药后1 h（禁食不禁水8h），眼眶取血并分离血清，按试剂盒说明书分别测定小鼠空腹血糖（fastingblood-glucose，FBG）、胰岛素（insulin，Ins）、胆固醇（TC）和甘油三酯（TG）的含量，并按如下公式计算胰岛素敏感指数（insulin sensitivity index，ISI）。
ISI=1（/FBG×Ins）
2 结果与分析
2.1 醋酸发酵工艺优化单因素试验
2.1.1 初始酒精度对醋酸发酵的影响
图1 初始酒精度对总酸含量的影响
Fig.1 Effect of initial alcohol content on total acid contents
由图1可知，随着酒精度在3%vol～9%vol范围内的增加，醋酸菌的营养物质增多，醋酸菌繁殖迅速，发酵液总酸含量也呈上升趋势；当初始酒精度达9%vol时，发酵液的总酸含量可达到最大值，为4.62 g/100 mL；而当初始酒精度＞9%vol之后，酒精浓度对醋酸菌的生长繁殖产生抑制作用，发酵液总酸含量呈下降趋势。因此，确定最适初始酒精度为9%vol。
2.1.2 发酵温度对醋酸发酵的影响
图2 发酵温度对总酸含量的影响
Fig.2 Effect of fermentation temperature on total acid contents
由图2可知，随着发酵温度在23～29℃范围内的增高，果醋发酵液中的总酸含量呈上升的趋势；发酵温度为29℃时，发酵液总酸含量可达最大值，为4.71 g/100 mL；当发酵温度高于29℃之后，发酵的温度过高，醋酸菌就会提前老化，导致发酵停止，发酵液的总酸含量逐渐呈下降趋势。因此，确定29℃为最适发酵温度。
2.1.3 发酵时间对醋酸发酵的影响
由图3可知，随着发酵时间在2～8 d范围内增加，发酵液的总酸含量不断增加；在发酵时间为8 d时，总酸含量可达最大值，为4.67 g/100 mL；发酵时间＞8 d之后，醋酸菌在乙醇底物基本耗尽的情况下，发生了过氧化反应，继续氧化醋酸生成二氧化碳和水，导致溶液中的总酸含量不断下降，溶液总酸含量开始逐渐下降。因此，确定8 d为最适发酵时间。
图3 发酵时间对总酸含量的影响
Fig.3 Effect of fermentation time on total acid contents
2.1.4 接种量对醋酸发酵的影响
由图4可知，随着醋酸菌的接种量在4%～10%范围内增加，发酵体系的总酸含量也随之增高；当醋酸菌的接种量达10%时，发酵液总酸含量可达最高，为4.70g/100mL；而当接种量＞10%之后，由于过高的接菌量使得单位面积内的醋酸菌过多，会发生菌体自溶、早衰、代谢废物过多等现象；并且由于营养物质的消耗量的增加，可导致后期营养物质的不足，导致溶液的总酸含量有明显的下降。因此，确定10%为最佳接种量。
图4 接种量对总酸含量的影响
Fig.4 Effect of inoculum on total acid contents
2.2 醋酸发酵工艺响应面法优化
基于单因素试验的结果，以初始酒精度（A）、发酵温度（B）、发酵时间（C）及接种量（D）为影响因素，以发酵液总酸含量（Y）为响应值，进行响应面试验分析，结果与分析见表2，方差分析结果见表3。
通过Design-Expert 10.08软件对表2进行回归拟合分析[22]，得到总酸含量对多个影响因素之间的回归方程：
表2 响应面试验设计结果与分析
Table2 Results and analysis of response surface tests design
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由表3可知，回归模型P＜0.000 1，回归模型方程极显著，失拟项P=0.108 8＞0.05，不显著，表明该方程合理可行，且决定系数R2=0.953 4，校正决定系数
0.906 8，表明这个回归模型可以解释90.68%的响应值的变化，回归方程对试验的拟合性比较好，所以用此模型和方程来寻求醋酸发酵的最适条件是可行的。一次项B、C、D，二次项A2、B2、C2、D2的P值均＜0.01，均对结果影响极显著。
表3 回归模型的方差分析
Table3 Variance analysis of regression model
注：“*”表示对结果影响显著（P＜0.05）；“**”表示对结果影响极显著（P＜0.01）。
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接种量、初始酒精度和发酵时间及发酵温度各因素两两交互对石榴果醋发酵的影响结果见图5。由图5可知，响应曲线陡峭，等高线呈椭圆，说明二者交互作用对发酵液总酸含量的影响越显著。
图5 初始酒精度、发酵温度、发酵时间及接种量交互作用对总酸含量影响的响应面
Fig.5 Response surface plots and contour line of the effects of interaction between initial alcohol content,fermentation temperature,time and inoculum on total acid contents
通过软件Design-Expert 10.08软件分析得到石榴保健醋醋酸发酵工艺的最佳条件为初始酒精度9.025%vol、发酵温度29.030℃、发酵时间8.173 d，接种量10.113%，总酸含量预测可达最大值4.807 g/100 mL。结合试验实际操作的可行性，将上述最优化条件简化为初始酒精度9%vol、发酵温度29℃、发酵时间8 d，接种量10%。以响应面分析得到的最佳结果进行重复试验3次，测得石榴果醋发酵液总酸含量平均值为4.732 g/100 mL，与预测值接近，表明通过响应面分析法得到的优化条件结果可靠。
2.3 石榴保健果醋的降糖降脂活性
表4 石榴果醋对小鼠糖脂代谢水平及胰岛素抵抗指数的影响
Table4 Effect of pomegranate fruit vinegar on the glucose and lipid metabolism levels and insulin resistance index of mice
注：与模型组比较，“*”表示影响显著（P＜0.05），“**”表示影响极显著（P＜0.01）。
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由表4可知，与空白组比较，经小剂量注射四氧嘧啶和高脂高糖乳液喂养小鼠4周后，模型组小鼠血清空腹血糖（FBG）、胆固醇（TC）和甘油三酯（TG）的含量明显升高，胰岛素（Ins）的含量明显降低，小鼠胰岛素敏感指数（ISI）显著下降，表明小鼠糖脂代谢紊乱模型造模成功。与模型组相比较，石榴保健果醋能明显或部分降低小鼠血清空腹血糖（FBG）、TC和TG的含量，提高机体的ISI，但对血清Ins水平没有明显影响，显示出较好的改善胰岛素抵抗，改善糖脂代谢作用。
3 结论
本研究在单因素试验基础上，通过响应面分析的方法建立了回归模型，以总酸含量为响应值，初始酒精度、发酵温度、发酵时间、接种量为影响因素，得到的醋酸发酵的最佳工艺条件为初始酒精度9%vol、发酵温度29℃、发酵时间8 d，接种量10%。在此优化发酵条件下，石榴果醋总酸含量可达4.732 g/100 mL，发酵所得石榴果醋颜色鲜红，果醋香气浓郁，风味俱佳。同时，通过对小鼠高糖、高脂复合模型的建立，药效试验显示石榴保健果醋能明显或部分降低小鼠血清FBG、TC和TG的含量，升高ISI，提高机体对胰岛素的敏感性，显示出较好的改善糖脂代谢作用。通过本研究不仅提高了石榴的使用价值，也为石榴相关保健产品的进一步开发提供科学依据。
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