目前，市面上大部分的乳酒都是以马奶或羊奶为原料，传统的乳酒是在鲜奶中加入天然发酵剂，经自然发酵形成，但因传统的生产工艺制约，使乳酒产品的质量经常出现不稳定的现象[1-4]。随着消费者对健康食品要求的不断提高，市场急需将这种传统饮品工业化生产，其中发酵剂在乳酒的加工过程中起着至关重要的作用[5-8]。根据文献报道，制备乳酒时使用两种及两种以上菌种可以提高产品质量，当酵母菌联合乳酸菌，且酵母菌与乳酸菌的比例为2∶1时，乳酒的品质得到明显提升[9-12]。开菲尔菌是传统发酵奶制品开菲尔的发酵剂，开菲尔不仅有着与普通酸牛奶同样的营养价值，而且具有一定的保健功能[13-16]。
复合型发酵酒是使用两种或两种以上的酿酒原料发酵而成的酒品，其能综合两种或两种以上原料的特点与优势，弥补利用单一原料酿酒在色、香、味上的欠缺和营养成分不足等缺陷[17-18]。因复合型发酵酒利用了多种酿造原料，并采用先进的酿造工艺，使其风味独特，深受消费者的喜爱[8，16-18]。咖啡风味浓郁，具有独特的花香味、果香味、草香味且功效独特，正在逐步成为时下的流行饮品[19-21]。
因此，本试验以开菲尔菌（Kefir）与酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）为发酵剂，通过咖啡与牛奶混合发酵酿造乳酒，利用单因素试验及响应面试验对其发酵工艺进行优化，以期酿出的酒体风味突出、口感幼滑、酸度适中的咖啡乳酒，为工业化生产提供一定的理论基础。
1 材料与方法
1.1 材料与试剂
开菲尔菌、酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）沪酿2.069：宜宾职业技术学院菌种保藏中心；咖啡（雀巢）、纯牛奶（伊利）、白砂糖：宜宾大润发超市；冰乙酸、乙酸钠、柠檬酸、柠檬酸钠、磷酸氢钠、氢氧化钠（均为分析纯）：湖北鑫润德化工有限公司；亚硫酸钠（分析纯）：南京试剂有限公司；硫酸铜、酒石酸钾钠（均为分析纯）：无锡市亚泰联合化工有限公司；次甲基蓝（指示剂）：天津市福晨化学试剂厂。
1.2 仪器与设备
FA20043型电子天平：上海越平科学仪器有限公司；LXJ-IIB低速大容量多管离心机：郑州长城工贸有限公司；MC-GNP-9080系列隔水式恒温培养箱：青岛明成环保科技有限公司；DSX-280A型不锈钢手提式灭菌器：上海申安医疗器械厂；KL-30-10000型乳化均质机：上海科劳机械设备有限公司；BCD-2HBSA型电冰箱：青岛海尔股分有限公司；PHs-3c型精密pH计：上海理达仪器厂；AT6000型酒精度测试仪：意大利盖博分析仪器公司。
1.3 方法
1.3.1 咖啡乳酒酿造工艺流程及操作要点
牛奶、咖啡、白砂糖、亚硫酸钠→搅拌→过滤→加热→均质→杀菌→冷却→接入开菲尔菌与酿酒酵母→发酵→后熟→成品
操作要点：在牛奶中添加一定比例的咖啡、白砂糖及0.02%的亚硫酸钠，利用柠檬酸盐缓冲液调节pH值为6.5，搅拌至白砂糖完全溶解，过滤后加热至55～65 ℃，采用乳化均质机（压力为15 MPa）均质，均质后在90～95 ℃条件下加热杀菌5 min；待样品冷却后，在无菌条件下接入一定量的经活化后的酵母菌悬液和1%的开菲尔菌，25 ℃条件下发酵，待发酵完成后置于4 ℃的冰箱中后熟24 h。
1.3.2 理化指标测定方法[22]
总糖含量（以葡萄糖计）测定：斐林试剂法；酒精度测定：密度瓶法；总酸含量测定：电位滴定法；氨基酸态氮含量测定：甲醛滴定法。
1.3.3 感官评价
感官评价在学院食品品评室内完成，邀请13位教师及实验员组成评定小组，明确感官评定的指标和注意事项。参照王璐等[2]及GB/T 23546—2009《奶酒》[22]从色泽、组织形态、香气、滋味、典型性5个方面制定咖啡乳酒感官评价标准，满分为100分，评价标准如表1所示。
表1 咖啡乳酒的评分标准
Table 1 Evaluation standards of coffee koumiss
项目 分值/分 评分标准色泽（5分）组织形态（5分）＞4.5 4.0～4.4 3.5～3.9 3.0～3.4＞4.5 4.0～4.4 3.5～3.9 3.0～3.4褐黄，晶莹透彻，悦目协调黄褐色，澄清透亮深黄色，酒体浑浊与该产品应有的色泽不符澄清透明、有光泽澄清透明、无明显悬浮物澄清，无夹杂物微浑，失光
续表
项目 分值/分 评分标准香气（30分）＞27 24～26 21～23 18～20具有天然的奶香、发酵醇香和咖啡香，香气协调，令人愉悦有奶香或发酵香，咖啡香淡雅不冲突，无异香奶香和发酵香微弱，无异香无奶香和发酵香，无咖啡香或咖啡香过于突出，不协调＞36滋味（40分）32～35 28～31 24～27润滑刹口，口味纯正、鲜爽，酒体丰满，醇厚协调，余味长口味较为纯正、鲜爽，酒体较丰满、醇厚，无涩味和苦味，余味较长刹口力差，口味较纯正、鲜爽，酒体圆润，涩味或苦味较重，无余味不刹口，口味不纯正，涩味或苦味很重，有异味典型性（20分）＞18 16～17 14～15 12～13风格独特，优雅无缺典型明确，风格良好有典型性，不够怡雅有明显缺陷
1.3.4 咖啡乳酒发酵工艺条件优化单因素试验
白砂糖添加量对咖啡乳酒感官品质的影响：在牛奶中加入1.2%的咖啡后煮沸，分别加入4%、6%、8%、10%、12%的白砂糖，加入0.02%的亚硫酸钠，待冷却后接入0.3%的酿酒酵母及1%的开菲尔菌，25 ℃条件下发酵4 d后分别记录咖啡乳酒的感官特征，以确定最佳的白砂糖添加量。
同理，依次考察咖啡添加量（0、0.4%、0.8%、1.2%、1.6%、2.0%）、酿酒酵母接种量（0.1%、0.2%、0.3%、0.4%、0.5%）及发酵时间（2 d、3 d、4 d、5 d、6 d）对咖啡乳酒感官评分的影响，以确定较佳的咖啡添加量、酿酒酵母接种量、发酵时间。
1.3.5 咖啡乳酒发酵工艺条件优化响应面试验
在单因素试验的基础上，选取白砂糖添加量（A）、咖啡添加量（B）、酿酒酵母接种量（C）、发酵时间（D）为考察因素，以感官评分（Y）为评价指标，根据Box-Benhnken的中心组合试验设计原理，进行4因素3水平的响应面分析试验，确定咖啡乳酒最佳的发酵工艺条件，因素与水平见表2。
表2 咖啡乳酒发酵工艺条件优化响应面试验因素与水平
Table 2 Factors and levels of response surface experiments for fermentation process optimization of coffee koumiss
水平 A 白砂糖添加量/%D 发酵时间/d-1 B 咖啡添加量/%C 酿酒酵母接种量/%8 0 1 10 12 0.8 1.2 1.6 0.3 0.4 0.5 2 3 4
1.3.6 数据分析处理方法
以上每个试验重复3次，结果取平均值。采用OriginPro 9.1软件进行数据制图和统计分析。采用Design Expert 8.0.6软件进行响应面设计及结果分析。
2 结果与分析
2.1 咖啡乳酒发酵工艺条件优化单因素试验结果
图1 白砂糖添加量对咖啡乳酒感官评分的影响
Fig. 1 Effect of sugar addition on sensory evaluation of coffee koumiss
2.1.1 白砂糖添加量对咖啡乳酒感官评分的影响由图1可知，当咖啡乳酒中白砂糖添加量从4%增加到10%时，咖啡乳酒的感官评分也随之增加；当添加量达到10%时，咖啡乳酒的感官评分达到最高分，为（83.1±1.0）分。但随着白砂糖添加量的继续增加，咖啡乳酒的感官评分开始呈现下降的趋势。糖分在咖啡乳酒发酵过程中主要转化为乙醇，也可以转化成酸类、酯类、醛类等物质[8]，咖啡乳酒在发酵过程中，可发酵性糖过少会出现酒体不丰满、香味不足的现象，可发酵性糖过多则会造成酒体酸度偏大等不良现象。故选用白砂糖添加量为8%、10%及12%用于后续响应面优化试验。
2.1.2 咖啡添加量对咖啡乳酒感官评分的影响
图2 咖啡添加量对咖啡乳酒感官评分的影响
Fig. 2 Effect of coffee addition on sensory evaluation of coffee koumiss
由图2可知，咖啡能显著改善乳酒的风味特征（P＜0.05），不仅能克服乳酒香味不够丰满的缺点，而且能赋予乳酒独特的香醇。咖啡乳酒的感官评分随着咖啡添加量的增加而呈现出先增高后降低的趋势，当咖啡添加量为1.2%时，咖啡乳酒的感官评分达到最高，为（82.5±0.7）分。因咖啡含有一定量的苦味物质，故咖啡加入量过大会导致咖啡乳酒呈现出较强的苦味，因此，当咖啡添加量适当时才能赋予咖啡乳酒特殊的风味及口感。由此选择0.8%、1.2%、1.6%的咖啡添加量进行响应面优化试验。
2.1.3 酿酒酵母接种量对咖啡乳酒感官评分的影响
图3 酿酒酵母接种量对咖啡乳酒感官评分的影响
Fig. 3 Effect of Saccharomyces cerevisiae inoculum on sensory evaluation of coffee koumiss
由图3可知，随着酿酒酵母接种量的不断增加，咖啡乳酒的感官评分也随之不断增加。当酿酒酵母接种量为0.5%时，咖啡乳酒的感官评分达到最高，为（83.5±1.0）分。酵母菌在发酵过程中能将可发酵性糖转化为二氧化碳和乙醇，同时还会产生一些醇、醛、酸、酯等香味物质[12]。当酵母菌接种量较低时，容易使酿酒原料不完全发酵，造成咖啡乳酒的酒度偏低、酒香不突出等现象。当酵母菌的接种量为0.4%时，咖啡乳酒的感官评分虽然较酿酒酵母接种量为0.5%时低，但两者并无显著性差异（P＞0.05）。所以选择酵母菌接种量为0.3%～0.5%进行响应面优化试验。
2.1.4 发酵时间对咖啡乳酒感官评分的影响
图4 发酵时间对咖啡乳酒感官评分的影响
Fig. 4 Effect of fermentation time on sensory evaluation of coffee koumiss
由图4可知，当咖啡乳酒的发酵时间为3 d时，咖啡乳酒的感官评分最高，为（87.1±0.7）分。当发酵时间＜3 d之前，可发酵性糖类还未完全被酵母菌所利用，酒体略显寡淡，香味不浓郁。当发酵时间＞3 d之后，咖啡乳酒的酸度开始逐渐增大、苦味开始逐渐变淡，破坏了酒体的风味。其原因可能是开菲尔菌在长时间发酵过程中产生了大量的乳酸，咖啡中的苦味物质被微生物逐渐分解代谢。因此，选择发酵时间为2～4 d进行响应面优化试验。
2.2 咖啡乳酒发酵工艺条件优化响应面试验结果
在单因素试验的基础上，以咖啡乳酒的感官评分（Y）为响应值，根据Box-Benhnken中心组合试验设计原理，通过Design Expert 8.0.6软件设计响应面法试验，考察白砂糖添加量（A）、咖啡添加量（B）、酿酒酵母接种量（C）、发酵时间（D）4个因素对咖啡乳酒感官评分的影响，响应面试验结果与分析见表3，方差分析见表4。
表3 咖啡乳酒发酵工艺条件优化响应面试验设计及结果
Table 3 Design and results of response surface experiments for fermentation process optimization of coffee koumiss
序号 A 白砂糖添加量/%B 咖啡添加量/%C 酿酒酵母接种量/%D 发酵时间/d Y 感官评分/分1234567891 0 0 0 -1 0 1 --1 0 0 0 -0 10 0 0 0 0 1 -1 1 0 1 0 -1 1 0 0 0 0 1 0 0 -1 100100010101000-1-1-1 11 12 13 14 15 16 17 18-1 0 1 -0 0 0 1 -10 1 1 0 -1 010000011 88.2 81.8 80.9 81.0 85.3 88.3 82.6 81.5 78.3 81.5 85.0 86.4 80.6 81.2 79.8 80.1 80.0 87.3 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 100 1 0 0 -0-1 000 --1-1-1 1-1 10110 0 0 0 -1 1 1 0 -1 000100-10 000 0 100 85.3 81.1 82.5 84.1 80.0 81.0 82.9 88.5 77.2 81.8 86.2
经Design Expert 8.0.6软件对表3中的数据进行多元回归拟合，得到咖啡乳酒感官评分的回归方程：
Y=87.52+0.38A+0.15B-0.30C+1.57D+0.97AB+0.08AC+2.25AD-0.35BC+0.62BD-2.18CD-3.32A2-2.44B2-2.92C2-2.79D2
表4 回归模型的方差分析
Table 4 Variance analysis of regression model
注：“*”表示对结果影响显著（P＜0.05），“**”表示对结果影响极显著（P＜0.01）。
方差来源 平方和 自由度 均方 F 值 P 值 显著性模型140.004 0**ABCDA B 0.486 1 0.783 6 0.584 4 0.011 1*216.92 1.76 0.27 1.08 29.45 3.80 0.022 20.25 0.49 1.56 18.92 71.42 38.72 55.24 50.61 48.23 43.21 5.03 265.16 111 1111111111 11 4 15.49 1.76 0.27 1.08 29.45 3.80 0.022 20.25 0.49 1.56 18.92 71.42 38.72 55.24 50.61 3.45 4.32 1.26 4.5 0.51 0.078 0.31 8.55 1.10 0.01 5.88 0.14 0.45 5.49 20.73 11.24 16.03 14.69 0.311 3 AC AD BC BD CD A2 B2 C2 D2残差失拟项纯误差总离差0.936 7 0.029 5*0.711 7 0.511 6 0.034 4*0.000 5 0.004 7 0.001 3 0.001 8********10 4 28 3.44 0.122 7
由表4可知，模型极为显著（P＜0.01），且失拟项检验不显著（P＞0.05），表明未知因素对试验结果的干扰较小，该试验模型充分拟合试验数据，可以用于确定咖啡乳酒酿造的最佳工艺。4个因素对咖啡乳酒感官评分影响的主次顺序依次为D＞A＞C＞B，即发酵时间＞白砂糖添加量＞酿酒酵母接种量＞咖啡添加量，其中二次项A2、B2、C2、D2对结果影响极显著（P＜0.01），一次项D和交互项AD、CD对结果影响显著（P＜0.05），其他项则对结果影响不显著（P＞0.05）。
根据咖啡乳酒感官评分回归方程得出不同因子的响应面分析图，结果见图5。
由图5可知，因素A与因素D之间以及因素C与因素D之间所形成的响应面曲面坡度在两因素交互作用响应面图中最为陡峭，即因素A与因素D以及因素C与因素D之间具有最强的交互作用。
通过Design Expert 8.0.6软件分析确定咖啡乳酒的最佳发酵工艺条件为白砂糖添加量10.49%、咖啡添加量1.26%、酿酒酵母接种量0.38%及发酵时间3.49 d，在此优化条件下，咖啡乳酒感官评分的理论值为89.0分。为便于实际操作，将咖啡乳酒的最佳发酵工艺条件修订为白砂糖添加量10.5%、咖啡添加量1.3%、酿酒酵母接种量0.4%及发酵时间3.5 d，在此最优发酵工艺条件下，验证得到咖啡乳酒的感官评分为（88.9±1.1）分，与理论值相近，证明该结果合理可靠。
图5 各因素交互作用对咖啡乳酒感官评分的响应面曲线及等高线
Fig. 5 Response surface plots and contour line of effects of interaction between each factors on sensory evaluation of coffee koumiss
2.3 理化指标分析
在最佳发酵工艺条件下得到的咖啡乳酒在的总糖含量为14.3 g/L、酒精度为3.2%vol、总酸含量为6.4 g/L、氨基酸态氮含量为0.18 g/L。咖啡乳酒的理化指标均符合国标GB/T 23546—2009《奶酒》[22]的标准。
3 结论
在单因素试验的基础上采用响应面法对咖啡乳酒的发酵工艺条件进行了优化，确定其最优发酵工艺条件：在牛奶中添加1.3%的咖啡、10.5%的白砂糖及0.02%的亚硫酸钠，搅拌至白砂糖完全溶解，过滤后加热至55～65 ℃，进入乳化均质机（压力为15 MPa）均质，均质后在90～95 ℃加热杀菌5 min，冷却后在无菌条件下接入0.4%经活化后的酿酒酵母菌悬液和1%的开菲尔菌，25 ℃条件发酵3.5 d后置于4 ℃的冰箱中后熟24 h。此优化条件下获得的咖啡乳酒的色泽褐黄透明，咖啡香、奶香与酒香和谐，酒体丰满圆润的咖啡乳酒，其感官评分为88.9分。
[1]杨同香，吴孔阳，李希琳，等.羊乳酒在发酵过程中主要参数变化的研究[J].中国酿造，2017，36（11）：88-90.
[2]王璐，李小溪，古丽娜孜，等.响应面法优化马奶酒发酵条件的研究[J].中国酿造，2014，33（2）：66-70.
[3]任志敏，陈忠军，孙子羽，等.传统发酵奶酒的研究进展[J].中国酿造，2018，37（7）：17-21.
[4]翁鸿珍，吕佳，王春龙，等.发酵奶酒新工艺的研究[J].中国酿造，2007，26（5）：81-83.
[5]GAN-OD NAMNANSUREN，徐敏，霍贵成.马奶酒发酵剂用菌种的筛选研究[J].中国酿造，2015，34（11）：95-98.
[6]MUGULA J K,NARVHUS J A,SORHAUG T.Use of starter cultures of lactic acid bacteria and yeasts in the preparation of togwa, a Tanzanian fermented food[J].Int J Food Microbiol,2003,83(3):307-318.
[7]张伟钦，妥彦峰，许倩，等.哈密马奶酒中7 株乳酸菌分离株发酵性能研究[J].塔里木大学学报，2013，25（1）：18-22.
[8]朱俊杰，吴天祥，兰洋，等.核桃奶酒的工艺优化[J].中国酿造，2016，35（3）：156-159.
[9]闵建，李理.瑞士乳杆菌与干酪乳杆菌在不同原料中的发酵特性研究[J].现代食品科技，2009，25（11）：1269-1274.
[10]王友湘，陈庆森.瑞士乳杆菌对小鼠肠道微生物区系的影响[J].食品科学，2008，29（9）：542-546.
[11]赵瑞香，王大红，牛生洋，等.超声波细胞破碎法检测嗜酸乳杆菌β-半乳糖苷酶活力的研究[J].食品科学，2006，27（1）：47-50.
[12]符桢华，王永华，于铁妹，等.酵母菌与乳酸菌混合发酵制备酸豆浆酒的研究[J].现代食品科技，2008，24（12）：1292-1295.
[13]刘慧，李平兰，王少君，等.功能性开菲尔牛奶酒最佳发酵条件的研究[J].食品科学，2004，25（10）：126-129.
[14]王颖，桑文彦，姚笛，等.开菲尔粒中产球菌样细菌素乳酸菌的分离与鉴定[J].黑龙江八一农垦大学学报，2011，23（5）：50-53.
[15]宋欢，韩燕，张晓敏，等.开菲尔发酵奶的研究进展[J].中国乳品工业，2007，35（4）：51-55.
[16]陈培康，樊远星，孔瑾.开菲尔马铃薯乳酒的研制[J].河南科技学院学报：自然科学版，2018，46（2）：29-36.
[17]刘琨毅，王琪，郑佳，等.基于HS-SPME-GC-MS 剖析三种柑橘-葡萄酒的香气成分[J].中国食品添加剂，2017（12）：72-78.
[18]黄壹杨，刘琨毅，王琪，等.基于响应面法优化红豆米酒发酵工艺的研究[J].食品与发酵工业，2018，44（5）：130-134.
[19]李莉华，吕慧，杨立刚，等.基于感官评定和电子鼻技术对天然咖啡挥发性风味特征的研究[J].食品工业科技，2014，35（14）：166-169.
[20] CHEONG M W, TONG K H, ONG J J M, et al. Volatile composition and antioxidant capacity of Arabica coffee[J].Food Res Int,2013,51(1):388-396.
[21] BHUMIRATANA N, ADHIKARI K, CHAMBERS E I. Evolution of sensory aroma attributes from coffee beans to brewed coffee[J].LWTFood Sci Tech,2011,44(10):2185-2192.
[22]中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局，中国国家标准化管理委员会.GB/T 23546—2009 奶酒[S].北京：中国标准出版社，2009.