松针（Pinus armandi Franch）为松科（Pinaceae）松属（Pinus）植物的叶，其营养成分丰富，不仅含有蛋白质、粗脂肪、粗纤维、氨基酸、矿物质、维生素，还含有酚类化合物、挥发油、莽草酸等大量活性物质，具有镇咳、祛痰、抗突变、降血脂、降血压、抗衰老、消炎抑菌等[1]作用。
酵素产品是指通过多种有益菌发酵新鲜果蔬、菌菇、中草药等得到的液态食品[2]。在发酵体系中，各物质之间的相互作用，不仅保留了发酵原液中的营养物质，而且通过微生物代谢作用产生了新的活性物质，使得产品含丰富的维生素、酶、矿物质和次级代谢产物[3]。这些活性物质能起到抗氧化[4-5]、美白[6]、增强免疫力[7]、抗肿瘤[8-9]、降胆固醇[10-11]以及改善肥胖[12-13]的功效。
酵素陈酿期间，各分子经氧化还原、酯化、缩合、聚合等一系列反应来达到最佳饮用质量[14]，从而提高酵素风味和功效。目前，对酵素的研究大部分集中在工艺优化、抗氧化能力、酶活力等方面，如蒋增良等[4]研究发现，发酵后的葡萄总抗氧化能力增强，且与发酵体系中多酚类物质的转化与代谢有关；董银卯等[5]研究了火龙果酵素的体外抗氧化能力以及酶活性，结果显示火龙果酵素具有抗氧化、防衰老、增强免疫力的功效。战伟伟等[15]优化了蓝靛果椰子复合酵素最佳工艺，此工艺得到的酵素品质指标符合国家标准；少部分聚焦于探索发酵初期营养物质的变化规律，如周偏等[16]研究了诺丽酵素自然发酵时品质的动态变化，而关于陈酿期酵素营养成分变化研究鲜有报道。本研究以4个不同陈酿期的松针酵素（不同陈酿期松针酵素的原料组成、加工工艺以及陈酿条件都保持一致）为原料，测定其主要营养成分，分析各组分在陈酿过程中的变化趋势及机理，并利用主成分分析（principal component analysis，PCA）对松针酵素进行综合评价，为进一步开展松针酵素功能性成分的动态研究及产品质量的改善提供理论参考依据。
1 材料与方法
1.1 材料与试剂
不同陈酿期（1年、2年、3年、4年）的松针酵素：湖南恩松生物科技有限公司；安琪牌葡萄酒用高活性干酵母、发酵乳杆菌（Lactobacillus fermentum）CECT5716、短双歧杆菌（Bifidobacterium breve）M-16V：中科院微生物研究所；牛血清蛋白（bovineserumalbumin，BSA）（纯度＞98%）、葡萄糖（纯度＞98%）、没食子酸（纯度＞98%）、芦丁（纯度＞98%）、抗坏血酸（纯度＞98%）标准品：上海源叶生物科技有限公司；福林酚、亚硝酸钠、硝酸铝、乙醇、氢氧化钠、3,5-二硝基水杨酸（3,5-dinitrosalicylic acid，DNA）、酒石酸钠、苯酚、无水硫酸钠、三氯乙酸、磷酸红菲咯啉（bathophenanthroline，BP）、三氯化铁（均为分析纯）：国药集团化学试剂有限公司。
1.2 仪器与设备
JE602电子天平：上海浦春计量仪器有限公司；FB223电子分析天平：上海舜宇恒平科学仪器有限公司；BlueStar B紫外可见分光光度计：北京莱伯泰科仪器股份有限公司；DK-S26电热恒温水浴锅：上海精宏实验设备有限公司；FE28pH计：梅特勒-托多利仪器（上海）有限公司；101-3EBS电热鼓风干燥箱：北京市永光明医疗仪器有限公司；Agilent 240AA火焰原子吸收光谱仪：安捷伦科技（中国）有限公司；S433D氨基酸全自动分析仪：德国Sykam公司；SHDZULC-20AT高效液相色谱（high performance liquid chromatography，HPLC）仪：日本岛津（上海）实验器材有限公司。
1.3 实验方法
1.3.1 松针酵素的加工工艺及操作要点
原料→清洗→热烫→沥干→研磨→酵母发酵→混合发酵→后熟→杀菌→松针酵素
操作要点：选取松针、松花粉、松子、沙棘、柚子、胡萝卜、菊花、柠檬、橘子、玫瑰花、桂花，用清水洗涤后热烫15 min，冷却沥干后按照1∶10（g∶mL）的比例加水破碎得到混合果浆，磨浆成细度在0.5～1.2 mm之间，加入混合果浆质量22%的红糖和33%的冰糖，溶解均匀，加入0.8%经活化的干酵母，并于22 ℃条件下静置发酵18 d，再接种6%发酵乳杆菌（Lactobacillus fermentum）CECT5716和短双岐杆菌（Bifidobacterium breve）M-16V的混合菌液（配比1.0∶1.5），发酵温度37 ℃，发酵时间18 d，再转入室温（25 ℃左右）后熟存放180 d，发酵结束后杀菌（60 ℃、30 min）即得松针酵素成品。1.3.2 分析检测
（1）理化指标的测定
pH值：pH酸度计法；总酸（以乙酸计）含量：参照GB/T 12456—2008《食品中总酸的测定》；可溶性固形物：手持折光仪法；蛋白质含量：考马斯亮蓝方法[17]；总糖、还原糖含量：DNS显色法[18]。
（2）多酚含量的测定
Folin-Ciocalteu比色法[19]测定，以没食子酸质量浓度（x）为横坐标，吸光度值（y）为纵坐标绘制没食子酸标准曲线，按照标准曲线回归方程y=0.017 7x+0.009 9（R2=0.999 2）计算样品中多酚含量。
（3）总黄酮含量的测定
硝酸铝比色法[20]测定，以芦丁质量浓度（x）为横坐标，吸光度值（y）为纵坐标绘制芦丁标准曲线，按照标准曲线回归方程y=9.9070x+0.0036（R2=0.9994）计算样品中总黄酮含量。
（4）维生素含量的测定
分光光度计法[21]测定维生素C（vitamin C，VC），以VC质量浓度（x）为横坐标，吸光度值（y）为纵坐标绘制VC标准曲线，通过标准曲线回归方程y=0.030 7x+0.0050（R2=0.998 5）计算VC含量；维生素B6含量参照国标GB 5009.154—2016《食品中维生素B6的测定》第一法测定。
（5）金属离子的测定
Ca、K、Na、Mg、Fe含量参照国标GB5009.268—2016《食品安全国家标准食品中多元素的测定》第一法测定。
1.3.3 主成分分析
根据主成分分析方法对4个不同陈酿期的松针酵素中的pH、总酸和蛋白质等共15个指标进行主成分变量提取，建立综合评价函数，得到每个样品的综合得分及排名[22]。
1.3.4 数据统计与分析
使用SPSS与Origin数据处理软件进行数据处理以及绘制图表。实验数据以“平均值±标准差”表示，每组数据3个平行实验。
2 结果与分析
2.1 松针酵素陈酿期间各营养素的变化
2.1.1 松针酵素陈酿期间pH值及总酸含量变化
由图1可知，1年、2年陈酿期的松针酵素pH变化不大，到第3年、第4年变化较为明显，由初始值4.33±0.01迅速下降到3.92±0.01后，又以稍缓慢的速度下降到3.76±0.02；总酸含量的整体变化趋势是逐渐增加的，与pH变化对应。1年、2年陈酿期的松针酵素总酸含量稍有增加，随后上升速率变快，质量浓度由最初的（6.44±0.15）mg/mL上升到（17.2±0.17）mg/mL，其总量增加了62.49%。引起这种波动的原因与自身微生物代谢及发酵体系的成分有关，主要原因在于部分发酵导致蛋白质、多肽和氨基酸等缓冲体系破坏引起pH值变化，再者就是陈酿期间微生物代谢将糖类物质转化为醇、醛、酮、酸，pH下降，总酸含量增加。
图1 松针酵素陈酿期间pH值及总酸含量变化
Fig. 1 Changes of pH value and total acid contents in pine needle enzyme during aging periods
2.1.2 松针酵素陈酿期间蛋白质、还原糖及总糖含量变化
由图2可知，随着陈酿年份的增加，蛋白质含量从188.65μg/mL下降到37.42μg/mL；还原糖含量先由1.69 mg/mL增加到1.90 mg/mL后下降到1.24 mg/mL再趋于平缓；总糖含量由2.76 mg/mL下降到2.08 mg/mL，总体减少了24.64%，总糖含量的变化趋势与阎文飞等[23]类似。蛋白质、总糖含量第1年先减少，而还原糖含量稍有增加是由于蛋白质、总糖营养物质在陈酿期间被微生物分解利用分别转化为氨基酸和单糖等其他物质。从另一个角度分析，发酵体系中的游离氨基酸还能与还原糖发生美拉德反应，产物为葡萄糖酸，导致还原糖含量下降。最后1年总糖含量的增加有可能是因为酵素中的糊精能与有机酸发生反应产生葡萄糖，也有可能是因为极微量的糖醇被氧化成葡萄糖。
图2 松针酵素陈酿期间蛋白质、还原糖及总糖含量变化
Fig. 2 Changes of protein, reducing sugar and total sugar contents in pine needle enzyme during aging periods
2.1.3 松针酵素陈酿期间VC、黄酮及多酚含量变化
由图3可知，陈酿期间，VC、黄酮以及多酚含量变化呈一致性，都表现为先增加后减少，且到第2年达到最大值，其含量分别为166.47 μg/mL、143.17 μg/mL和1.9 mg/mL。出现这种情况的原因有以下几点，第一，发酵体系中糖类物质被微生物利用逐渐转化成乙醇，随着乙醇的累积，黄酮及多酚类化合物溶解度增大，原料中的黄酮、多酚大量溶出，含量增加。到陈酿后期，醇类物质慢慢氧化成醛，进而氧化成酸，一方面，乙醇含量的减少，黄酮和多酚溶解度下降，溶出量减少；另一方面，随着有机酸的增加，酚类物质与其发生反应产生酚酸类化合物，导致酚类物质的下降[24]。第二，陈酿初期微生物产生的酶可将原料细胞壁上的大分子物质分解，随着原料汁液渗出，有利于酚类物质的溶出；其次，多酚类物质可以通过疏水键和多元氢键与蛋白质结合，还能与金属离子发生络合反应，这些都能导致酚类物质含量的减少。
图3 松针酵素陈酿期间维生素C、黄酮及多酚含量变化
Fig. 3 Changes of vitamin C, flavonoids and polyphenols contents in pine needle enzyme during aging periods
2.1.4 松针酵素陈酿期间金属元素含量变化
由图4可知，Ca、Na、Mg和K的含量呈波浪式变化，Fe的含量基本保持不变。这主要是因为陈酿期间，随着多酚物质的增加，与金属元素会发生络合反应，生成沉淀，导致金属元素含量减少；但随着陈酿时间的延长，松酵酸度的增加，从陶缸中溶出的金属元素含量会随之增加[25]；3～4年松针酵素中金属元素含量下降的原因可能主要和陶缸的结构有关。随着贮存时间的延长，陶缸的吸附能力及透气性能受到影响，发酵液与陶缸表面的接触相对减弱，进而影响到松酵中金属元素的溶入[26]。
图4 松针酵素陈酿期间金属元素含量变化
Fig. 4 Changes of the metal elements contents in pine needle enzyme during aging periods
2.2 主成分分析
2.2.1 不同陈酿期松针酵素的主要营养成分含量
4个不同陈酿期松针酵素的主要营养成分及其含量见表1，微量元素及其含量见表2。
表1 松针酵素陈酿期松针酵素主要营养成分含量检测结果
Table 1 Determination results of main nutrients contents in pine needle enzyme during aging periods
项目 1年 2年 3年 4年pH值VC/（μg·mL-1）蛋白质/（μg·mL-1）多酚/（mg·mL-1）黄酮/（μg·mL-1）还原糖/（mg·mL-1）总糖/（mg·mL-1）总酸/（mg·mL-1）可溶性固形物/%4.35±0.01 97.87±1.48 188.65±1.20 13.99±0.22 137.67±5.79 1.69±0.01 2.76±0.02 6.44±0.15 6.10±0.14 4.33±0.01 166.47±2.39 86.15±1.06 16.33±0.52 143.17±2.81 1.90±0.08 2.67±0.07 7.00±0.17 6.12±0.12 3.92±0.01 135.69±1.94 78.04±0.74 13.25±0.28 119.08±5.36 1.24±0.01 1.92±0.07 12.40±0.46 4.67±0.01 3.76±0.02 97.21±2.86 37.42±0.84 10.99±0.18 88.50±7.19 1.29±0.01 2.08±0.01 17.20±0.17 4.75±0.05
表2 松针酵素陈酿期松针酵素微量营养成分含量检测结果
Table 2 Determination results of micronutrients contents in pine needle enzyme during aging periods
项目 1年 2年 3年 4年Ca/（mg·L-1）K/（mg·L-1）Na/（mg·L-1）Mg/（mg·L-1）Fe/（mg·L-1）维生素B6/（mg·100 g-1）240.00±3.42 1 100.00±7.15 48.10±0.98 99.00±1.86 9.17±0.14 0.33±0.02 174.00±4.03 751.60±4.16 35.63±0.75 52.70±1.39 10.50±0.09 0.38±0.01 308.00±5.23 857.00±3.24 77.80±1.02 170.00±3.47 8.44±0.18 0.31±0.01 228.00±2.28 625.90±5.04 55.80±0.89 98.20±2.33 7.80±0.20 0.26±0.02
2.2.2 松针酵素营养成分的主成分分析[27-28]
为了避免原始数据对分析结果的影响，本研究对4个不同陈酿期松针酵素的蛋白质、还原糖、总糖、VC、黄酮、多酚、pH、总酸、可溶性固形物、Ca、K、Na、Mg、Fe、维生素B6的数据进行标准化处理后，进行主成分分析，结果如表3 所示。
表3 主成分特征值、贡献率及累积贡献率
Table 3 Eigenvalue, contribution rate and accumulating contribution rate of principal components
主成分 特征值 方差贡献率/% 累积方差贡献率/%PC1 PC2 PC3 9.363 3.544 2.093 62.420 23.628 13.951 62.420 86.049 100.00
由表3可知，前三个主成分的特征值均＞1，分别为9.363、3.544、2.093。其中各个主成分的方差贡献率分别为62.420%、23.628%、13.951%，三个主成分的累积方差贡献率能反映100%的信息，说明这3个主成分反映了原始变量的全部信息。因此选取前3个主成分来评价松针酵素的营养品质。
将原始数据进行最大正交旋转处理，旋转后的主成分载荷矩阵见表4。由表4可知，在第一主成分中，VC有较大的正系数，说明第一主成分中VC为主要评价指标。其中黄酮、多酚含量正向载荷权数较高，故第一主成分可归类于功效成分。第二主成分中金属元素Na、Mg、Ca载荷权数为最高，且有负向影响，其占比均＞0.95，这表明第二主成分中Na、Mg、Ca含量为主要评价指标，可以把第二主成分归类于微量元素。在第三主成分方中蛋白质有最大的正向载荷权数，为0.997，表明第三主成分中蛋白质为主要评价指标，故第三主成分归类于基础能量物质。
表4 主成分因子旋转载荷矩阵
Table 4 Rotation load matrix of principal components
营养指标 PC1 PC2 PC3 pH总酸蛋白质还原糖总糖VC黄酮多酚Ca Na Mg Fe K维生素B6可溶性固形物0.553-0.621 0.059 0.561-0.701 0.955 0.755 0.895-0.231-0.123-0.184 0.822 0.072 0.876 0.426 0.418-0.257 0.048 0.708 0.645 0.065 0.171 0.301-0.970-0.985-0.983 0.488-0.237 0.267 0.636 0.721-0.740 0.997 0.429-0.304-0.291 0.633 0.329 0.074-0.121-0.028 0.293 0.969 0.402 0.643
综上所述，松针酵素的VC、金属元素Na、Mg、Ca及蛋白质含量是评价松针酵素质量品质的主要指标。
2.2.3 松针酵素质量品质主成分分析得分及综合评价
各指标变量的主成分载荷与主成分相对应的特征值相比，再开平方根，即可得到3个主成分中每个指标所对应的特征向量[29]。以特征向量为权重构建4个主成分的表达函数式：
三个表达式中，Z1、Z2、Z3分别表示第一主成分、第二主成分以及第三主成分的得分，X1～X15分别表示pH、VC、蛋白质、多酚、黄酮、还原糖、总糖、总酸、可溶性固形物、Ca、K、Na、Mg、Fe及维生素B6。以各个主成分对应的方差贡献率作为权重，由主成分得分和对应的权重线性加权求和得到综合评价函数[30]。松针酵素综合评价函数：F=0.624 2Z1+0.236 28Z2+0.139 51Z3。
根据酵素综合评价函数，计算出了4个不同陈酿期松针酵素的综合得分值（F）和总排名结果见表5。由表5可知，排名第一位的为2年陈酿期松针酵素。由主成分载荷矩阵分析结果可知，VC对第一主成分影响较为显著（P＜0.05）；2年酵素中的VC、多酚、黄酮含量较高，因而此年份的酵素在第一主成分得分较高。在第二主成分中金属元素有最大的负向影响；由于2年酵素VC、多酚和黄酮含量较高，故在4个陈酿期中排名靠前。
表5 不同陈酿期松针酵素综合评价结果及排序
Table 5 Comprehensive scores results and ranking of pine needle enzyme during different aging periods
品种 PC1 PC2 PC3 F 排名一年陈酿期二年陈酿期三年陈酿期四年陈酿期-0.403 92 1.174 40 0.376 60-1.147 09 0.159 43 0.886 80-1.428 89 0.382 66 1.435 77-0.290 45-0.257 75-0.887 56-0.01 0.90-0.14-0.75 2134
3 结论
松针酵素营养丰富，但随着陈酿时间的延长，各组分发生复杂的生理生化反应，如：氧化还原、酯化、缩合、聚合反应等，会导致不同营养成分的增加与减少。蛋白质含量分别以快速、稍平缓和慢速下降的趋势减少；还原糖和总糖减少速度较缓慢；多酚、黄酮和VC含量积累到最大值后再缓慢减少，总量分别减少了21.44%、35.72%和0.66%；随着溶液体系中酸的积累，pH值缓慢下降，总酸含量逐年上升；金属元素Ca、K、Na、Mg和Fe含量则呈波浪式变化。
采用主成分分析对松针酵素品质进行评价，其结果显示，前3个主成分的累积方差贡献率＞85%，说明这3个主成分反映了原始变量的大部分信息；VC、金属元素Na、Mg、Ca以及蛋白质是评价松针酵素品质的主要指标；2年陈酿期的松针酵素综合评分最高，为0.9，说明在此阶段各营养组分已累积到最大，营养价值最高。
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