蓝莓是超强抗氧化活性成分花色苷最丰富的膳食来源之一[1]，且富含多种具有药理保健功效的成分，是国际粮农组织列出的人类五大健康食品之一，被誉为“水果皇后”[2]。蓝莓多在高温多雨的季节成熟且保质期短极易腐烂，但时至今日蓝莓贮藏、加工等环节均缺乏规模化、标准化运作，另外，目前国内市场上蓝莓果酒产品还较为少见，欧美等国用蓝莓加工的所有产品都远高于其他同类产品，发酵果酒更是成为高收入人群的奢侈品[3]。而苹果这种喜闻乐见的水果不但富含多种营养成分也具有美容养颜等保健功效[4-5]，且苹果酒在国际上早已是大众流通商品[6]。随着消费观念的转变，近年来市面上复合型果酒也相继出现，如蓝莓猕猴桃、苹果杏鲍菇、银杏火龙果、蓝靛果蓝莓复合果酒等[7-10]，复合后的发酵果酒不但保留了各自营养成分，还在口感、风味、品质方面弥补了单一品种果酒的不足；如蓝莓酒果香浓郁但普遍存在偏酸性的特点，而苹果具有酸度低，单宁含量低的特点，但口感单薄[11]，因此将两者复合发酵不但可以取长补短，还能提高其附加值，而且，此款果酒在国内外市面上还较为鲜见，综上，蓝莓苹果复合果酒也将拥有广泛发展前景的基础。
但目前国内外蓝莓苹果复合果酒的酿造过程中，大多采用葡萄酒通用酵母，几乎没有特别适合的专用酵母，在一定程度上造成了风味偏于平淡，无法突出其独特口感和香气。果酒发酵是一个复杂的生物转化过程，其酵母主导的酒精发酵是果酒生产最重要阶段之一；并且不同酵母菌株会产生部分特定代谢物质，在原料品种、工艺条件、酿酒设备相对稳定的情况下，酵母菌种直接影响着果酒的色泽、香气及口感；因此，本研究选用可突出水果香气特征、增强果香的DO02酵母、具有强花青素和单宁浸提能力的D254酵母、能产生大量水解多糖、芳香细致的JK10酵母、可释放品种香气特质的Vitilevure KD酵母、富产多糖、果香浓郁的JK13酵母及实验室原有酵母DO03、BV818、ADT，制备蓝莓苹果复合果酒。选用8种国内外商业酵母，对比各种酵母发酵过程中总酸、总糖、还原糖含量的变化规律，分析蓝莓苹果复合果酒感官指标和理化指标，并采用顶空固相微萃取-气质联用（headspacesolid-phasemicroextraction-gaschromatography-mass spectrometry，HS-SPME-GC-MS）法检测其香气组分。结合感官评分和顶空固相微萃取气质联用（HSSPME-GC-MS）技术对各香气组分含量进行分析，从而找到蓝莓苹果复合果酒的最佳酵母，为该果酒特色和品牌形成奠定基础。
1 材料与方法
1.1 材料与试剂
1.1.1 原料和菌株
国产酵母（DO02、DO03、BV818、ADT）、进口酵母（JK10、D254、VitilevureKD（KD）、JK13）：烟台帝伯仕有限公司；纯净水：贵州北极熊集团；蓝莓汁和苹果汁：市售100%纯果汁。
1.1.2 化学试剂
葡糖糖、氢氧化钠、酒石酸钾钠：成都金山化学试剂有限公司；3,5-二硝基水杨酸（dinitrosalicylic acid，DNS）：国药集团化学试剂有限公司；盐酸：重庆川东化工科技有限公司；碘标准滴定溶液：山东绿英化工科技有限公司；以上试剂均为分析纯。
1.2 仪器与设备
722S可见光分光光度计：上海菁华科技仪器有限公司；7890A-5975C气相色谱-质谱联用仪、CP-WAX 57CB色谱柱（50 m×250 μm×0.20 μm）：美国安捷伦科技有限公司；50/30 μm萃取头DVB/CAR/PDMS Stable Flex：美国Supelco公司；PHS-3C精密酸度计：上海大普仪器有限公司。
1.3 试验方法
1.3.1 蓝莓苹果复合果酒加工工艺流程及操作要点
操作要点：
发酵液调配[12]：以蓝莓苹果复合果酒酒精度14%vol为前提，蓝莓汁和苹果汁以1∶1的比例调配，适量加糖并以纯净水稀释调整发酵液糖度。
装入容器：将调配好的发酵液装入三角瓶容器中，约占容器的3/4左右。
接种：干酵母用量为0.34‰[11，13-14]，以料液比1∶10（g∶mL）加入0.5%蔗糖水，30～37℃活化15～20 min，接种活化好的酵母种子液，并适当搅拌使其与料液充分混合，并增加溶氧量。
发酵：将样品置于25℃恒温发酵，前36～48 h纱布封口，适当搅拌，待发酵液有酒精味产生，或酵母活菌数约为107CFU/mL，以硅胶单向阀取代纱布继续发酵；发酵过程每隔2 d监测一次总糖、总酸、还原糖含量，当还原糖含量≤10 g/L或检测数据连续3次基本保持稳定时，视作发酵终点。
过滤：发酵液使用滤膜为120目过滤机过滤。
装瓶：将过滤后的果酒迅速装瓶，打塞密封，得到蓝莓苹果复合果酒。
1.3.2 理化检测
总糖、还原糖含量测定：3,5-二硝基水杨酸法[15]；总酸含量测定：参照国标GB/T 32783—2016《蓝莓酒》[16]；酒精度、挥发酸、干浸出物含量测定：参照国标GB/T 15038—2006《葡萄酒、果酒通用分析方法》[12]。
1.3.3 感官评分
以本院老师、学生和企业代表为参评人员参照GB/T 15038—2006《葡萄酒、果酒通用分析方法》[12]进行感官评分，满分100分，蓝莓苹果评分标准见表1。
表1 蓝莓苹果复合果酒感官评分标准
Table1 Sensory evaluation standards of blueberry-apple compound fruit wine
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1.3.4香气成分分析
采用HS-SPME-GC-MS法提取样品香气成分[17-18]。向各个装有5mL酵母果酒样品的10mL顶空瓶中分别加入2g的NaCl，拧盖备用。萃取头老化15min，孵化温度50℃，萃取时间30min，振摇速度450r/min，解吸5 min，进行GC-MS 检测分析。
GC条件：以高纯氦气（He）为载气，流速1.0 mL/min；加热器温度200℃；柱箱温度55℃，升温程序：以3℃/min从55℃升至70℃保持1 min，以3℃/min升至115℃保持1 min，以4℃/min升至200℃保持3 min。
MS条件：电子电离（electronic ionization，EI）源；电子能量70 eV，发射电流200 μA，离子源温度230℃，四级杆温度150℃，扫描方式为全扫描。
定性定量分析：样品中未知挥发性组分通过美国国家标准技术研究所（national institute of standards and technol ogy，NIST）2011图库比对、分析，保留匹配度＞80%的物质；采用峰面积归一化法计算各成分相对百分含量[19]。
1.3.5 数据分析
运用office Excel、GraphPad、Oringin8.0和SPSS18.0数据统计分析软件进行分析、作图。
2 结果与分析
2.1 发酵过程总糖含量变化
8种酵母发酵期间总糖含量变化结果见图1。
图1 发酵过程中总糖含量变化
Fig.1 Change of total sugar contents during fermentation process
由图1可知，以总糖余量＜10 g/L作为发酵结束来看，国产酵母与进口酵母总糖含量分别于发酵4～8 d和2～6 d迅速下降，之后则以缓慢下降趋势至发酵结束，可知进口酵母环境适应性强且进入大量繁殖期早；由于国产酵母BV818周期最短（28 d），进口酵母JK10周期最长（28 d），综上，从总糖含量的变化可以得出，本次试验8种酵母中，在发酵速率方面进口酵母整体优于国产酵母。
另外，在发酵前期，所有酵母总糖含量下降趋势陡峭，这是因为酵母活菌数骤增，大量利用糖分促进自身生长繁殖同时又以糖为发酵底物进行酒精发酵所致[20]，而发酵一段时间后下降趋势趋于缓和，这是由于酵母进入平稳期，糖分利用率减缓，且随着酒精含量上升酵母菌也受到了乙醇胁迫[21]，且几乎没有总糖残量为零的现象，可能因酵母逐渐进入衰退期，总糖无法被利用，从而出现下降趋势趋于停滞，最终导致酒精发酵结束。
2.2 发酵过程还原糖含量变化
8种酵母发酵期间还原糖含量变化结果见图2。
图2 发酵过程中还原糖含量的变化
Fig.2 Change of reducing sugar contents during fermentation process
由图2可知，还原糖含量变化大致趋同于总糖含量变化趋势，但进口酵母在发酵15 d后含糖量下降趋势才出现缓和，而国产酵母则从第12天便在相对于同期进口酵母残糖量多倍的基础上开始缓慢下降趋势，而这种现象也与整个发酵周期长短相符合，就还原糖含量变化来看，本次试验8种受试酵母中，进口酵母JK10、D254、KD相对较好。
经比对还原糖和总糖含量的变化，大部分酵母同期还原糖量有高于总糖的现象，推测在测定总糖时添加的盐酸使总糖被破坏，而测定的还原糖一部分源于样品本身，另一部分源于蔗糖经酸水解后生成的还原糖，由此可认为还原糖相对于总糖能更准确地反映出发酵液残糖量变化情况，因而更具代表性。
2.3 发酵过程总酸含量变化
8种酵母发酵期间总酸含量变化结果见图3。
图3 发酵过程中总酸含量的变化
Fig.3 Change of total acid contents during fermentation process
总酸指果酒中所有可与碱发生中和反应的酸的总和，与果酒风味有很大关系[22]。由图3可知，8种酒样总酸含量均＞4.0 g/L，其中酵母JK10、DO03、BV818、ADT虽前期总酸含量增加，但整体而言，变化幅度相对较小，总酸相对稳定。另外，发酵前期总酸含量一直增加，一方面是原料自身含有的有机酸积累，另一方面发酵液中产酸菌在发酵过程中产生醋酸、丁酸、乳酸等[23]，以及酒精发酵过程中产生的二氧化碳如未能及时放出也会增加碳酸含量，这些原因都促使了有机酸大量积累；而当发酵至12 d左右时，总酸含量呈缓慢下降趋势，这可能是随着发酵时间推移积累的有机酸和生成的乙醇发生酯化反应，酸有所消耗的缘故。
2.4 不同酵母发酵蓝莓苹果复合果酒的理化指标
8种酵母发酵液在发酵结束时的理化指标见图4。
图4 八种商业酵母发酵蓝莓苹果复合果酒理化指标检测结果
Fig.4 Determination results of physiochemical indexes of blueberry-apple compound fruit wine fermented by eight kinds of commercial yeasts
由图4A可知，因干浸出物直接影响果酒香气滋味，其含量对果酒风味影响较大，酵母JK13在8种酒样中含量最低，且差异显著（P＜0.05）；由图4B可知，酵母DO03、JK10、D254、JK13、KD酒精转化能力高于酵母DO02、BV818、ADT；由图4C可知，一般果酒中挥发酸主要以乙酸为主，而发酵异常或被杂菌污染有可能使其在酒中过度累积产生刺激性气味使酒体口感尖酸[27]。酵母BV818、D254、JK13、KD的酒样中挥发酸含量较低，酵母DO03、ADT、JK10含量稍高，但也低于GB/T 32783—2016《蓝莓酒》中挥发酸含量≤1.2 g/L的要求。由图4D可知，酵母JK13总酸含量最低，差异显著（P＜0.05），酵母ADT、KD总酸含量相对较高，与其他6种酒样差异显著（P＜0.05），而酵母DO02、DO03、BV818、D254、JK10总酸含量居中，适口性更强。
2.5 蓝莓苹果复合果酒香气成分分析
8种酵母发酵液在发酵结束时，采用HS-SPME-GC-MS技术对其香气成分进行分析，结果见表2。
表2 八种蓝莓苹果复合果酒香气成分GC-MS分析结果
Table2 Analysis results of aroma components in eight kinds of blueberry-apple compound fruit wine analyzed by GC-MS
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续表
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续表
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续表
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由表2可知，国产酵母DO02、DO03、BV818、ADT发酵液中分别检测到52种、51种、52种、48种香气物质，进口酵母JK10、D254、JK13、KD分别检测到58种、49种、45种和40种。由此可知酵母JK10具有产香相对优势，虽8种复合果酒存在差异，但酯类作为果酒最重要的香气物质，其己酸乙酯、月桂酸乙酯、十四酸乙酯、辛酸乙酯、棕榈酸乙酯、9-癸烯酸乙酯、苯甲酸乙酯为共有物质。本次检测中具有椰香味的癸酸乙酯含量最多且大部分酒样总峰面积占比＞20%；其中酵母DO02酯类总峰面积占比高达到57.27%，在所检测的香气成分中占比65%，故而在香气方面理论上更为浓郁。
部分醇类可为酒体提供清甜果香和花香，而萜烯类组分虽感官阈值较低，含量低，但香气很明显，气味独特，为果酒香气组成起到不可忽视的作用。其中酵母JK10的醇类总峰面积占比高达到53.260%，在所检测到的香气成分中占比61%，其独有的D-橙花脑醇、3-苯丙醇、反式-1-苯基-1-醇、2-乙氨基乙硫醇使其香气复杂，也正因此在感官评定中分值较高。
酸类化合物的存在不但能丰富果酒口感还有助于原反应的发生，从而平衡酒体香气，使口感更具层次感和饱满性。如辛酸虽然具有令人不愉快气味，但可与醇类生成酯类，是提高果酒品质的重要保障，但酸类物质过多则会使酒体酸涩，其中，酵母DO02酸类物质占比最高7.76%。
果酒中羰基化合物大多由微生物发酵而成，通过化学变化生成乙醛、乙醇、异戊醇和仲戊醇等，在多种醇类物质催化作用下形成乙缩醛，它对提高酒体整体风味有着显著作用；而酚类这种复杂基团化合物也是一种极其重要的挥发性芳香类物质；虽两者阈值较低，酒液中的含量也很低，但两者对酒体的滋味、香气和微生物稳定性均起着难以替代的作用。
综上，蓝莓苹果复合果酒香气成分种类多样，且很多香气成分有着类似香气气味，因此可以在对每种香气成分香气特征清晰了解的基础上精确定量分析，或进一步借助气相色谱-嗅闻（gaschromatography-olfactometry，GC-O）法、香气活度值（odor activity value，OAV）法等对香气成分进一步分析，从而为蓝莓苹果复合果酒的特色和品牌形成提供理论基础。
2.6 蓝莓苹果复合果酒感官评定
表3 八种商业酵母发酵蓝莓苹果复合果酒感官评定结果
Table3 Sensory evaluation results of blueberry-apple compound fruit wine fermented by eight kinds of commercial yeasts
注：总分=外观×0.2+香气×0.3+滋味×0.3+典型性×0.2。
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由表3可知，国产酵母中DO02分值最高（84.5分）；进口酵母中JK10分值最高（87.0分）。酵母KD感官评分最低（81.5分），酵母BV818、D254、JK13及ADT感官评分在83.0～84.3分。结果表明，酵母DO02和JK10感官品质较好。
3 结论
以蓝莓汁和苹果汁为原料，选用8种国内外商业酵母，对比各种酵母发酵过程中总酸、总糖、还原糖含量的变化规律，分析蓝莓苹果复合果酒感官指标和理化指标，并采用顶空固相微萃取-气质联用（HS-SPME-GC-MS）法检测其香气组分。结果表明，8种酵母发酵蓝莓苹果复合果理化指标均符合相关国标的要求，其中酵母JK10是制备蓝莓苹果复合果酒最佳酿酒酵母，成品各理化指标均符合GB/T 32783—2016《蓝莓酒》相关要求，感官评分最高87.0分，酒精度为14.9%vol，共检测到58种香气物质，为其产业化开发提供理论基础。
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