近年来，为满足消费者新需求，醋产品不断朝多样化发展[1-2]。葡萄醋，作为果醋产品中的一类[3]，在国外已成为备受推崇的食品[4]。葡萄醋是以葡萄、葡萄汁等原料经酒精和醋酸双重发酵而成[5-7]，这是区分它与其他醋的主要特征[8]。同时它在抗菌、抗癌、减肥和控制血糖平衡方面发挥着重要作用[9-10]。但目前，在我国葡萄醋发展比较缓慢，可能是由于生产规模不够大，技术比较落后，原材料利用率低等原因造成。有机酸作为葡萄醋中一类重要的有机化合物，不仅决定了葡萄醋的酸味品质，同时还影响产品的感官特性和稳定性[11]。对葡萄醋而言，除了醋酸发酵产生的挥发性醋酸外，有机酸同样是影响其风味的重要指标，但目前多数的报道集中在葡萄醋菌种的筛选和醋饮品的工艺研究上，对有机酸的研究却相对较少。
本研究以实验室自酿赤霞珠葡萄酒为原料，将葡萄酒进行醋酸发酵，并通过响应面法对醋酸发酵条件进行优化，旨在研究适合赤霞珠葡萄醋的发酵条件，为工业化、机械化生产提供理论依据。并且使用高效液相色谱（high performance liquid chromatography，HPLC）法中的外标法对葡萄醋中的有机酸进行测定[12]。
1 材料与方法
1.1 材料与试剂
菌株：沪酿1.01罗旺醋酸杆菌醋酸菌（Acetobacter lovaniense），上海酿造一厂。
葡萄酒（酒精度为13.27%vol，总酸含量为0.52 g/L，挥发酸含量为0.50 g/100 mL，还原糖含量为3.57 g/100 mL，SO2含量为36.2 mg/L）：实验室自制。
无水乙醇（分析纯）：天津市富宇精细化工有限公司；酒石酸、苹果酸、琥珀酸、乙酸、草酸（均为色谱纯）：天津市科密欧化学试剂有限公司。
醋酸菌培养基：葡萄糖1.5 g，酵母膏1 g，碳酸钙1.5 g，加蒸馏水定容到100 mL，121 ℃灭菌20 min。
有机酸混标液：分别称取草酸、酒石酸、苹果酸、乙酸、琥珀酸各0.5 g，用超滤水定容至50 mL，在4 ℃冰箱保存备用[13]。
1.2 仪器与设备
HHS型电热恒温水浴锅：上海博讯实业有限公司；ST2100pH计：奥豪斯仪器有限公司；JJ124BC分析天平：常熟市双杰测试仪器厂；85-2型恒温磁力搅拌器：上海司乐仪器有限公司；Thermo FisherU3000高效液相色谱仪-紫外检测器：赛默飞世尔科技有限公司。
1.3 方法
1.3.1 葡萄醋加工工艺流程
种子发酵液→葡萄原酒（75 ℃加热杀菌10 min）→葡萄原酒降度→接入母发酵液→醋酸发酵→发酵终止（酸度略有下降）→澄清→灭菌→灌装→成品
1.3.2 操作要点
种子发酵液：将斜面保存的醋酸菌菌种在无菌环境中接种于醋酸培养基中（150 mL）活化，加入4 mL无水乙醇，32 ℃、100 r/min条件下培养48 h。
葡萄原酒降度：将葡萄捏碎，去掉葡萄皮渣后，葡萄汁进行巴氏杀菌（75 ℃，10 min），吸取葡萄酒上清液并用葡萄汁进行降度，用密度瓶法测定其酒精度。
母发酵液：将葡萄汁分装于三角瓶中，无菌条件下接入5%种子发酵液，放入4 mL无水乙醇，摇匀，置于32 ℃培养48 h。
发酵液：将母发酵液按10%加入降度后的葡萄原酒中，进行醋酸发酵。
通氧量的控制：恒温振荡培养箱中设定温度和转速。
1.3.3 葡萄醋发酵工艺优化单因素试验
分别选取葡萄原酒酒精度（5%vol、6%vol、7%vol、8%vol）、醋酸菌接种量（4%、6%、8%、10%）、发酵温度（26 ℃、28 ℃、30 ℃、32℃）、通氧量（80 r/min、100 r/min、120 r/min、140 r/min）进行醋酸发酵单因素试验，并对醋酸发酵液进行酸度的测定，直到酸度略有下降为止。
1.3.4 响应面优化葡萄醋发酵工艺
表1 Box-Behnken试验设计因素与水平
Table 1 Factors and levels of Box-Behnken experiments
因素-1 0 1 X1酒精度/%vol X2接种量/%X3通气量/（r·min-1）6 6 8 0 7 8 8 100 10 120
以单因素试验为基础，固定发酵温度为30 ℃，根据Box-Benhnken的中心组合试验设计原理，以酸度（Y）为响应值，酒精度（X1）、接种量（X2）、通气量（X3）为响应因素进行优化组合，试验因素与水平见表1。
1.3.5 葡萄醋理化指标的测定
理化指标：主要包括总酸、不挥发酸、氨基酸态氮、总酯、还原糖、pH和总酯，分别参照GB/T 5009.41—2003《食醋卫生标准的分析方法》、GB 18187—2000《酿造食醋》、GB/T5009.39—2003《酱油卫生标准的分析方法》、GB/T 19777—2013《地理标志产品山西老陈醋的方法》进行测定。
1.3.6 葡萄醋中有机酸的测定
样品前处理：吸取1 mL葡萄醋样品，稀释100倍，并用0.45 μm针头过滤器过滤后待检测。
色谱条件：Venusil MP C18色谱柱（150 mm×4.6 mm，5 μm）；柱温35 ℃；流速0.8 mL/min；进样体积20 μL；紫外检测波长210 nm；流动相20 mmol/L Na2HPO4缓冲溶液。
2 结果与分析
2.1 葡萄醋发酵工艺优化单因素试验
2.1.1 不同酒精度对葡萄醋发酵工艺的影响
由图1可知，4种不同酒精度对发酵液酸度的影响是不同的，用SPSS分析发现，发酵液酸度的增长在第11天和第12天没有显著性差异（P＞0.05）。酒精度在5%vol～7%vol之间，醋酸发酵旺盛，产酸量较高，可能是由于酒精度增加，引起发酵液中营养物质的增加，使得醋酸菌生长繁殖加快，发酵液酸度上升；当酒精度＞7%vol之后，发酵液的酸度在后期反而降低。所以确定醋酸发酵的最佳初始酒精度为7%vol。
图1 不同初始酒精度对发酵液酸度的影响
Fig. 1 Effect of different initial alcohol contents on acidity of fermentation broth
2.1.2 不同接种量对葡萄醋发酵工艺的影响
由图2可知，在前4天的时候，不同的接种量对葡萄醋发酵液的影响显著（P＜0.05），在后8天无显著性差异（P＞0.05）。酸度随接种量的增大呈先上升后下降的趋势，在接种量为8%时均达到最高，其中在12 d时达到最大值，为0.59 g/L。当醋酸菌的接种量在4%～8%之间，随着接种量的增加，发酵液的酸度也在增加，当接种量＞8%之后，发酵液的酸度反而下降，营养物质无法满足条件下，醋酸菌产生了自溶和老化，所以酸度无法再升高[15]。所以确定醋酸发酵的醋酸菌的最佳接种量为8%。
图2 不同接种量对发酵液酸度的影响
Fig. 2 Effect of different inoculum on acidity of fermentation broth
2.1.3 不同通氧量对葡萄醋发酵工艺的影响
由图3可知，发酵前6天，通氧量对葡萄醋发酵液酸度的影响显著（P＜0.05），后6天无显著性影响（P＞0.05），酸度随通氧量的增加呈先增长后下降的趋势。在通氧量＜100 r/min时，发酵液的酸度随着转速的增加不断增长，在发酵第11天时，酸度最高为0.58 g/L；通氧量增大，酒精和醋酸的挥发量也随之增大，造成原料和产物损失，使得醋酸菌产酸率降低，发酵液酸度不再增高[16]。所以确定醋酸发酵的最佳通氧量为100 r/min。
图3 不同通氧量对发酵液酸度的影响
Fig. 3 Effect of different oxygen contents on acidity of fermentation broth
2.1.4 不同发酵温度对葡萄醋发酵工艺的影响
由图4可知，在前11天的影响是显著的（P＜0.05），之后几天影响不显著（P＞0.05）。发酵温度在30 ℃时，发酵液的酸度达到最高，为0.56 g/L。当发酵温度在32 ℃以上时，前期酸度增长无明显变化（P＞0.05），在11 d后，酸度增长趋于平缓，可能是温度抑制了醋酸菌生长，使其老化阶段提早造成[17-18]。因此，醋酸发酵过程的最适发酵温度为30 ℃。
图4 不同发酵温度对发酵液酸度的影响
Fig. 4 Effect of different fermentation temperature on acidity of fermentation broth
2.2 响应面试验优化葡萄醋发酵工艺结果
2.2.1 Box-Behnken试验设计及试验结果
表2 Box-Behnken试验设计及试验结果
Table 2 Design and results of Box-Behnken experiments
根据Design Expert 8.0.6.1响应面软件设计分析可知，葡萄醋的总酸含量（Y）与酒精度（X1）、接种量（X2）、通氧量（X3）3因素的拟合回归模型方程如下：
Y=0.56+0.000X1-0.028X2+0.020X3+0.050X1X2-0.040X1X3-
5.000E-003X2X3-0.077X12-0.022X22-0.052X32
试验号 X1酒精度 X2接种量 X3通氧量 酸度/（g·L-1）1234567891 0-1 1-1 1-1 1-1-1-1 110000-0000-1-1 11-1-1 11 12 13 14 15 16 17 1000000000 1 1-1100000 1100000 0.55 0.43 0.40 0.48 0.37 0.47 0.48 0.42 0.49 0.44 0.55 0.48 0.58 0.54 0.56 0.59 0.55
表3 响应面试验结果方差分析
Table 3 Variance analysis of response surface test results
方差来源 平方和 自由度 均方 F 值 P 值 显著性模型极显著X1X2X3 0.068 0.000 6.05E-003 3.200E-003 9111 7.509E-003 0.000 6.050E-003 3.200E-003 18.98 0.000 15.29 8.09 0.000 4 1.000 0 0.005 8 0.024 9极显著显著
续表
方差来源 平方和 自由度 均方 F 值 P 值 显著性X1X2 X1X3 X2X3 X12 X22 X32残差失拟净误差总和相关系数1.000E-002 6.400E-003 1.000E-004 0.025 2.038E-003 0.011 2.770E-003 1.050E-003 1.720E-003 0.070 R2=0.960 6 1111117341 6 1.000E-002 6.400E-003 1.000E-004 0.025 2.038E-003 0.011 3.957E-004 3.500E-004 4.300E-004 25.27 16.17 0.25 63.09 5.15 28.77 0.001 5 0.005 0 0.630 6＜0.000 1 0.057 5 0.001 0极显著极显著极显著显著极显著0.81 0.549 2不显著调整复相关系数 R2adj=0.910 0
由表3可知，该模型的P=0.000 4＜0.01，说明模型极显著，试验设计真实可靠；失拟项P=0.549 2＞0.05，表明模型呈显著性。决定系数R2=0.960 6，表明在响应值的变化中，有96.06%的可能性是源自于所选因素的变化；它和调整决定系数R2adj=0.910 0共同说明，在发酵液中，酸度的实际测定值与预测定值之间拟合度良好。一次项X2与交互项X1X2、X1X3、二次项X12、X32影响极显著（P＜0.01），X1、X2X3影响不显著（P＞0.05）。试验结果得出各因素对葡萄醋酸度的影响顺序为X2＞X3＞X1，即接种量＞通氧量＞酒精度。
2.2.2 葡萄醋发酵
工艺优化响应面分析
X1X2、X1X3和X2X3的响应面图分别见图5。由图5可知，交互作用X1X2及X1X3的响应面呈抛物线型，等高线呈椭圆形，说明影响显著（P＜0.05）。通过Design Expert 8.0.6.1软件，对所建立的数学模型进行参数的优化分析得出，葡萄醋的最佳发酵条件为酒精度6.56%vol、接种量8%、通氧量108.11 r/min，在此条件下进行发酵，最高酸度为0.58 g/L。根据实际可操作条件，得出三个自变量最优真实值为酒精度7%vol，接种量8%和通氧量100 r/min，实际测得的总酸含量平均可达到0.56 g/L。
图5 酒精度、接种量和通氧量交互作用对发酵液酸度影响的等高线与响应面
Fig. 5 Response surface plots and contour line of effects of interaction between alcohol content, inoculum and oxygen content on acidity of fermentation broth
2.3 验证试验
为了验证所做试验结果是否可靠，故在最优条件下做3次平行试验对葡萄醋进行发酵，得到的酸度平均值为0.58 g/L，与响应面模型有较高的一致性，即Box-Behnken模型有很好的现实意义，能够预测葡萄醋发酵条件及其酸度。
2.4 葡萄醋理化指标的测定
表4 葡萄醋理化指标的测定结果
Table 4 Determination results of physicochemical indexes of grape vinegar
理化指标 a b c 平均还原糖/（g·100 mL-1）不挥发酸/（g·100 mL-1）可溶性固形物/（g·100 mL-1）总酯/（g·100 mL-1）pH值氨基酸态氮/（g·100 mL-1）0.58 0.25 8.90 8.27 3.45 0.23 0.45 0.34 9.00 8.05 3.68 0.17 0.58 0.30 9.00 8.27 3.38 0.19 0.54 0.30 8.98 8.19 3.50 0.20
由表4可知，葡萄醋的还原糖、不挥发酸、可溶性固形物、总酯、氨基酸态氮含量分别为0.54 g/100 mL、0.30 g/100 mL、8.98 g/100 mL、8.19 g/100 mL、0.20 g/100 mL，pH为3.50。成品理化指标满足相关国标要求。
2.5 有机酸的测定
2.5.1 有机酸标样的色谱图
混合有机酸的标准溶液的高效液相色谱图见图6。由图6可知，5种有机酸在20 min内全部分离完毕，并且色谱峰分离完全，峰型良好。
图6 混合标样的高效液相色谱图
Fig. 6 HPLC of mixed standard samples
2.5.2 线性关系和相关系数
以峰面积（Y）和相对应的质量浓度（X）制作有机酸的标准曲线并建立回归方程（见表5），五种有机酸的峰面积和质量浓度的相关系数R2均＞0.990 0，说明有机酸组分在设定浓度的范围内，线性关系良好。
表5 有机酸标液的标准曲线
Table 5 Standard curves of organic acids standard
有机酸名称 回归方程 相关系数（R2）琥珀酸草酸乙酸苹果酸酒石酸Y=1.213 9X+0.153 1 Y=3.927 3X+0.535 9 Y=9.384 5X+0.175 7 Y=0.075 0X+0.040 5 Y=0.161 9X+0.002 0 0.999 66 0.990 78 0.999 96 0.994 05 0.996 03
2.5.3 葡萄醋中有机酸的分析结果
葡萄醋样品中包含的有机酸有草酸、酒石酸、苹果酸、乙酸、琥珀酸等，醋酸菌将酒精转化成乙酸，所以其含量最为丰富[19]。其中草酸的含量为10.58 g/L、酒石酸的含量为0.46 g/L、苹果酸的含量为1.34 g/L、乙酸含量为46.82 g/L、琥珀酸的含量为0.14 g/L。与赵方圆等[20]的实验结果相比，发现了草酸这一类有机酸，各有机酸浓度也均相对较高。
3 结论
本研究以实验室赤霞珠葡萄酒为原料，采用单因素和响应面分析方法优化葡萄醋的发酵工艺，得出最佳的工艺条件为初始酒精度7%vol、接种量8%、通氧量为100 r/min，在发酵12～13 d时酸度不再增长，这时发酵液的酸度值可达到0.58 g/L。采用高效液相色谱法测定了葡萄醋中的有机酸，草酸、酒石酸、苹果酸、乙酸和琥珀酸的含量分别为10.58 g/L、0.46 g/L、1.34 g/L、46.82 g/L、0.14 g/L。
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