黄酒是中国特有的酿造酒，与啤酒、葡萄酒并称为世界三大发酵酒。黄酒发酵方式属于双边发酵且伴随着多种微生物共同发酵，特定的发酵工艺使黄酒具有独特的风味特征以及特定的功能性。随着生活水平的不断提高，消费者的需求目标已向健康保健转变，单纯的酒种已不能满足消费者的需要。研究表明[1-2]，黄酒中吡嗪类、核苷类、黄酮类、萜烯类化合物等比较丰富，此外黄酒中游离氨基酸、功能性低聚糖、矿物质元素和多酚类物质含量要明显优于其他酒类。黄酒是富含功能性低聚糖的天然饮品，功能性低聚糖具有多种重要的生理功能，因此适量饮用黄酒能起到较好的保健作用[3]。黄酒中富含γ-氨基丁酸，具有提高记忆力、降血压、活化肝肾及防止动脉硬化等功能[4]。
功能性黄酒就是指在生产过程中添加功能因子后制成的一类黄酒，对人体有一定的保健功能[5]。杨祖滔[6]研究表明，薏米茯苓黄酒中含有丰富的功能性成分，具有较强的抗氧化能力。此外，红曲黄酒[7]、桑葚黄酒[8]、牡蛎黄酒[9]等新型的功能性黄酒得以被开发，这些新型黄酒适量饮用能够改善机体免疫力。闫训友等[10]研究富含冬虫夏草发酵液中虫草素的功能性黄酒。赵贝等[11]研究阿魏药酒表明，抗肿瘤作用可能与其免疫调节和抗氧化作用有关。李鸿儒等[12]研究附子药酒表明，附子药酒虽有一定抗肿瘤作用，但同时对阻止肿瘤生长也有不利的方面。近年来富含中草药成分的黄酒也被开发出来，许多学者对黄芪甲苷和三七[13-14]、麦冬[15-16]、甘草[17]、五味子[18]等进行了大量研究，表明这些中草药对提高人体免疫力方面具有很大的作用。因此，功能性黄酒的开发具有很大的前景。
但是具有功能性的黄酒，其功能性表现尚不明确。因此本研究以低度传统半干绍兴黄酒为酒基，加入黄芪、麦冬、五味子、生晒参、甘草中药提取物，增加皂苷、多糖等功能性成分含量，通过建立不同的小鼠免疫抑制模型，对小鼠进行功能性黄酒的处理，以说明功能性黄酒对提高机体免疫力的作用，为开发新型的功能性黄酒提供参考。
1 材料与方法
1.1 材料与试剂
中药材（黄芪、五味子、生晒参、麦冬、甘草）：杭州东仁堂医药零售十号大街店；清洁级美国癌症研究所（institute of cancer research，ICR）小鼠（体质量（20±2）g）：浙江医学科学院动物中心；绍兴黄酒（酒精度15%vol）：浙江古越龙山绍兴酒股份有限公司；环磷酰胺：上海生工生物工程股份有限公司；酶联免疫吸附测定（enzyme-linked immuno sorbent assay，ELISA）试剂盒：上海邦奕生物科技有限公司；细胞裂解液：国家黄酒工程技术中心；磷酸缓冲液：国家黄酒工程技术中心。
1.2 仪器与设备
BW3200S电子天平：上海精密仪器仪表有限公司；5910R高速冷冻离心机：艾本德中国有限公司；BD FACSCalibur流式细胞仪：碧迪医疗器械（上海）有限公司；DFY-200C小型粉碎机：上海利闻科学仪器有限公司；FE30 pH计：瑞士梅特勒-托利多集团。
1.3 实验方法
1.3.1 功能性黄酒制作
将实验用中药材在40℃烘干至恒质量，将其粉碎至40目大小均匀颗粒。称取黄芪20 g、五味子4 g、生晒参20 g、麦冬8 g、甘草8 g，将药材以1∶1.5（g∶mL）的料液比，利用体积分数为75%的乙醇在37℃条件下浸提12 h，并在70℃的条件下回流5h，经过滤、在温度50℃条件下进行真空浓缩，用绍兴黄酒作为酒基，用浸提液勾兑成8度的功能性黄酒，测定功效成分含量，并进行试验。
1.3.2 小鼠建模实验
将小鼠饲养在洁净的环境中，环境温度稳定在（22±2）℃，保持12 h的白天和夜晚循环饲养，经过1周的适应性饲养后进行相关的免疫学实验。取60只ICR小鼠，12只一组进行实验。
建模组和给药组小鼠进行环磷酰胺[19-20]建模处理，模型1：腹腔注射环磷酰胺，剂量80 mg/kg体质量，连续注射3 d，在试验的第11、12、13天，皮下注射环磷酰胺，剂量80 mg/kg体质量。在试验的第21、22、23天后再强化一次，即皮下注射环磷酰胺，剂量80 mg/kg体质量。模型2：腹腔注射环磷酰胺剂量40 mg/kg体质量连续7 d，停用环磷酰胺3 d，然后再用以同样的方法强化（即腹腔注射环磷酰胺剂量40 mg/kg体质量连续7 d，停用环磷酰胺3 d）。
给药实验，于环磷酰胺实验处理后分别于第9、10、11天和第19、20、21天后再强化一次。每周称质量一次，记录死亡情况。按体质量进行给药（功能性黄酒喂食），各组给药剂量为小鼠体质量×10 mL/kg，给药30 d。
1.3.3 分析检测
（1）小鼠体质量的测定
通过对不同实验组进行处理，每星期对小鼠进行称质量，记录试验数据。
（2）小鼠免疫器官的测定
末次给药24 h后，脊椎脱臼处死小鼠，及时取出小鼠的胸腺、脾脏、肾脏、肝脏，生理盐水冲洗后，用滤纸吸干水分，进行称质量，按下列公式计算胸腺指数、脾脏指数、肾脏指数、肝脏指数：
式中：I为胸腺指数/脾脏指数/肾脏指数/肝脏指数；W1为胸腺/脾脏/肾脏/肝脏质量，mg；W0为小鼠体质量，g。
（3）小鼠血浆中免疫球蛋白M含量测定
动物眼眶采血，放在非抗凝血试管中，室温静置2 h后，2 500 r/min离心10 min，取上清，测定免疫球蛋白M（immunoglobulin M，IgM）。采用ELISA法进行测定，具体操作均按照试剂盒说明书处理。
（4）小鼠血浆中T细胞分型的测定
动物眼眶采血，放在抗凝血试管中，按说明书处理后，流式细胞仪测定T淋巴细胞亚细胞群分化簇3（cluster of differentiation3，CD3）、分化簇 4（cluster of differentiation 4，CD4），分化簇 8（cluster ofdifferentiation8，CD8）。具体步骤如下：取500 μL血浆至细胞流式管，加入2 mL红细胞裂解液，静置10 min，然后加入磷酸盐缓冲液至流式管顶部，2 000 r/min离心10 min。弃去上清液，再次加入2 mL红细胞裂解液，静置10 min，然后加入磷酸盐缓冲液至流式管顶部，2 000 r/min离心10 min。看红细胞裂解程度，是否需要再次裂解。全程放在低温环境中操作。最后一次弃去上清液，沉淀加入100微升磷酸盐缓冲液，各加10 μLCD3、CD4、CD8鼠抗人荧光单克隆抗体，4℃避光放置30 min。然后加入磷酸缓冲液至流式管刻度稍微以下，2 000 r/min离心10 min。离心结束后，弃去上清液，再加入100 μL的磷酸缓冲液。通过荧光单克隆抗体对组织细胞内抗原进行定性、定量，在流式细胞仪上计数1×105个/kg以上细胞，分别记录T淋巴细胞（CD3+），辅助诱导T淋巴细胞（CD3+CD4+），抑制细胞毒T淋巴细胞（CD3+CD8+）以及T辅助细胞/T抑制细胞（CD4+/CD8+）表达的阳性率。
1.3.4 数据处理及分析
采用Origin 8.5软件、Excel和SPSS 17.0统计软件进行作图和差异显著性分析。所有的数据都以“平均值±标准偏差”表示，P＜0.05时表示差异显著。
2 结果与分析
2.1 功能性黄酒成分
功能性黄酒是指以黄酒为基酒，通过添加特定中草药成分的萃取浓缩液而形成的一种新型黄酒，使其能够增强机体免疫力，改善人体亚健康，但不以治疗为目的[5]。黄芪、麦冬、甘草、生晒参、五味子均记载于《中国药典》[21]，且允许用于保健食品。通过《中国药典》推荐摄入量查询以及问询中医，确定了功能性黄酒的基本配方见表1。
表1 人体推荐摄入量和功能性黄酒配方
Table1 Recommended intake and functionalHuangjiuformula
注：推荐日饮量250～500 mL。
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依据表1功能性黄酒配方，对该功能性黄酒中的功效成分进行检测，通过已有的检测方法[22-25]，进行总皂苷、总多糖、总多酚、总黄酮的含量测定，结果见表2。
表2 功能性黄酒中功效成分含量
Table2 Content of functional components in functionalHuangjiu
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由表2可知，功能性黄酒中含有皂苷、多糖、多酚及黄酮等功效成分。
2.2 小鼠建模结果
通过环磷酰胺作为免疫抑制剂建立免疫抑制模型的实验方法，对小鼠进行建模处理，建立不同的免疫抑制模型以验证不同处理组的免疫提升效果，建模结果见表3。
表3 小鼠建模及处理方法
Table3 Modeling and treatment methods of mice
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由表3可知，空白对照组：8度空白黄酒；模型组1：在造模基础上，喂食8度空白黄酒；模型组2：在造模基础上，喂食8度空白黄酒；给药组1（模型组1+药物）：在造模基础上，喂食药酒。药酒酒精度8度，生药量0.91 g/mL；给药组2（模型组1+药物）：在建模基础上，喂食药酒。药酒酒精度8度，生药量0.91 g/mL。
2.3 不同造模模型对小鼠体质量的影响
小鼠体质量变化是小鼠免疫力的最直观的体现。实验30 d后，对实验小鼠进行称质量，每周小鼠的体质量变化见表4。
由表4可知，从第二周开始造模组小鼠的体质量均低于空白组小鼠体质量，存在显著性差异（P＜0.05），说明通过环磷酰胺处理，小鼠的免疫功能遭到抑制，实验建模成功。对比给药1组和给药2组可知，在给药1组的条件下，免疫恢复效果要好于给药2组。且给药2组与模型组相比，体质量反而减少，可能是由于模型2组造模程度太深，这与宋雁等[19]研究结果相似。
表4 不同建模模型对小鼠体质量的影响
Table4 Effects of different modeling models on body mass of mice
注：“*”为各组与空白组比较，“#”为给药组与阴性对照组比较；“*，#”表示对结果影响显（P＜0.05）；“**，##”表示对结果影响极显著（P＜0.01）。
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2.4 不同建模模型对小鼠免疫器官指数的影响
胸腺指数和脾脏指数是与免疫相关的主要脏器指数[26-27]。实验30 d后，对小鼠进行解剖，取下小鼠的脾脏、胸腺、肝脏和肾脏进行称质量，结果分别见图1和图2。
图1 不同建模模型对小鼠胸腺和肝脏指数的影响
Fig.1 Effects of different modeling models on thymus and liver indexes of mice
“*”为各组与空白组比较，“#”为给药组与模型组比较；“*，#”表示对结果影响显著（P＜0.05）；“**，##”表示对结果影响极显著（P＜0.01）。下同。
图2 不同建模模型对小鼠肾脏与脾脏指数的影响
Fig.2 Effects of different modeling models on kidney and spleen indexes of mice
由图1和图2可知，模型1组和给药1组的胸腺指数与空白组相比，分别降低了54.27%和46.34%，并且存在显著性差异（P＜0.05）；模型2组和给药2组的脾脏指数和胸腺指数与空白组相比，脾脏指数分别增加了157.25%和113.99%，胸腺指数分别降低了24.34%和41.46%，并且存在显著性差异（P＜0.05）。给药1组和模型1组相比，给药组的脾脏指数和胸腺指数分别增加了28.78%和17.33%，说明给药组较模型组对小鼠的免疫器官有改善作用，且趋势靠近空白组；给药2组和模型2组相比，给药组的脾脏指数和胸腺指数无显著性变化（P＞0.05），但是都有一定程度的降低，分别降低了17.17%和25.01%，并且趋势远离空白组。造模组的肝脏指数和肾脏指数与空白组相比，无明显变化（P＞0.05）。综上结果表明，在模型1的基础上，给药组对小鼠的免疫器官具有一定的改善作用；在模型2的基础上，给药组对小鼠的免疫器官无改善作用。这说明小鼠的免疫机制破坏程度加大，给药组已失去提高免疫力的作用。
2.5 不同建模模型对小鼠血浆中免疫球蛋白M含量的影响
免疫球蛋白M（IgM）主要分布在血液中，在机体免疫反应中出现最早，具有强大的抗感染作用。不同造模模型对小鼠血浆中IgM含量测定结果见图3。
图3 不同建模模型对小鼠血浆中免疫球蛋白的影响
Fig.3 Effects of different modeling models on immunoglobulin in mice plasma
由图3可知，造模组与空白组相比，小鼠血浆中免疫球蛋白M含量分别降低了50.37%、38.21%、162.90%、和69.25%，并且存在显著性差异（P＜0.05）。给药1组的IgM含量与模型1组相比，增加了24.49%，说明给药组较模型组对小鼠的免疫器官有改善作用，且趋势靠近空白组；给药2组的I gM含量与模型2组相比，减少了19.16%，不存在显著性差异（P＞0.05）。综上所述，在模型1的基础上，给药组对小鼠产IgM具有一定的调节作用；在模型2的基础上，给药组对小鼠产IgM无明显调节作用。
2.6 不同造模模型对小鼠血浆中T细胞分型的影响
通过实验分别对T淋巴细胞（CD3+），辅助诱导T淋巴细胞（CD3+CD4+），抑制细胞毒T淋巴细胞（CD3+CD8+）以及T辅助细胞/T抑制细胞（CD4+/CD8+）进行测定，不同造模模型对小鼠血浆中T细胞分型的影响结果分别见图4和图5。
图4 不同造模模型对小鼠血浆中T细胞分型（CD3+、CD3+CD4+）的影响
Fig.4 Effect of different modeling models on T cell typing(CD3+、CD3+CD4+)in mice plasma
图5 不同造模模型对小鼠血浆中T细胞分型（CD3+CD8+、CD4+/CD8+）的影响
Fig.5 Effect of different modeling models on T cell typing(CD3+CD8+、CD4+/CD8+)in mice plasma
由图4可知，与空白组相比，模型1组、给药1组、模型2组、给药2组的CD3+CD4+含量分别增加了7.45%、6.44%、6.72%和8.46%，并且存在极显著性差异（P＜0.01）。由图5可知，与空白组相比，模型1组、给药1组、模型2组、给药2组的CD3+CD8+含量分别降低了22.08%、19.53%、30.27%和32.23%，并且存在极显著性差异（P＜0.01）；与空白组相比，模型1组、给药1组、模型2组、给药2组的CD4+/CD8+比值分别增加了34.07%、27.88%、46.46%和54.42%，并且存在极显著性差异（P＜0.01）。给药1组的CD3+含量、CD3+CD4+含量、CD3+CD8+含量、CD4+/CD8+比值与模型1组相比，分别降低了0.94%，增加了3.27%，降低了4.62%，虽然都不存在显著性差异（P＞0.05），但是给药组数据更接近空白组；给药2组的CD3+含量、CD3+CD4+含量、CD3+CD8+含量、CD4+/CD8+比值与模型2组相比，分别增加了1.63%，减少了2.81%，增加了5.44%，但是都不存在显著性差异（P＞0.05）。
结果表明，在模型1的基础上，给药组对小鼠血浆中T细胞分型含量具有一定的调节作用；在模型2的基础上，给药组对小鼠血浆中T细胞分型含量没有明显的调节作用。
3 结论
通过动物实验的体质量、免疫器官指数、血浆中免疫球蛋白M、血浆中T细胞分型等指标对小鼠建模模型进行验证。与空白组相比，两个模型组小鼠的体质量、免疫器官指数、免疫球蛋白M、血浆中T细胞含量都有显著性的变化，说明本试验的两个建模成功。给药1组与模型1组相比，免疫器官指数增加，IgM含量增加，CD4+/CD8+比值降低，且给药组的数据较模型组更接近于空白组，说明给药组对小鼠免疫具有一定的调节作用；给药2组与模型2组相比，体质量降低，免疫器官指数降低，IgM含量降低，CD4+/CD8+比值增加，说明造模程度深，小鼠的免疫调节能力破坏大，无法恢复。但是通过给药1组和模型1组的数据对比，可以验证得到该配方具有调节免疫力的功能。综上，本研究免疫功能调节验证试验探索出了较优造模模型，即模型组1。并且由模型组1的建模试验结果证明，功能性黄酒具有提高机体免疫力的功能。
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