红提葡萄果实大而饱满、甜度高、营养丰富、果皮略厚、不易脱粒[1]，营养十分丰富[2]，因而自酿葡萄酒备受人们欢迎[3]。酵母菌主要在无氧条件下进行繁殖，在有氧条件下将糖发酵成酒精和二氧化碳，是一种典型的兼性厌氧微生物，遍布于整个自然界[4-5]。在葡萄酒酿造过程中，酵母菌不仅是发酵剂，而且会影响葡萄酒的品质、产量以及香气等[6-7]。由于与葡萄酒中的花青素发生反应，酵母产生的β-D-糖苷酶和酵母代谢产物丙酮酸、乙醛导致酒体中单体花青素降解，从而改变葡萄酒的颜色特征[7]。不同品种、地区葡萄自身所带酵母菌的不同，不同酵母菌发酵所产生的发酵产物的不同，以及酿造过程的发酵工艺及发酵环境的不同等诸多因素的影响下使得由天然酵母进行发酵所酿造的葡萄酒具有较为独特的地方特色[8-9]。在酒精发酵中，酵母菌是主力军，但不是所有的酵母菌都是有利于葡萄酒发酵的进行的，因此，研究酵母菌的多样性也是有助于避免败坏性酵母的识别[10]。
1 材料与方法
1.1 材料与试剂
红提葡萄：从新疆石河子地区采摘。
葡萄糖、蛋白胨、酵母浸粉、琼脂、乙醇、柠檬酸、蔗糖、麦芽糖、乳糖、可溶性淀粉、硫酸铵、硝酸钾、尿素、氯化钠、氯化钙、磷酸二氢钾、七水合硫酸镁、酵母膏、酵母菌基因组脱氧核糖核酸（deoxyribonucleicacid，DNA）提取试剂盒、溶壁酶、2×Taq聚合酶链式反应（polymerase chain reaction，PCR）Master Mix、ddH2O、Ladder Marker、DNA扩增引物（ITS）：上海生工生物技术有限公司。以上试剂均为分析纯或生化试剂。
酵母浸出粉胨葡萄糖（yeast extract peptone dextros，YEPD）培养基、WL琼脂培养基、同化碳源基础培养基、同化碳源液体培养基、同化氮源基础培养基、同化氮源液体培养基：上海生工生物技术有限公司。
1.2 仪器与设备
SPX-250B生化培养箱：常州诺基仪器有限公司；DYY-8C电泳仪：北京六一生物科技有限公司；T100PCR仪、GelDOC XR凝胶成像系统：美国BioRad公司；CX21FS1光学显微镜：日本Olympus公司；LAC-5040S全自动高压灭菌锅：浙江新丰医疗器械有限公司；SW-CJ超净工作台：苏州安泰空气技术有限公司；Bnp-9272智能生化培养箱：上海精宏试验设备有限公司；B250恒温水浴锅：上海予卓仪器有限公司。
1.3 方法
1.3.1 样品处理
红提葡萄中酵母菌的分离：取10颗红提葡萄经破碎后放于装有100 mL YEPD液体培养基（提前灭菌）的250 mL锥形瓶中并摇匀。28℃摇床培养24 h，摇床转速设定为180 r/min，富集培养结束后去5 mL培养液作为菌株分离的样品。
1.3.2 菌株的分离纯化
用1mL移液枪吸取1 mL培养液于9 mL无菌水试管中，振荡混匀，标记为10-1稀释度，用1 mL移液枪吸取1 mL 10-1稀释度的培养液于9 mL无菌水试管中，标记为10-2稀释度，依次稀释7个梯度（10-1、10-2、10-3、10-4、10-5、10-6、10-7），用200 μL移液枪吸取200 μL菌液于YEPD固体培养基的平板上进行涂布，每个稀释梯度平行涂布3个平板，28℃恒温培养箱培养24 h。挑取YEPD固体培养基中不同形态、不同大小的菌落在YEPD固体培养基上进行划线，在28℃恒温培养箱中培养24 h，经多次划线纯化得到单一菌落。
1.3.3 WL培养基表型鉴定及菌株形态观察
根据培养基上菌落的大小、颜色、光泽、形状等表型的差异，对供试菌株进行初步分类并且挑选出代表菌株，使用光学显微镜进行显微形态观察，采集显微观察照片。
将分离菌株划线接种于WL培养基上，28℃恒温培养箱培养24 h，观察菌落形态及颜色，根据菌落形态及颜色对所分离酵母菌进行初步分类。
1.3.4 生理生化试验
分离酵母菌的生理生化试验主要包括：糖发酵试验、氮源同化试验以及碳源同化试验[12]。
（1）酵母菌的糖发酵试验：将各种种类的糖（葡萄糖、蔗糖、麦芽糖、乳糖）加入0.6%的酵母浸粉溶液中，使糖含量达到2%，然后将配制好的溶液分别加入含有杜氏发酵管的试管中，接入活化的供试菌株，28℃恒温培养箱培养48 h。在培养过程中，若杜氏管顶部出现气泡，则说明供试菌株可以利用此种糖，此时可记为“+”（阳性反应），若无变化，记为“-”（阴性反应）。
（2）氮源同化试验：将处于生长期的供试菌株接入氮源液体培养基中，于28℃恒温培养箱培养48 h，观察生长情况和溶液变化情况，并与空白试验对照，观察溶液是否发生浑浊，是否形成环岛和菌璞等。
（3）碳源同化试验：将处于生长期的供试菌株接入碳源液体培养基中，于28℃恒温培养箱培养48 h，观察生长情况和溶液变化情况，并与空白试验对照，观察溶液是否发生浑浊，是否形成环岛和菌璞等。
1.3.5 菌种的保藏
在酵母菌划线平板中挑取单菌落于装有10 mL YEPD液体培养基的试管中，在28℃恒温培养箱中培养24 h。用1 mL移液枪吸取0.75 mL经灭菌体积分数为甘油于1.5 mL离心管中，冷藏备用。将培养菌液与60%的灭菌甘油1∶1混合，-70℃保藏。
1.3.6 DNA的提取
通过离心收集菌体后按照BioFlux真菌基因组DNA提取试剂盒的说明提取DNA，并用1%的琼脂糖凝胶电泳检测提取DNA的质量，提取的DNA放置在-20℃环境中保存，以避免DNA降解。
1.3.7 PCR扩增
使用上述方法提取的酵母菌DNA样品2 μL为扩增模板，引物ITS12μL，引物ITS42μL，ddH2O19μL，Mix25μL，空白不加样品，ddH2O21μL。扩增使用引物ITS1：5′-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3′和引物ITS4：5′-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3′。PCR扩增程序：94℃变性1 min，55℃退火30 s，72 ℃延伸1 min，共36个循环[13]。
1.3.8 PCR反应产物的电泳检测
将3μLPCR产物点样到1%琼脂糖凝胶（已加入染色液）的点样孔中，电压110V，电流90mA，时间约30min。用凝胶成像仪观察电泳结果，将合格的PCR反应产物送检。
1.3.9 PCR产物测序和系统发育分析
将电泳检测合格的PCR扩增产物送至华大基因进行测序。测序完成后将测序基因进行拼接，然后使用美国国立生物信息技术中心（National Center for Biotechnology Information，NCBI）数据库中的BLAST进行测序菌株的同源性比对，获得同源酵母标准菌株的序列后，使用ClustalW程序将菌株序列进行匹配排列，然后结合软件Mega 6.0构建系统发育树。
2 结果与分析
2.1 酵母菌的分离、纯化及在WL培养基上的形态分类[14-15]
通过YEPD液体培养基的富集及YEPD固体培养基的分离和纯化，一共从红提葡萄中分离纯化和保藏得到24个酵母菌菌株，编号为Y-1～Y-24。
由表1可知，通过对酵母菌在WL培养基菌落形态的观察，初步判断菌株Y-4、Y-13、Y-21、Y-24为同一属，菌株Y-2、Y-3、Y-6、Y-19为同一属，其他菌株还不能判断。
观察24株酵母菌分离株菌落形态，菌落形态几乎为圆形或椭圆形；颜色大多为白色或者淡黄色，个别菌落为淡红色。通过对分离得到的24株酵母菌进行形态观察，并对这些菌株进行初步的分类和归纳，24株酵母菌大概分为3个类别，其菌落形态及个体形态如图1所示。
表1 酵母菌在WL培养基上的菌落形态
Table1 Morphology of yeasts on WL medium
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图1 酵母菌菌落形态（A）和个体形态（B）
Fig.1 Colonial morphology(A)and individual morphology(B)of yeasts
2.2 生理生化分析
2.2.1 糖发酵试验
由表2可以看出，24株酵母菌均可以利用葡萄糖进行发酵，都不可以利用蔗糖、麦芽糖和乳糖进行发酵。
表2 24株酵母菌糖发酵试验结果
Table2 Results of sugar fermentation tests of 24 yeasts
注：“-”表明反应呈阴性，无气泡产生，不可利用此类糖；“+”表明反应呈阳性，有气泡产生，可利用此类糖。
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2.2.2 氮源同化试验
表3 24株酵母菌氮源同化试验结果
Table3 Results of nitrogen source assimilation tests of 24 yeasts
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续表
注：“-”表明澄清、无环岛或菌璞的形成，不可同化氮源；“+”表明浑浊、有环岛或菌璞的形成，可同化氮源。
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由表3可知，所有菌株都不可同化尿素和硝酸钾，都可同化硫酸铵。
2.2.3 碳源同化试验
表4 24株酵母菌碳源同化试验结果
Table4 Results of carbon source assimilation tests of 24 yeasts
注：“-”表明澄清、无环岛或菌璞的形成，不可同化碳源；“+”表明浑浊、有环岛或菌璞的形成，可同化碳源。
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由表4可知，除了菌株Y-2、Y-3、Y-6、Y-19可同化蔗糖，其余菌株都不可同化蔗糖。其他菌株都能够同化乙醇和柠檬酸为碳源。所有的菌株都不能同化可溶性淀粉。
结合表1～3可以看出，菌株Y-1、Y-5、Y-7、Y-8、Y-9、Y-10、Y-11、Y-12、Y-14、Y-15、Y-16、Y-17、Y-18、Y-22均可发酵葡萄糖，不可发酵蔗糖、乳糖与麦芽糖；在氮源同化试验中均可同化硫酸铵，不可同化硝酸铵和尿素；在碳源同化试验中都可同化乙醇和柠檬酸，不可同化蔗糖和可溶性淀粉；可初步判断为毕赤酵母属。其余菌株目前不能判断。
2.3 分子生物学鉴定
2.3.1 酵母菌PCR扩增结果
将提取的酵母菌DNA进行PCR扩增后，琼脂糖凝胶电泳检测，在500～600 bp出现了特异性扩增条带，且条带较为明亮，在酵母菌的理论预期值之内，PCR扩增结果符合测序标准，可进行测序。电泳检测结果如图2所示。
图2 26S rDNA D1/D2区域PCR扩增产物凝胶电泳结果
Fig.2 Agarose gel electrophoresis results of PCR amplification products for 26S rDNA D1/D2 region
注：M为Marker，1～24为菌株Y-1～Y-24。
2.3.2 酵母菌DNA测序比对结果
本试验分离出的24株酵母菌测序结果使用NCBI数据库的Blast程序调用Genbank数据库进行同源性比对，选择同源性最高的菌株，比对结果如表5所示。
表5 24株酵母菌同源性比较及登录号
Table5 Homology comparison and registration numbers of 24 yeasts
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续表
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2.3.3 系统发育树的建立
图3 红提葡萄酵母ITS序列区系统发育树
Fig.3 Phylogenetic tree of ITS sequence region of yeast from red grape
由图3可知，菌株Y-1、Y-5、Y-7、Y-8、Y-9、Y-10、Y-11、Y-12、Y-14、Y-15、Y-16、Y-17、Y-18、Y-20、Y-22、Y-23的ITS区序列在进化关系上亲缘关系较近，在系统发育树上形成了第一类群，属于毕赤酵母属（Pichia）。菌株Y-2、Y-3、Y-6、Y-19的ITS区序列在进化关系上亲缘关系较近，在系统发育树上形成了第二类群，属于梅奇酵母属（Metschnikowia）。菌株Y-4、Y-13、Y-21、Y-24的ITS区序列与汉逊酵母属（Hanseniaspora）在进化关系上亲缘关系较近，形成第三类群。
结合图3和表5可得，毕赤酵母属占所有酵母菌的66.67%，分离所得24株酵母菌中有12株为库德毕赤酵母，占比为50%，其次是葡萄汁有孢汉逊酵母和梅奇酵母，占比都是16.67%。所有分离株与相对应的参考菌株同源性都达到了98%以上，并与其聚在一起，证明酵母菌ITS区域序列分析结果的准确性[16-20]。分离酵母菌株基因鉴定结果与表型鉴定结果、生理生化试验鉴定结果基本一致。
3 讨论
红提葡萄是一种鲜食葡萄，它的含糖量在17%左右，相较于酿酒葡萄的含糖量较低，这与酿造优质葡萄酒的条件有着天然的差距，也因此人们对于其酵母菌多样性的研究较少。贾春凤等[2]主要研究了红提葡萄在发酵过程中的酵母菌及其耐受性和发酵能力，筛选出了具有较好耐受性的菌株。黄静等[26]研究了鲜食葡萄红提和户太八号的酿酒特性，对总酚、单体酚和花色苷在不同贮藏条件下的变化情况进行了详细阐述；而都晗等[27]则将鲜食葡萄户太八号、夏黑和酿酒葡萄爱格丽、嘉年华、玫瑰香进行起泡葡萄酒的酿造，得出爱格丽及夏黑酿造的起泡葡萄酒品质较高。这说明在葡萄酒的酿造中，鲜食葡萄也有自己的可取之处。
而本研究沿着前人的思路进一步将分离所得的酵母菌进行分离鉴定，并构建发育树来阐述红提葡萄中酵母菌的多样性，从而发掘红提葡萄所蕴含的酵母菌资源。
另一方面，发酵过程中的酵母菌除了添加的人工酵母和葡萄所携带的野生酵母还可以来自酒厂机械环境，发酵酵母的多样可以使葡萄酒的风味多样[21-24]，因此进行酵母菌多样化的研究是有重要意义的。
今后开展红提葡萄酵母菌多样性的研究可从红提葡萄园的土壤中分离本土化酵母菌群也可选取不同地区的红提葡萄分离酵母菌群，并对其中参与葡萄酒酿造的酵母菌进行深入研究，从而选育具有地区特色的酵母菌，为我国葡萄酒酿造产业服务，为红提葡萄表皮酵母菌资源的开发与利用服务。
4 结论
通过对石河子红提葡萄酵母菌的筛选、纯化、提取DNA，对提取的DNA进行PCR扩增，将扩增的PCR产物送检利用分子生物学鉴定，结合表型鉴定得到24株酵母菌，最终被鉴定为3个属，分别为汉逊酵母属（Hanseniaspora）、毕赤酵母属（Pichia）、梅奇酵母属（Metschnikowia）。5个不同种群，分别为库德毕赤酵母（Pichia kudriavzevii）、发酵毕赤酵母（Pichia fermentans）、克鲁维毕赤酵母（Pichia kluyveri）、葡萄汁有孢汉逊酵母（Hanseniasporauvarum）、梅奇酵母（Metschnikowia）。并且库德毕赤酵母为优势酵母菌群。
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