豆腐中含有人体所必需的多种微量元素（如铁、钙、磷和镁等），还含有糖类、脂肪和优质蛋白，素有“植物肉”之称[1]。豆腐是老少皆宜的食疗佳品[2]。在豆腐的工业化生产发展中，保鲜期时间短是其发展的一个重要限制因素。虽然我国豆腐行业近年来发展较快，但是相比较一些发达国家，还是存在着一定的差距，技术设备和工艺条件落后，技术力量严重不足，尤其是产品保鲜期过短[4]。
乳酸链球菌素（nisin）和纳他霉素是一种天然的生物防腐剂，相比较化学防腐剂而言，生物防腐剂对人体的基本无毒害作用，且具有抗菌防腐能力强，作用范围广泛等优点。nisin提取自乳酸链球菌株，是一种多肽类化合物，对许多革兰氏阳性菌有很强的抑制作用[5]。但其抗菌谱比较窄，只能杀死或抑制革兰氏阳性菌[6]。纳他霉素是一种天然抗真菌化合物，是由一种链霉菌发酵产生的，不仅对各种霉菌和酵母菌的生长有着有效的抑制作用，而且还可以抑制真菌毒素的产生。但因为其溶解度低的特点，通常只被用于食品的表面进行防腐[7-8]。本课题主要是研究nisin协同纳他霉素在豆腐保鲜中的应用，考虑到nisin抗菌谱较窄，纳他霉素溶解度低，通过同时添加两种防腐剂组合成复合防腐剂以便达到协同互补的目的。该研究通过单因素试验探究nisin和纳他霉素对豆腐保鲜时间延长的最合适的添加量以及在此过程中的一些其他影响因素，然后通过正交试验确定nisin和那他霉素在豆腐中的最适添加量及其他影响因素，从而达到延长豆腐保鲜期的目的。
1 材料与方法
1.1 材料与试剂
大豆：市售；石膏（食品级）：荆门市磊鑫石膏制品有限公司；营养琼脂培养基：上海展云化工有限公司；nisin：浙江银象生物工程有限公司；纳他霉素：浙江多味化工食品有限公司；0.9%氯化钠溶液（生理盐水）：四川科伦药业有限公司。
1.2 仪器与设备
SW-CJ-2D超净工作台：苏州净化设备有限公司；YXQLS-50A压力蒸汽灭菌器、GNP-908恒温培养箱：上海博讯实业有限公司医疗设备厂；HH-4数显恒温水浴锅：常州朗越仪器制造有限公司；DZ400/2C真空包装机：上海青葩包装机械有限公司；FA1604电子天平：上海精密科学仪器有限公司；JYK-328豆浆机：九阳股份有限公司。
1.3 方法
1.3.1 豆腐加工工艺流程[10]
原料大豆称取→浸泡冲洗→磨浆→过滤→煮浆→点浆→分装（添加Nisin）→压榨成型→喷洒纳他霉素混悬液→真空包装→水浴杀菌→冷却→豆腐成品
1.3.2 操作要点
（1）原料的预处理：挑选颗粒饱满的大豆，然后去皮清洗放入盆中浸泡3～4 h，使其充分吸收水分。
（2）豆腐的制作：将浸泡好的大豆放入豆浆机中，加入一定比例的水，用豆浆机将大豆打成豆浆，再用纱布将打好的豆浆过滤，分离浆渣，将分离后的豆浆放入锅中进行煮浆，控制煮浆温度在90～95 ℃，煮浆时间在40 min左右，煮好后加入石膏粉进行点浆，然后压榨成型。
（3）防腐剂的添加：每一组试验称取100 g还未成型的豆浆按一定比例添加Nisin，充分搅拌均匀，待豆腐成型后，在其表面均匀喷洒与Nisin相同比例的纳他霉素混悬液，然后分别装入透明的蒸煮袋中。
（4）真空包装：打开真空包装机进行预热，预热后调整工作电压至36 V，设置真空时间为30 s，热封时间为20 s，然后将已经分装好的透明蒸煮袋平整的放置在真空包装机抽气封口处，避免因袋口不平整产生皱褶而导致漏气，放置好后盖上真空包装机的密封顶盖进行真空包装。
（5）水浴杀菌：将真空包装好的试样放入恒温水浴锅中，用一定的温度保温适当的时间，然后取出用流水冷却降温至常温，得到豆腐成品。
1.3.3 不同因素对豆腐保鲜影响的单因素试验
（1）Nisin和纳他霉素添加量的确定：在确定了其他工艺条件都相同的情况下，称取6份0.1 kg的豆腐，选择Nisin与纳他霉素分别按照5个浓度梯度0.04 g/kg、0.08 g/kg、0.12 g/kg、0.16 g/kg、0.20 g/kg添加到豆腐中，在85 ℃的恒温水浴锅中水浴25 min后，冷却并放入设定温度为37 ℃的恒温培养箱中培养7 d，每隔1 d对试样进行一次感官评定，并在第7天时测定其菌落总数，根据测定和评定结果确定Nisin和纳他霉素最适的添加量。
（2）灭菌温度的确定：在确定了其他工艺条件都相同的情况下，称取5份豆腐，以试验（1）中得出的最适的Nisin和纳他霉素添加量添加，选择灭菌温度的5个温度梯度75 ℃、80 ℃、85 ℃、90 ℃、95 ℃放入水浴锅中灭菌25 min，灭菌完成后冷却并放入设定温度为37 ℃的恒温培养箱中培养7 d，每隔1 d对试样进行一次感官评定，并在第7天时测定其菌落总数，根据测定和评定结果确定最适灭菌温度。
（3）灭菌时间的确定：在确定了其他工艺条件都相同的情况下，称取5份豆腐，添加试验（1）中得出的最适的Nisin和纳他霉素添加量，放入设定了试验（2）中得出的最适灭菌温度的恒温水浴锅中，选择灭菌时间的5个时间梯度15 min、20 min、25 min、30 min、35 min对试样进行灭菌，灭菌完成后冷却并放入设定温度为37 ℃的恒温培养箱中培养7 d，每隔1 d对试样进行一次感官评定，并在第7天时测定其菌落总数，根据测定和评定结果确定最适的灭菌时间。
1.3.4 不同因素对豆腐保鲜影响的正交试验豆腐的保鲜时间与豆腐在制作过程中防腐剂的添加量（A），灭菌温度（B）和灭菌时间（C）等因素有着重要的关系，根据单因素试验的结果选择进行3因素3水平正交试验，根据保温试验第7天得出的不同单因素对豆腐保鲜时间的影响，研究出最适合豆腐保鲜的的工艺条件[11]。正交试验因素水平设计见表1。
表1 豆腐保鲜条件优化正交试验因素与水平
Table 1 Factors and levels of orthogonal experiments for tofu preservation conditions optimization
min 123 0.08 0.12 0.16 80 85 90 20 25 30
1.3.5 菌落总数测定方法
按照GB4789.2—2010《食品微生物学菌落总数测定》的规定对试样进行菌落总数的测定，国家散装豆腐规定其菌落总数应小于1×105 CFU/g[12]。
1.3.6 感官评定标准[13]
综合感官评价指标由色泽、组织状态、气味和滋味4个指标构成，按照评分标准请10名同学组成感官评价小组，各自打分，最终计算的平均分作为评价指标主要从口色泽（30分）、组织状况（30分）、气味（20分）、滋味（20分）四个方面来进行评价，总分为100分[13]。具体感官评分标准如表2。
表2 豆腐感官评分标准
Table 2 Sensory evaluation standards of tofu
等级 色泽（30分） 组织状态（30分） 气味（20分） 滋味（20分）优质豆腐具有豆腐所特有的豆香味（18～20分）口感细腻嫩滑，味道纯正（18～20分）良质豆腐表面呈均匀的白色或乳白色，有光泽（27～30分）表面稍微带点淡黄色，有光泽（24～26分）豆腐特有的豆香味较淡（14～17分）口感平淡，无异味（13～17分）次质豆腐表面黄色较深，无光泽，无其他异色（21～23分）块形完整，按压富有弹性，软硬适中，质地细嫩（28～30分）块形完整，按压弹性一般，软硬适中，无霉变（24～27分）表面轻微发粉，按压弹性较差，有黄色液体渗出，无霉变（20～23分）无豆腐特有的豆香味，无异味（10～13分）口感粗糙，带有一点酸味（9～12分）
续表
等级 色泽（30分） 组织状态（30分） 气味（20分） 滋味（20分）劣质豆腐色泽暗黄，有灰褐色斑点（＜21分）表面发粉严重，块形不完整，表面发黏，有霉变现象（＜20分）有酸味，臭豆腐味等不良气味（＜10分）具有酸味，涩味等不良气味（＜9分）
2 结果与分析
2.1 豆腐保鲜条件优化单因素试验[14]
2.1.1 Nisin和纳他霉素的最适添加量的确定
Nisin和纳他霉素的添加量对微生物菌落总数的影响见表3，对感官评分的影响见图1。由表3可知，Nisin与纳他霉素的添加量对豆腐中微生物菌落总数的测定结果具有一定的影响，随着Nisin和纳他霉素添加量的增加，豆腐试样中菌落总数呈先逐步减少而后缓慢增加趋势，在排除试验污染的情况下，很可能是两者添加量的增加，使得样品内环境发生了改变，不能充分发挥两者的协同作用的效果。由图1可知，随着保温试验时间的延长，豆腐试样的感官评分都呈逐步下降趋势，但nisin与纳他霉素的添加量都为0.12 g/kg时，感官评分下降趋势较缓，最终感官评分也最高。从抑菌效果、节约成本及感官评价等方面综合考虑，nisin与纳他霉素的添加量为0.12 g/kg时，豆腐试样的保鲜效果最佳。
表3 乳酸链球菌素和纳他霉素的添加量对豆腐微生物菌落总数的影响
Table 3 Effect of nisin and natamycin addition on total bacterial counts of tofu
Nisin与纳他霉素添加量/（g·kg-1） 0.04 0.08 0.12 0.16 0.20菌落总数/（CFU·g-1） 1.21×104 0.93×104 0.58×104 0.78×104 0.84×104
图1 乳酸链球菌素和纳他霉素的添加量对豆腐感官评分的影响
Fig. 1 Effect of nisin and natamycin addition on sensory evaluation of tofu
2.1.2 灭菌温度的确定
灭菌温度对微生物菌落总数的影响见表4，对感官评分的影响见图2。由表4可知，豆腐试样的灭菌温度对豆腐试样中微生物菌落总数的测定具有一定的影响，随着灭菌温度的增加，菌落总数随之减少，灭菌温度在85～95 ℃时菌落总数减少的幅度不大，在0.51×104～0.57×104 CFU/g，抑菌效果较好。由图2可知，随着保温试验时间的延长，豆腐试样的感官评分呈逐步下降趋势，但灭菌温度为85 ℃时，感官评分下降趋势较缓，最终感官评分也最高。综合来看，选择灭菌温度为85 ℃时，豆腐试样的保鲜效果最优。
表4 灭菌温度对豆腐微生物菌落总数的影响
Table 4 Effect of sterilization temperature on total bacterial counts of tofu
灭菌温度/℃ 75 80 85 90 95菌落总数/（CFU·g-1） 1.28×104 0.88×104 0.57×104 0.55×104 0.51×104
图2 灭菌温度对豆腐感官评分的影响
Fig. 2 Effect of sterilization temperature on sensory evaluation of tofu
2.1.3 灭菌时间的确定
灭菌时间对微生物菌落总数的影响见表5，对感官评分的影响见图3。由表5可知，豆腐试样的灭菌时间对豆腐试样中微生物菌落总数的测定具有一定的影响，随着灭菌时间的增加，菌落总数呈现减少的趋势，当灭菌时间为25 min以后，菌落总数减少较慢。由图3可知，随着灭菌时间的延长，豆腐试样的感官评分呈逐步下降趋势，在7 d内的感官评定中，灭菌时间为25 min时，感官评分相对较高，所以综合灭菌效果和感官评分两方面来看，选择灭菌时间为25 min时，豆腐试样的保鲜效果最优。
表5 灭菌时间对豆腐微生物菌落总数的影响
Table 5 Effect of sterilization time on total bacterial counts of tofu
灭菌时间/min 15 20 25 30 35菌落总数/（CFU·g-1） 1.12×104 0.68×104 0.49×104 0.46×104 0.41×104
图3 灭菌时间对豆腐感官评分的影响
Fig. 3 Effect of sterilization time on sensory evaluation of tofu
2.2 豆腐保鲜条件优化正交试验
按照单因素试验结果，选择单因素Nisin与纳他霉素的添加量0.08 g/kg、0.12 g/kg和0.16 g/kg作为单因素A的三个水平，选择单因素灭菌温度80 ℃、85 ℃和90 ℃作为单因素B的三个水平，选择灭菌时间20 min、25 min和30 min作为单因素C的三个水平，以感官评分和菌落总数为评价指标设计正交试验，正交试验结果与分析见表6，方差分析结果见表7。
表6 豆腐保鲜条件优化正交试验结果与分析
Table 6 Results and analysis of orthogonal experiments for tofu preservation conditions optimization
试验号 A B C 感官评分/分 菌落总数/（CFU·g-1）1 2 3 4 5 6 7 8 9 K1K2K3R 1 1 1 2 2 2 3 3 3 1 2 3 1 2 3 1 2 3 1 2 3 2 3 1 3 1 2 79 82 75 74 89 93 73 72 83 0.96×104 0.67×104 1.05×104 1.13×104 0.74×104 0.53×104 1.27×104 1.20×104 0.82×104 236 256 228 28.0 226 243 251 25.0 244 239 237 7.0
表7 以感官评分为评价指标的正交试验结果方差分析
Table 7 Variance analysis of orthogonal experiments results using sensory score as evaluation index
方差来源 离差平方和 自由度 均方值 F 值 显著性ABC 51 308.67 57 738.67 51 382 2 2 2 25 654.34 28 869.3 25 691 472.15 416.37 282.32 P＜0.01 P＜0.01 P＜0.01
由表6的极差R可知，正交试验各因素对豆腐保鲜影响的主次顺序依次为A＞B＞C，即Nisin与纳他霉素的添加量对试验结果影响最大。最佳的配方组合为A2B3C1，即当Nisin与纳他霉素的添加量为0.12 g/kg，灭菌温度为90 ℃，灭菌时间为20 min时，豆腐试样的感官评分最高为93分，微生物菌落总数最少为0.53×104 CFU/g。由表7可知，3个因素对感官评分影响极显著（P＜0.01）。
3 结论
在对Nisin与纳他霉素的添加量，灭菌温度和灭菌时间等主要影响因素进行单因素试验的基础上，通过正交试验，确定了以Nisin与纳他霉素的添加量分别为0.12 g/kg，灭菌温度为90 ℃，灭菌时间为20 min为豆腐试样的加工工艺条件时，豆腐试样在37 ℃的恒温培养箱中培养7 d后，感官评分达到93分，属于优质豆腐级别，菌落总数为0.53×104 CFU/g。虽然GB 2712—2014《食品安全国家标准 豆制品》取消了定型包装非发酵豆制品菌落总数指标，但当菌落总数超过一定限值时，产品的性状就会发生改变，也就是说通过感官特征就可以识别，在同样条件下对照组保存1 d就会闻到臭味，感官评低于50分。综合以上情况，通过试验提高了豆腐的保鲜质量，达到了保鲜目的[16-20]。
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