发酵酒精生产工业主要是以粮谷为主要原料（如玉米、高粱、薯类和糖蜜等[1]）。相比于其他粮食作物，利用玉米生产酒精有许多优点[2]：（1）玉米产量大，价格低廉；（2）玉米生产出的酒精品质高于其他粮食作物，对人体有害的副产物（如甲醇、异丁醇含量）较少；（3）玉米酒糟污染易于解决：玉米酒糟干燥后直接作为动物干饲料，蛋白含量丰富[3]。在中国，玉米酒精是优质食用酒精的重要来源。
氧化还原电位（oxidation-reduction potential，ORP）用来反映水溶液中所有物质表现出来的宏观氧化-还原性。氧化还原电位越高，氧化性越强；电位越低，氧化性越弱。电位为正表示溶液显示出一定的氧化性，为负则说明溶液显示出还原性[4-5]。
微生物的大多代谢由多种多样的氧化还原反应组成，氧化还原电位对微生物的生长繁殖及存活有很大影响，不同的微生物对生长环境的氧化还原电位有不同的要求[6]。近十年来，氧化还原电位控制发酵条件，增加目标产物的生成，减少副产物积累逐渐引起关注，已被应用于乙醇、丁二酸、琥珀酸、乳酸等发酵过程优化中[7-11]。但将ORP应用于乙醇发酵优化研究中，局限于酵母浸出粉胨葡萄糖（yeast extract peptone dextrose，YPD）培养基[7-8]；利用玉米酒精浓醪发酵的优化研究还鲜有报道。本试验利用玉米酒精浓醪作为培养基，进行乙醇发酵研究，探寻最优氧化还原电位条件，更接近酒精实际生产，为发酵酒精工业的过程控制提供新思路。
1 材料与方法
1.1 材料与试剂
1.1.1菌种
安琪超级酿酒高活性干酵母：安琪酵母股份有限公司。
1.1.2 试剂
玉米醪：[干玉米粉（淀粉含量60%～62%，水分含量12%），料液比1∶2（g∶mL），经糖化处理，总糖含量23 °Bx，初始pH=4.1]：资中县银山鸿展工业有限责任公司。
1.1.3 化学试剂
3,5-二硝基水杨酸（dinitrosalicylic acid，DNS）：厦门海标科技有限公司；甘油三酯试剂盒：南京建成生物工程研究所；0.1%次甲基蓝指示剂：上海展云化工有限公司；葡萄糖（生化试剂）：成都科隆化学品有限公司。试验所用其他化学试剂均为国产分析纯。
1.2 仪器与设备
BIOTECH-5BG离位灭菌玻璃发酵罐：上海保兴生物设备有限公司；SIN-PH160P ORP控制器：深圳联测仪表有限公司；T4805-60-P-PAORP电极：瑞士MettlerToledo公司；DH-30空气压缩机：惠州市德鸿空气压缩机有限公司；GSCC9SA-BB26流量控制器：瑞士Vögtlin设备公司；17805E Midisart 2000过滤器：德国Sartorius公司；QT08-LM79-J3酒精计：北京北信未来电子仪器有限公司；EX-ZNHW数显恒温型电热套：上海力辰邦西仪器科技有限公司；UV-2450紫外可见分光光度计：日本岛津公司；DK-8D数显恒温水浴锅：金坛市医疗仪器厂；JA1003分析天平：上海天平仪器厂。
1.3 方法
1.3.1 ORP控制策略
发酵罐装配温度电极、pH电极、ORP实时监测系统（包括ORP控制器和ORP电极）、循环冷却水系统、无菌空气进出系统和玻璃转子流量控制仪。通过发酵罐控制器将气体流量计和ORP实时监测系统相关联，控制通气量将ORP值控制在预设水平。在不控制的乙醇发酵过程中，ORP值最低能够降至-150 mV以下，因此将氧化还原电位值控制3个水平：-50 mV、-100 mV、-150 mV，以不控制氧化还原电位的发酵作为对照组。发酵初始阶段停止通气，当ORP值降到设定值以下时，控制器开启气泵以0.8 L/min的速度泵入空气，提升ORP直至设定值。
1.3.2 发酵方法
取4 g干酵母粉，置于40 mL的2%葡萄糖溶液中活化2 h，温度32℃。将活化液接种于装有4 L玉米醪的5 L发酵罐中，温度28℃，发酵时间为48 h。
1.3.3 分析方法
菌体数量：血球计数板法[12]。
细胞存活率：使用0.1%亚甲基蓝染色细胞，染色5 min，在显微镜下观测细胞，存活率为未被染色的细胞数目与总细胞数目的比值。
乙醇测定：取发酵醪液100 mL于500 mL蒸馏瓶中加入150 mL蒸馏水，采用常压蒸馏，馏出液用100 mL量筒收集，置数分钟，待酒中气泡消失后，放入酒精计，同时插入温度计，平衡约5 min，水平观测，读取与弯月面相切处的刻度值，同时记录温度[13]。
葡萄糖质量浓度测定：DNS法[14]；甘油含量测定：甘油三酯试剂盒。
1.3.4 计算公式
糖醇转化率是生成乙醇的量与消耗葡萄糖的量的比值，其计算公式如下：
式中：Yp/s为糖-醇转化率，%；ΔP为生成乙醇的量，g/L；ΔS为消耗葡萄糖的量，g/L。
发酵效率为糖醇转化率与理论糖醇转化率的比值，其计算公式如下：
式中：η为发酵效率，%；Yp/s为糖醇转化率，%；0.511为理论糖醇转化率，%。
乙醇生成速率为单位时间内乙醇的增量，反映乙醇生成的快慢，其计算公式如下：
式中：Pro为乙醇生成速率，g/（L·h）；ΔP为生成乙醇的量，g/L。Δt为时间的变化量，h。
1.3.5 数据处理
每个ORP水平（-50 mV、-100 mV、-150 mV、对照）均重复试验6次进行分析，得到的数据经SPSS Duncun运算分析后，绘制图表。
2 结果与分析
2.1 氧化还原电位曲线变化特点
在装有4 L玉米醪的5 L发酵罐中，用ORP电极对发酵过程中的氧化还原电位变化进行实时监控，每隔1 h采集一次ORP值；每个ORP水平（-50mV、-100mV、-150mV、对照）均重复试验6次，取平均值，结果见图1。
图1 发酵过程中氧化还原电位变化曲线
Fig.1 Variation curve of oxidation-reduction potential during fermentation process
由图1可知，根据氧化还原电位变化的趋势，将乙醇发酵过程分为ORP下降期、ORP稳定期、ORP上升期。在ORP下降期，由于酵母细胞处于迟缓期和对数期，细胞的快速生长消耗发酵液中的溶氧和发酵液上方的空气，同时产生烟酰胺腺嘌呤二核苷酸（nicotinamide adenine dinucleotide，NADH），造成了ORP值的迅速下降；当ORP值下降至设定值时，进入ORP稳定期，此时控制系统开启，通过向发酵罐通入适量的空气，将ORP值维持在设定值附近。酵母细胞处于对数增长的后期和稳定期；在ORP上升期，因为发酵后期乙醇的积累和葡萄糖的消耗殆尽，酵母细胞进入衰亡期，NADH积累减少，ORP值逐步上升，ORP调控结束。利用传统的酵母浸出粉胨葡萄糖（YPD）培养基进行乙醇发酵时，氧化还原电位可下降至-200 mV以下[7-8]。由于玉米醪成分的复杂性，发酵时氧化还原电位仅最低降至-176 mV。这可能是因为玉米中含有大量的亚油酸，具有酸性基团-COOH，容易被氧化，使玉米醪的氧化还原电位升高。
2.2 糖醇转化率和不同氧化还原电位调控的关系
每个ORP水平（-50 mV、-100 mV、-150 mV、对照）均重复试验6次，记录发酵起始的葡萄糖和乙醇含量的变化，取平均值进行分析，结果见表1。每隔8 h或者10 h取发酵液5 mL，离心5 min后，上清液用于测量葡萄糖含量变化；并用蒸馏法测量发酵完成乙醇生成量，结果见图2和图3。
表1 不同氧化还原电位下的糖醇转化率、发酵效率和乙醇生成速率
Table1 Conversion rate from sugar to ethanol,fermentation efficiency and the production rate of ethanol under different oxidation-reduction potential levels
注：不同小写字母表示在P＜0.05水平差异显著，不同大写字母表示在P＜0.01水平差异显著。
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图2 发酵过程中不同氧化还原电位下葡萄糖的变化曲线
Fig.2 Variation curve of glucose under different oxidation-reduction potentials during fermentation process
图3 发酵过程中不同氧化还原电位下的乙醇生成量
Fig.3 Ethanol production under different oxidation-reduction potentials during fermentation process
“*”表示差异显著（P＜0.05），“**”表示差异极显著（P＜0.01）。
为了比较糖醇转化率，将葡萄糖最初消耗为0时设置为时间终点。由图2可知，在4种不同的ORP条件下，将葡萄糖耗尽的时间不同。由表1可知，当ORP控制值为-150 mV时，乙醇产量最高为103.36 g/L，分别为ORP值为-50 mV、-100 mV及对照的1.72倍、1.26倍、1.04倍。
由图3可知，4种不同的ORP条件下的乙醇产量均具有显著性差异（P＜0.05）。且ORP值为-150 mV时，糖醇转化率和发酵效率高于其他三组，为45.52%和88.06%。ORP控制值为-50 mV时，乙醇产量、糖醇转化率、发酵效率均最低，说明高溶氧水平导致糖酵解途径被抑制，乙醇产量降低。当ORP控制值为-100 mV时，乙醇生成速率最高，为2.16 g/（L·h），与ORP控制值为-150 mV的乙醇生成速率[2.15 g/（L·h）]相差较小（P＞0.05）。因此，将ORP值控制在-150mV时，糖醇转化率、发酵效率及乙醇生产速率均为最佳，分别为45.52%、88.06%、2.15 g/（L·h），对玉米发酵熟醪利用最好。糖醇转化率是衡量淀粉质原料酒精发酵成绩好坏的指标之一，其高低与原料消耗有直接关系。对于发酵酒精生产行业而言，利用ORP控制，可以提高酒精产率，减少原料损失。
2.3 甘油产量和不同氧化还原电位调控的关系
甘油是乙醇发酵的主要副产物。甘油作为细胞保护剂，可以调节渗透压，在缺氧、低温、高渗透压等逆境下，被细胞大量合成；同时甘油也被用于维持细胞内的氧化还原电位。细胞内过量的烟酰胺腺嘌呤二核苷酸[15-16]通过甘油合成消耗。甘油合成会消耗掉一部分糖分，影响糖醇转化率[17]。每个ORP水平（-50 mV、-100 mV、-150 mV、对照）均重复试验6次，每隔8 h或者10 h取发酵液5 mL，离心5 min后，上清液用于测量甘油含量变化，结果见图4。
图4 发酵过程中不同氧化还原电位下甘油产量变化曲线
Fig.4 Variation curve of glycerol production under different oxidationreduction potentials during fermentation process
由图4可知，在不同的氧化还原电位控制条件下，甘油产量不同。当ORP控制值为-50 mV时，甘油产量最高，为23.13 g/L，分别为ORP值为-100 mV、-150 mV及对照的1.07倍、1.17倍、1.31倍。因此设定的ORP控制值越高，甘油的产量越高，且甘油在酒精发酵初期大量产生。原因可能如下两点：其一，在发酵初期酵母进行有氧呼吸，细胞内累积了大量的NADH，糖酵解途径的正常进行需要NAD+的再生。第一个是通过乙醇途径，第二个是通过甘油磷酸途径[18]。由于发酵初期缺少醇脱氢酶，NAD+的再生只能通过甘油磷酸途径；其二，发酵初期发酵液中糖质量浓度较高（约为230 g/L），产生高渗透压，磷酸甘油脱氢酶（glycerophosphate dehydrogenase，GPDH）响应高渗条件表达，以保护细胞免于脱水。而高ORP值意味着细胞有氧呼吸较为旺盛。
每个ORP水平（-50 mV、-100 mV、-150 mV、对照）均重复试验6次，每隔8 h或者10 h取发酵液5 mL，离心5 min后，上清液用于测量酵母数量变化，并结合甘油生成量进行对比，结果见图5。由图5可知，随着酵母细胞数量增加，甘油的产量也随之升高。在不同氧化还原电位条件下，甘油的产量从发酵起始点的5.8 g/L分别增至23.13 g/L（-50 mV）、21.65g/L（-100mV）、21.00g/L（-150mV）、19.56g/L（对照）；在发酵8～18 h内，酵母菌细胞的数量变化曲线急剧上升，而甘油的产量分别从8.46g/L（-50mV）、8.24g/L（-100mV）、8.32g/L（-150mV）、7.12g/L（对照）增至18.84 g/L（-50 mV）、17.52g/L（-100mV）、15.92g/L（-150mV）、14.29g/L（对照），因此对数期细胞甘油生成率最大。这可能是因为在对数期细胞生长旺盛，需要蛋白质、脂质大量合成，用于生长繁殖。
图5 发酵过程中不同氧化还原电位下酵母菌体数量与甘油产量的关系
Fig.5 Relationship between yeast number and glycerol production under different oxidation-reduction potentials during fermentation process
尽管甘油对细胞有保护作用，但是对于发酵酒精生产行业而言，甘油的产生降低了酒精产率，造成碳源浪费。因此，利用氧化还原电极监控发酵液中ORP，可以探寻一个最佳ORP位点，达到酒精产率的最合理化。
2.4 酵母细胞生长和不同氧化还原电位调控的关系
酵母细胞的数量对乙醇发酵至关重要。每个ORP水平（-50mV、-100 mV、-150 mV、对照）均重复试验6次，每隔8 h或者10 h取发酵液5 mL，离心5 min后，上清液用于测量酵母菌体数量变化，并计算存活率，结果见图6。
图6 发酵过程中不同氧化还原电位下酵母菌的菌体数量变化曲线
Fig.6 Variation curve of yeast number under different oxidationreduction potentials during fermentation process
由图6可知，在不同的氧化还原电位控制条件下，酵母细胞的数量不同。控制ORP的乙醇发酵，菌体数量均大于对照。设定的ORP值越高，控制系统通入更多的空气，这对发酵初期菌体生长有利，因此，酵母细胞数量越高。在不进行ORP控制的自然情况下，酵母的最高菌体数量最低，为4.50×109CFU/mL。当ORP控制值为-50 mV时，最高菌体数量达到了5.36×109CFU/mL，分别为ORP值为-100 mV、-150 mV、对照的1.15倍、1.18倍和1.19倍。
细胞存活率也是发酵的重要指标之一。对比不同氧化还原电位下的酵母存活率，结果见图7。
图7 发酵过程中不同氧化还原电位下的酵母存活率
Fig.7 Yeast viability under different oxidation-reduction potentials during fermentation process
由图7可知，当ORP控制值为-150 mV时，发酵终点的酵母细胞存活率最高，为0.87，分别为ORP值为-50 mV、-100 mV、对照的1.12倍、1.02倍、1.07倍。当ORP控制值为-50mV时，虽然其菌体数量最高，但存活率远低于其他三组。而ORP控制值为-100mV，其最高菌体数量虽然与ORP值为-150mV相近，其存活率却低于后者，说明过多的溶氧对于细胞存活有不利的影响。虽然发酵液中微量的溶氧可以提高酵母生物合成能力，保持细胞活性[19]。但同时，溶氧水平过高一方面会导致细胞在有氧生长过程中产生活性氧，如过氧化氢、超氧化物等，这些物质对细胞造成损伤、死亡和老化[20-21]，一方面抑制糖酵解途径的活性，乙醇合成量减少[22]。所有试验组在发酵28 h后，菌体存活率下降，这可能是因为乙醇的累积，对细胞产生毒性。而ORP控制值为-50 mV时，存活率下降趋势最为剧烈。虽然在此条件下甘油产量最高，可以帮助酵母抵御逆境，但是可能因为葡萄糖的耗尽，使细胞缺少碳源，加上乙醇积累双重影响，造成细胞死亡。与传统的YPD培养基相比[7]，利用玉米醪进行乙醇发酵，在相同时间点酵母细胞存活率更高，这可能意味着玉米醪更适合酵母细胞生长。
因此，对于发酵酒精生产行业而言，利用氧化还原电极可以精确检测发酵液中溶氧情况，同时适当控制ORP值，可以避免酵母细胞的过量生长，维持在高存活率状态。
3 结论
本试验首次将ORP控制运用于工厂玉米醪，监控乙醇发酵过程的酵母的菌体数量、存活率、糖醇转化率和甘油生成量变化。结果表明，ORP控制值越高，酵母菌体数量和甘油生成量越高，恰当的ORP值利于细胞存活率提升。在一定范围内，ORP控制值越低，糖醇转化率呈下降趋势，而控制值为-150 mV时，糖醇转化率最高。本试验的最佳ORP控制值为-150 mV。控制氧化还原电位，增加乙醇的生成，减少副产物积累，为发酵酒精工业提供思路。
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