椰子（Cocos nucifera），是一种单子叶被子植物，属棕榈科椰子属，植株高大，具有较高营养与药用价值[1]。椰子在增强机体免疫力、预防心血管疾病、促进矿物质、维生素和氨基酸吸收等方面具有明显效果[2-3]，如：椰子所富含的维生素E（vitamin E，VE）能保持女性青春活力，镁可改善老年人的循环系统[4-5]。目前，各种酸奶的研制主要集中在以牛乳作为主要原料或牛乳与其他物质进行复配、工艺条件优化、发酵菌种等方面[6]，对主要原料的改进与创新方面的研究较少，且仅利用椰浆作为原料发酵的酸奶仍是空白。
响应面分析法（response surface methodology，RSM）是通过对回归方程的分析、优化工艺参数预测响应值的一种统计方法，该方法可以反应出不同因素之间对试验结果的交互影响，弥补了普通正交优化法仅考虑单因素对试验结果的影响[7-8]。因此，本研究以椰浆作为原料发酵凝固型椰奶，在单因素试验的基础上采用响应面法对其发酵工艺条件进行优化，旨在获得凝固型发酵椰奶的最佳工艺参数，并对产品的感官、理化、微生物指标进行测定，为凝固型椰奶的实际生产提供理论依据。
1 材料与方法
1.1 材料与试剂
佳乐椰浆：SAMBU集团；直投式发酵剂（directed vat set，DVS）Y428A、Y439B、Y429A：上海昊岳食品科技有限公司；脱脂奶粉：太子奶集团生物科技有限责任公司；果胶（食品级）：厚满生物科技（上海）有限公司；海藻酸丙二醇酯（propylene glycol alginate，PGA）（食品级）：郑州亿之源化工产品有限公司；白砂糖（食品级）：长沙尚杰食品有限公司。
1.2 仪器与设备
GZ-400-S生化培养箱：韶关市广智科技设备有限公司；SW-CJ-2D双人单面垂直净化工作台：苏州博莱尔净化设备有限公司；GJJ-0.03/100均质机：上海诺尼轻工机械有限公司；NDJ-8S数显粘度计：上海舜宇恒平科学仪器有限公司。
1.3 方法
1.3.1 凝固型发酵椰奶的制备
操作要点：
调配：向椰浆中加入果胶、PGA以及白砂糖，然后加水至所需用量，混合搅拌均匀，制备成椰奶，备用。
预热与均质：椰奶在温度为60 ℃、压力为25 MPa的条件下进行一级均质处理2～3次[9]。
杀菌与冷却：将上述椰奶在温度为95 ℃条件下杀菌25 min，然后冷却至35 ℃左右，备用[10]。
发酵剂的制备：配制0.12 g/mL的脱脂牛奶液100 mL，并在95 ℃的条件下灭菌25 min；然后在无菌条件下，称取0.5 g的直投式发酵剂，加入到杀菌冷却后的脱脂牛奶液中，混合并搅拌均匀，放入0～4 ℃的冰箱中冷藏保存，待用。
接种与发酵：在35 ℃左右的无菌条件下，将所制备发酵剂加入到椰奶中，然后在一定温度条件下发酵7～12 h，达到凝固状态，酸度为55～65°T时即为发酵终点。
冷却与后熟：将恒温发酵后的产品迅速冷却至10 ℃以下，放入0～4 ℃的冰箱冷藏后熟24 h[11]。
1.3.2 凝固型发酵椰奶工艺优化单因素试验
按照方法1.3.1的工艺流程制备凝固型发酵椰奶，以感官评分、黏度和酸度达到60°T所需时间为响应指标，采用单因素轮换法依次考察椰浆添加量（80%、85%、90%、95%、100%）、直投式发酵剂类型（Y428A、Y439B、Y429A）、发酵剂添加量（1%、2%、3%、4%、5%）、发酵温度（37 ℃、39 ℃、41 ℃、43 ℃、45 ℃）对凝固型发酵椰奶的影响。发酵初始条件为发酵温度41 ℃、直投式发酵剂Y439B、发酵剂用量2%。
1.3.3 凝固型发酵椰奶工艺优化响应面试验
在单因素试验的基础上，选取对感官评分影响显著的3个因素，利用Box-Behnken试验设计与分析进行3因素3水平响应面优化[12]。
1.3.4 凝固型发酵椰奶质量的测定
在最佳优化工艺条件下制备凝固型发酵椰奶，对其进行感官评价并测定其黏度、滴定酸度、持水力及相关微生物指标。
（1）感官评价
以色泽、组织状态、滋味、气味为感官评价指标。邀请10名经过感官评价训练的人进行评价，满分为100分，感官评分标准[13-14]见表1。
表1 凝固型发酵椰奶感官评分标准
Table 1 Sensory evaluation standards of set-style fermented coconut milk
级别 色泽（10分） 风味（20分） 滋味（30分） 组织状态（40分）一级二级三级均匀乳白，光洁度高（9～10）色浓，光洁度略差（6～8）色淡，光洁度略差（3～5）有椰子固有的香气，气味浓郁且协调，无其他异味（15～20）有椰子固有的香气，气味略淡，无异味（10～14）几乎无椰子固有的香气，有异味产生（5～9）具有酸奶特有的口感，酸甜适中（25～30）具有典型酸奶的口感，稍酸或甜（16～24）风味不协调，过酸或甜（10～15）组织细腻，表面无色变、龟裂等现象，质地均匀，粘稠适度，无乳清析出（36～40）组织略不均匀、质地均匀、粘稠适度，有少量乳清析出（31～35）组织不均匀，表面变色、龟裂等现象，乳清析出比较多（25～30）
（2）理化指标
黏度：样品发酵8 h并后熟24 h之后立即用NDJ-8S数显粘度计在室温条件下，采用3号转子，固定转速12 r/min测定其粘度。酸度达到60°T所需时间：样品发酵4 h后，开始每隔0.5 h测定其酸度，直至酸度达到（60±1）°T为止，记录其时间；其中酸度的测定根据国标GB/T 5009.239—2016《食品安全国家标准食品酸度的测定》测定[15]。持水力：样品发酵8 h并后熟24 h之后，称取5 g样品，4 000 r/min条件下离心10 min，静置10 min，除去透明液体，测残余物的质量，计算持水力，其计算公式如下：
式中：m代表残余物的质量，g；m0代表样品的质量，g。（3）微生物指标的测定
参照国标GB 4789.2—2016《食品安全国家标准食品微生物学检验菌落总数测定》测定其菌落总数、乳酸菌数和嗜热链球菌数[16]。
1.3.5 数据分析
采用Excel 2010软件进行统计分析；采用Design-Expert V8.0.5进行响应面结果分析；采用OriginPro8.5软件作图。
2 结果与分析
2.1 单因素试验结果
2.1.1 椰浆添加量对凝固型发酵椰奶品质的影响
由图1可知，随着椰浆添加量的增加，凝固型发酵椰奶的感官得分先升高后降低，而发酵椰奶的黏度则先增加后趋向稳定。当椰浆添加量为95%时，凝固型发酵椰奶的感官得分最高（83.6分），此时黏度趋于稳定（5 800 mPa·s），同时，酸度到达60°T所需时间相对较短（7 h）。分析原因可能是椰浆浓度越高，椰子固有风味随之增加，但过高反而掩盖了发酵特有风味；而且椰浆的添加量决定着发酵椰奶的黏度，椰浆浓度越低黏度也越低。综上所述，选择最优椰浆用量为95%。
图1 椰浆添加量对凝固型发酵椰奶品质的影响
Fig. 1 Effect of coconut milk addition on the quality of set-style fermented coconut milk
2.1.2 直投式发酵剂类型对发酵椰奶品质的影响
由图2可知，不同类型的直投式发酵剂对凝固型发酵椰奶的感官品质影响较小（P＞0.05），而对发酵椰奶的黏度影响较大（P＜0.05）。当直投式发酵剂的型号为Y429A时，凝固型发酵椰奶的感官得分最高（82分），黏度也相对较高（5 975 mPa·s），酸度到达60°T所需时间最短（7 h）；而当直投式发酵剂类型为Y439B时，虽然黏度最高（6 030 mPa·s）、酸度到达60°T所需时间相对较短（7.5 h），但感官得分最低（78.7分），所以选择最佳直投式发酵剂的型号为Y429A。
图2 直投式发酵剂类型对凝固型发酵椰奶品质的影响
Fig. 2 Effect of the types of DVS on the quality of set-style fermented coconut milk
2.1.3 发酵剂添加量对发酵椰奶品质的影响
由图3可知，发酵剂添加量对凝固型发酵椰奶的感官品质影响显著（P＜0.05），而对发酵椰奶的黏度影响较小（P＞0.05）。当发酵剂添加量为3%时，凝固型发酵椰奶的感官得分达到最高（84.8分），此时酸度到达60°T所需时间也相对较短（7 h）。分析原因可能是发酵剂添加量较低时，相同温度下发酵速度相对较慢，特有风味还未产生；而当发酵剂添加量过高时，产酸速度过快，相同时间内使得凝固型发酵椰奶过酸，影响其滋味。综合分析，当发酵剂添加量为3%时，发酵椰奶酸甜可口，组织状态稳定，此时效果最佳，因此，选择最佳发酵剂添加量为3%。
图3 发酵剂添加量对凝固型发酵椰奶品质的影响
Fig. 3 Effect of starter addition on the quality of set-style fermented coconut milk
2.1.4 发酵温度对凝固型发酵椰奶品质的影响
由图4可知，发酵温度对凝固型发酵椰奶的感官品质和黏度都有显著影响（P＜0.05）。当发酵温度为39 ℃时，凝固型发酵椰奶的感官得分（90分）和黏度（7 185 mPa·s）最高，且酸度达到60°T的所需时间相对较短（7 h）。分析原因可能是温度过高或过低都会影响微生物的生长，从而影响其发酵性能，使得产酸能力下降。综合分析，最优发酵温度为39 ℃。
图4 发酵温度对凝固型发酵椰奶品质的影响
Fig. 4 Effect of fermentation temperature on the quality of set-style fermented coconut milk
2.2 Box-Behnken试验结果与分析
2.2.1 模型的建立及显著性检验[17-18]
在单因素试验的基础上，采用直投式发酵剂Y429A，以感官评分（Y）为响应值，以对凝固型发酵椰奶影响显著的3个因素椰浆添加量（X1）、发酵剂添加量（X2）和发酵温度（X3）为考察因素，Box-Behnken试验因素与水平见表2，试验结果与分析见表3。
表2 凝固型发酵椰奶发酵条件优化Box-Behnken试验因素与水平
Table 2 Factors and levels of Box-Behnken experiments for fermentation conditions optimization of set-style fermented coconut milk
因素 -1 0 1 X1椰浆添加量/%X2发酵剂添加量/%X3发酵温度/℃90 2 37 95 3 39 100 4 41
表3 凝固型发酵椰奶发酵条件优化Box-Behnken试验结果与分析
Table 3 Results and analysis of Box-Behnken experiments fermentation conditions optimization of set-style fermented coconut milk
序号 X1 X2 X3 Y 感官得分/分1234567891 0 11 12 13 14 15 16 17 90 95 95 90 100 95 100 90 100 90 95 95 100 95 95 95 95 33322234333344243 37 39 39 39 39 41 37 39 41 41 39 39 39 41 37 37 39 82.33 86.23 85.89 82.14 83.75 82.51 82.77 83.43 83.36 83.19 86.00 86.13 83.69 83.53 82.56 82.32 86.33
运用Design expert V8.0.5软件对表3中得分进行拟合，得回归方程：
对上述回归方程进行方差分析，结果表见表4。
表4 响应面试验结果方差分析
Table 4 Variance analysis of response surface experiments results
注：“*”表示对结果影响显著（P＜0.05）；“**”表示对结果影响极显著（P＜0.01）。
方差源 平方和 自由度 均方 F 值 P 值 显著性模型 ＜0.000 1 X1X2X3 0.006 1 38.60 0.77 0.51 0.85 0.46 0.02 0.40 7.57 9.77 14.61 0.36 0.23 0.12 38.96 9.00 1.00 1.00 1.00 1.00 1.00 1.00 1.00 1.00 1.00 7.00 3.00 4.00 16.00 4.29 0.77 0.51 0.85 0.46 0.02 0.40 7.57 9.77 14.61 0.05 0.08 0.03 83.91 15.04 9.88 16.66 8.91 0.36 7.77 148.02 191.07 285.91 0.016 3 0.004 7*******X1X20.020 4 X1X30.569 2 X2X30.027 0 X12＜0.000 1* * **X22＜0.000 1 X32＜0.000 1****残差失拟项误差项总和2.53 0.195 8 R2Adj=0.979 0信噪比（S/N）=22.53
由表4可知，所建立模型的P＜0.000 1，显著；失拟项P＞0.05，不显著，表明模型具有较高可靠性；调整决定系数R2Adj=0.979 0，表明凝固型发酵椰奶感官得分的变化有97.90%来源于椰浆添加量、发酵剂添加量和发酵温度；信噪比（signal-to-noise，S/N）=22.53＞4，也从另一个方面表明此模型是可靠的。经方差分析，3个因素对凝固型发酵椰奶影响的主次顺序为X1＞X3＞X2，即椰浆添加量＞发酵温度＞发酵剂添加量。其中，一次项X1和X3对结果影响极显著（P＜0.01），X2对结果影响显著（P＜0.05）；交互项X1X2和X2X3对结果影响显著（P＜0.05），X1X3对结果影响不显著（P＞0.05）；二次项X12、X22和X32对结果影响极显著（P＜0.01）。
2.2.2 响应面分析[19-20]
椰浆添加量、发酵剂添加量和发酵温度交互作用对凝固型发酵椰奶感官评分影响的响应面曲线及等高线见图5。
图5 各因素交互作用对凝固型发酵椰奶感官品质影响的响应面和等高线
Fig. 5 Response surface plots and contour line of effects of interaction between each factor on sensory quality of set-style fermented coconut milk
由图5可知，当固定发酵温度时，随着椰浆添加量和发酵剂添加量的增大，凝固型发酵椰奶的感官得分都是呈现先增加后降低的趋势，椰浆添加量在93.90%～97.10%和发酵剂添加量在2.70%～3.40%的范围内较适合；等高线呈闭合的椭圆形且响应面呈凸形，表明椰浆添加量和发酵剂添加量交互作用较强且有最大值。当固定发酵剂添加量时，随着椰浆添加量和发酵温度的增大，凝固型发酵椰奶的感官得分都是呈现先增加后降低的趋势，椰浆添加量在93.90%～97.10%和发酵温度在38.50～39.60 ℃的范围内较适合；响应面呈凸形，表明椰浆添加量和发酵温度交互作用有最大值。当固定椰浆添加量时，随着发酵剂添加量和发酵温度的增大，凝固型发酵椰奶的感官得分都是呈现先增加后降低的趋势，发酵剂添加量在2.70%～3.40%，发酵温度在38.50～39.60 ℃的范围内较适合；等高线呈闭合的椭圆形且响应面呈凸形，说明发酵剂用量和发酵温度交互作用较强且有最大值。上述分析和表4中的显著性一致。
利用Design Expert 8.0.5软件对所得的回归方程进行逐步回归，确定最佳工艺参数为椰浆添加量95.52%、发酵剂添加量3.08%、发酵温度39.19 ℃，此时凝固型发酵椰奶的感官得分预测值为86.16分。为了便于实际操作，将最佳工艺参数修订为椰浆添加量95%、发酵剂添加量3%、发酵温度39 ℃，在此最优条件下，凝固型发酵椰奶的感官得分为85.3分，与模型预测值（86.16分）较一致，验证了模型的可靠性。
2.3 凝固型发酵椰奶质量分析
感官指标：在最佳工艺条件下所得凝固型发酵椰奶为纯白色，色泽均一，口感细腻柔和、酸甜适中，具有椰子和发酵乳融合的特有风味，质地稳定均一、无杂质及分层，表面光滑。
理化指标：黏度为6 720 mPa·s，滴定酸度为62.1°T，持水力为62.53%。
微生物指标：菌落总数为5.55×105 CFU/g，乳酸菌数为5×105 CFU/g，嗜热链球菌数为3×104 CFU/g，微生物指标符合相关国标要求。
3 结论
本研究以椰浆作为原料，以感官评分为响应值，通过单因素试验和响应曲面法确定凝固型发酵椰浆的最佳工艺参数：椰浆添加量95%、发酵剂类型Y429A、发酵剂添加量3%、发酵温度39 ℃。在此最优条件下制备的凝固型发酵椰奶感官得分为85.3分，所得产品为纯白色，色泽均一，口感细腻柔和、酸甜适中，具有椰子和发酵乳融合的特有风味，质地稳定均一、无杂质及分层，表面光滑。黏度为6 720 mPa·s，滴定酸度为62.1°T，持水力为62.53%，微生物指标符合相关国标要求。为发酵椰奶的实际生产提供了理论依据。
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