食醋作为一种酸性调味品，酸味柔和，口感醇厚，营养丰富，其不仅具有调味功能，还具有消除疲劳、预防感冒、消炎杀菌、促进食欲等作用，深受各地消费者的喜欢[1-2]。但是，在食醋的酿造过程中，会产生浑浊。这是因为原辅料中的淀粉、蛋白质、果胶、纤维素、木质素等物质，由于糖化发酵不彻底，而悬浮于食醋中导致食醋浑浊；蛋白质在一定条件下会发生冷浑浊，当温度高于20 ℃时，β-球蛋白与醇溶蛋白与水结合形成氢键，呈现水溶性，当温度低于20 ℃时，这两种蛋白与多酚结合，使与水形成的氢键产生断裂现象，从而析出形成沉淀，导致粗蛋白含量高；蛋白质、果胶、单宁等会与生产设备中的金属离子发生反应，从而在食醋中生成不溶性的物质[3-4]。此外，食醋在储存过程中会发生返浑现象，形成二次沉淀，严重影响食醋的品质[5]。因此，解决食醋的浑浊问题对食醋产业的发展至关重要。
目前，常用的澄清方法有澄清剂法、离心分离法、膜分离法、酶解法[6-7]。澄清剂法澄清速度快、成本低，适用于食醋的澄清。皂土是以蒙脱石为主的含水粘土矿，具有较强的吸附性和膨胀性，可以利用正负电荷吸引和范德华力使饮料、酒类等中的蛋白质、色素等悬浮微粒沉淀，通过沉降过滤达到澄清效果[8-10]。硅藻土是一种有序排练的多孔性物质，无毒无味，其表面积和孔体积较大，具有良好的吸附性，可以吸附带正电荷的蛋白质等离子[11]。壳聚糖是天然的阳离子型絮凝剂，对蛋白质等具有良好的吸附性，同时还具有成膜性、通透性和吸湿性，添加在食醋中，可消除其二次沉淀[5，12]。
为了加快澄清速度，提高稳定性，本研究采用皂土、硅藻土、壳聚糖3种澄清剂澄清食醋，并通过响应面法优化复合澄清剂对食醋的澄清效果，确定最佳澄清条件，为食醋的澄清方法提供技术支持和理论依据，使食醋澄清，口感协调。
1 材料与方法
1.1 材料与试剂
新醋：山西紫林醋厂（主要原料为高粱、麸皮）。
皂土、硅藻土（化学纯）：北京索莱宝科技有限公司，使用时配制成1%溶液；壳聚糖（食品级，脱乙酰度≥90.00%）：上海源叶有限公司，使用时配制成1%溶液。
1.2 仪器与设备
ST3100/B型酸度计、CP114型分析天平：奥豪斯仪器（常州）有限公司；85-2型恒温磁力搅拌器：上海司乐电器有限公司；WGZ-1型浊度计：上海昕瑞仪器仪表有限公司；5804R型离心机：德国Eppendorf公司；HHS型电热恒温水浴锅：上海博迅实业有限公司医疗设备厂。
1.3 方法
1.3.1 单一澄清剂对食醋澄清的影响
准确量取食醋100 mL于三角瓶中，分别加入不同的澄清剂，使澄清剂的质量浓度分别为0.15 g/L、0.35 g/L、0.55 g/L、0.75 g/L、0.95 g/L、1.15 g/L、1.35 g/L，混匀，静置48 h后4 500 r/min离心15 min，同时做3组平行，取上清液测定浊度。
1.3.2 复合澄清剂对食醋澄清的影响
准确量取食醋100 mL于三角瓶中，将不同澄清剂以最佳添加量互相混合，加入食醋中，混匀，静置48 h，4 500 r/min离心15 min，同时做3组平行，取上清液测定浊度，确定最佳复合澄清剂添加量并对其进行复合澄清试验。
1.3.3 复合澄清剂澄清条件优化单因素试验
复合澄清剂配比：准确量取食醋20 mL，两种澄清剂按质量比为1∶5、1∶4、1∶3、1∶2、1∶1、2∶1、3∶1加入，混匀，45 ℃条件下处理40 min，静置48 h，4 500 r/min离心15 min，同时做3组平行，取上清液测定其浊度，研究不同澄清剂的配比对食醋澄清度的影响。
处理温度：准确量取食醋20 mL，按复合澄清剂的最佳配比加入，混匀，分别在30 ℃、35 ℃、40 ℃、45 ℃、50 ℃、55 ℃、60 ℃条件下处理40 min，静置48 h，4 500 r/min离心15 min，同时做3组平行，取上清液测定其浊度，研究不同处理温度对食醋澄清度的影响。
处理时间：准确量取食醋20 mL，按复合澄清剂的最佳配比加入，混匀，置于45 ℃条件下分别处理10 min、20 min、30 min、40 min、50 min、60 min、70 min，静置48 h，4 500 r/min离心15 min，同时做3组平行，取上清液测定其浊度，研究不同处理时间对食醋澄清度的影响。
1.3.4 复合澄清剂澄清条件的优化
在单因素试验的基础上，利用Box-Behnken中心组合试验原理和3因素3水平的响应面分析法设计方案，以复合澄清剂配比（A）、处理温度（B）、处理时间（C）为自变量，食醋的浊度（Y）为响应值，通过Design Expert8.06 软件确定复合澄清剂的最佳澄清条件并做验证试验。响应面试验因素与水平设计见表1。
表1 复合澄清剂澄清条件优化响应面试验因素与水平
Table 1 Factors and levels of response surface methodology for clarification conditions optimization of compound clarifying agent
水平 C 处理时间/min-1 0 1 A 复合澄清剂质量比 B 处理温度/℃1.0∶2 1.0∶1 1.5∶1 30 35 40 10 20 30
1.3.5 测定方法
感官评价、澄清度、总酸、总酯、不挥发酸、氨基酸态氮、还原糖、可溶性固形物：按照参考文献[13-18]的方法进行测定。
2 结果与分析
2.1 不同澄清剂对食醋澄清的影响
由表2可知，随着不同澄清剂添加量的增加，食醋浊度呈现先降低后增加的趋势。当皂土添加量为0.75 g/L时，食醋浊度达到最小值55.30 NTU，比原醋降低了57.59%，澄清效果最好（P＜0.05）；当硅藻土添加量为0.55 g/L时，食醋浊度达到最小值58.60 NTU，比原醋降低了55.06%，澄清效果最佳（P＜0.05）；当壳聚糖添加量为0.35 g/L时，食醋浊度达到最小值36.85 NTU，比原醋降低了71.74%，澄清效果最佳（P＜0.05）。
表2 不同添加量的单一澄清剂对食醋澄清效果的影响
Table 2 Effect of different single clarifying agent addition on vinegar clarification
注：同一列不同小写字母表示不同处理间存在显著性差异（P＜0.05，n=3）。下同。
澄清剂添加量/（g·L-1）0 0.15 0.35 0.55 0.75 0.95 1.15 1.35皂土浊度/NTU硅藻土 壳聚糖130.40±1.27a 75.30±0.75c 74.07±1.15a 71.87±1.42d 55.30±1.05e 74.53±0.74c 79.23±0.85b 78.67±0.72b 130.40±1.27a 80.80±2.26c 79.85±2.33c 58.60±1.13d 83.55±0.92c 93.25±1.34b 91.75±2.62b 92.55±1.63b 130.40±1.27a 42.90±2.69c 36.85±2.05c 39.65±1.34c 81.85±2.05b 78.50±2.40b 77.35±2.76b 76.60±2.12b
2.2 复合澄清剂对食醋澄清的影响
表3 复合澄清剂对食醋澄清效果的影响
Table 3 Effect of compound clarifying agent on vinegar clarification
复合澄清剂种类 浊度/NTU硅藻土＋皂土硅藻土＋壳聚糖皂土＋壳聚糖硅藻土＋皂土＋壳聚糖68.63±1.76a 23.37±1.46b 28.30±2.21b 24.10±2.43b
由表3可知，硅藻土和皂土混合后，食醋浊度为68.63NTU，相比单一澄清剂，澄清效果并无提高，反而下降，可能是由于两种澄清剂间没有很好的互补利用，而是形成了稳定的体系悬浮于食醋中，从而影响了食醋的澄清效果。除此之外，其余混合方式均使食醋的澄清度明显提高，其中硅藻土和壳聚糖混合后对食醋的澄清效果最好，食醋浊度为23.37 NTU，比原醋降低了82.07%（P＜0.05）。因此，选取硅藻土和壳聚糖作为复合澄清剂。
2.3 复合澄清剂的单因素试验
2.3.1 复合澄清剂配比对食醋澄清效果的影响
复合澄清剂（添加量0.90 g/L）配比对食醋澄清效果的影响如图1所示。由图1可知，随着壳聚糖与硅藻土配比的增加，食醋的浊度呈先降低后升高的趋势，这是由于不同澄清剂的机理不同，澄清剂复合使用时，适宜的澄清剂配比能使澄清剂之间得到合理的互补利用，但澄清剂配比过大，则影响了澄清剂对食醋中带不同电荷浑浊物的相互作用，从而使食醋的浊度又增加[11，19]。当配比为1∶1（g∶g）时，食醋浊度达到最小值6.85 NTU，澄清度明显提高（P＜0.05）。因此，选择壳聚糖∶硅藻土为1.0∶2、1.0∶1、1.5∶1（g∶g）进行后续试验。
图1 复合澄清剂配比对食醋澄清效果的影响
Fig. 1 Effect of mass ratio of compound clarifying agent on vinegar clarification
2.3.2 处理温度对食醋澄清效果的影响
处理温度对食醋澄清效果的影响如图2所示。由图2可知，随着处理温度的升高，食醋浊度呈先降低后升高的趋势，这是因为适宜的处理温度能使硅藻土充分吸水膨胀，使之与壳聚糖之间更好的相互作用，使浑浊物由小颗粒变成大颗粒而沉降，从而提高了食醋的澄清度。当处理温度为35 ℃时，食醋浊度达到最小值4.55 NTU，澄清效果最好（P＞0.05）。因此，选择处理温度为30 ℃、35 ℃、40 ℃进行后续试验。
图2 复合澄清剂处理温度对食醋澄清效果的影响
Fig. 2 Effect of treatment temperature of compound clarifying agent on vinegar clarification
2.3.3 处理时间对食醋澄清效果的影响
处理时间对食醋澄清效果的影响如图3所示。由图3可知，随着处理时间的延长，食醋的浊度呈先降低后升高的趋势，这可能是因为在水浴过程中，适当的处理时间可以使食醋中的颗粒物质更快的沉淀，提高食醋的澄清度，相反，若处理时间过长，则会使澄清剂自身形成稳定的胶体悬浮于食醋中，从而影响了食醋的澄清度。当处理时间为20 min时，食醋浊度达到最小值2.10 NTU，澄清效果最佳（P＜0.05）。因此，选择处理时间为10 min、20 min、30 min进行后续试验。
图3 复合澄清剂处理时间对食醋澄清效果的影响
Fig. 3 Effect of treatment time of compound clarifying agent on vinegar clarification
2.4 响应面优化复合澄清剂条件
本试验选择响应面法优化复合澄清剂对食醋的澄清效果，利用多元二次回归方程来拟合多因素试验中因素与响应面之间、因素与因素之间的相互关系，通过回归方程的分析来寻求最佳工艺参数，适宜于解决非线性数据处理的相关问题[20-21]。
在单因素试验结果的基础上，以壳聚糖与硅藻土质量比（A）、处理温度（B）及处理时间（C）为影响因素，食醋的浊度（Y）为响应值，利用Box-Behnken响应面分析法设计方案。试验设计及结果如表4所示。
表4 复合澄清剂澄清条件优化响应面试验设计及结果
Table 4 Design and results of response surface methodology for clarification conditions optimization of compound clarifying agent
试验号 A B C Y 浊度/NTU 1234567891 0 11 12 13 14 15 16 17 1.0∶2 1.5∶1 1.5∶1 1.0∶1 1.0∶1 1.0∶1 1.0∶1 1.0∶1 1.0∶2 1.0∶2 1.5∶1 1.0∶2 1.0∶1 1.0∶1 1.0∶1 1.0∶1 1.5∶1 35.00 40.00 35.00 40.00 35.00 35.00 35.00 35.00 35.00 30.00 30.00 40.00 30.00 30.00 35.00 40.00 35.00 30.00 20.00 10.00 10.00 20.00 20.00 20.00 20.00 10.00 20.00 20.00 20.00 30.00 10.00 20.00 30.00 30.00 6.75 3.45 4.60 5.80 2.05 2.08 2.15 2.35 7.65 5.05 2.10 8.15 3.05 3.35 2.25 4.35 2.75
利用Design Expert 8.06 软件对表4的结果进行分析，得到浊度数学模型的二次多项回归方程：
该方程可用于分析各因素对响应面的影响。项的系数为正时，表示该项对响应面有正面影响，反之，表示该项对响应面有负面影响[22]。
为了检验该方程的可行性，对食醋浊度的模拟方程进行方差分析，结果见表5。
由表5可知，模型达到了极显著水平（P＜0.01），表明模型的构建较成功。失拟项不显著（P＞0.05），表明回归方程的拟合效果较好，可以对复合澄清剂优化澄清食醋的条件进行分析和预测。复合澄清剂配比（A）、处理温度（B）、处理时间（C）均达到极显著水平（P＜0.01），结合F值，3个因素对食醋澄清度的影响程度大小为A＞B＞C。二次项A2、B2、C2对食醋澄清度的影响极显著（P＜0.01）；交互项AB对食醋澄清度的影响极显著（P＜0.01）；BC对食醋澄清度的影响显著（P＜0.05）；AC对食醋澄清度的影响不显著（P＞0.05）。决定系数R2=0.995 6，R2Adj=0.989 9，表明此模型的预测值与试验值拟合度较好。因此，该模型可以很好的分析预测食醋浊度随复合澄清剂配比、处理温度、处理时间之间的变化规律。
表5 响应面二次回归方程方差分析
Table 5 Variance analysis of response surface quadratic regression equation
注：“**”表示差异极显著（P＜0.01）；“*”表示差异显著（P＜0.05）；“-”表示差异不显著（P＞0.05）。
来源 平方和 自由度 均方 F 值 P 值 显著性模型ABCA B**********AC BC A2-***B2 C2 175.70 645.83 200.96 60.52 18.31 5.39 7.91 365.63 36.94 185.04＜0.000 1＜0.000 1＜0.000 1 0.000 1 0.003 7 0.053 2 0.026 1＜0.000 1 0.000 5＜0.000 1****残差失拟项纯误差总和66.14 27.01 8.41 2.53 0.77 0.23 0.33 15.29 1.54 7.74 0.29 0.23 0.062 66.43 91111111117341 6 7.35 27.01 8.41 2.53 0.77 0.23 0.33 15.29 1.54 7.74 0.042 0.077 0.015 5.01 0.076 7-
响应面图是响应值与各因子构成的三维空间曲面图，响应面分析的等值线可以直观反映各因素对响应值的影响及各参数之间的相互作用[19]。等高线图是曲面上相同的因素值在底面上形成的曲线，等高线越趋近于正圆，说明两者的交互作用越不显著，等高线越趋近于椭圆，说明两者的交互作用越显著[23]。根据回归方程利用Design-Expert 8.06 软件作出响应面的曲面图及等高线图，并对其进行分析。响应面图如图4所示。
由图4可知，当处理时间一定时，随着复合澄清剂配比的增大和处理温度的升高，食醋浊度先降低后升高；等高线图为椭圆形，说明复合澄清剂配比与处理温度的交互作用显著（P＜0.05）。当处理温度一定时，随着复合澄清剂配比的增大和处理时间的延长，食醋浊度呈先下降后上升的趋势；等高线图接近正圆形，说明复合澄清剂配比与处理时间的交互作用不显著（P＞0.05）。当复合澄清剂配比一定时，随着处理温度的升高和处理时间的延长，食醋浊度先下降后升高；等高线图为椭圆形，说明处理温度的升高和处理时间的交互作用显著（P＜0.05）。结果均与方差分析中的显著性一致，证明该模型可信度高。
图4 复合澄清剂质量比、处理温度、处理时间交互作用对食醋浊度影响的响应面和等高线图
Fig. 4 Response surface plots and contour line of effects of interaction between compound clarifying agent mass ratio, treatment temperature and time on vinegar turbidity
2.4.3 食醋最佳澄清效果的条件验证试验
利用Design-Expert 8.06 软件分析响应面图，得出复合澄清剂的最优澄清条件：复合澄清剂配比1.21∶1、处理温度31.73 ℃、处理时间21.76 min，在此条件下食醋浊度的预测值为1.41 NTU。为方便实际操作并检验其合理性，修改壳聚糖与硅藻土配比1.0∶1（g∶g）、处理温度31 ℃、处理时间20 min为最佳澄清条件进行验证试验，在此条件下得到食醋浊度为1.45 NTU，基本接近预测值，证明利用该模型优化复合澄清剂澄清食醋的条件是可行的。
2.5 食醋澄清效果及品质的评价
不同澄清剂对食醋的澄清效果达到最佳时，对食醋的理化指标进行测定，食醋的理化指标变化见表6。复合澄清剂澄清前后对食醋的感官评价见表7。
由表6可知，几种澄清剂对食醋的澄清效果均有显著影响（P＜0.05）。澄清前后食醋的各项指标均无明显变化（P＞0.05）。复合澄清剂对食醋的澄清效果优于单一澄清剂，食醋浊度为1.45 NTU，比原醋降低了98.89%，澄清效果达到预期。
表6 澄清方式对食醋理化指标的影响
Table 6 Effects of clarification methods on physical and chemical indexes of vinegar
原醋 皂土澄清 硅藻土澄清 壳聚糖澄清项目 复合澄清浊度/NTU总酸/（g·100 mL-1）总酯/（g·100 mL-1）不挥发酸/（g·100 mL-1）氨基酸态氮/（g·100 mL-1）还原糖/（g·100 mL-1）可溶性固形物/（g·100 mL-1）130.4±1.27a 4.07±0.01a 0.92±0.01a 0.99±0.03a 0.22±0.03a 0.42±0.03a 12.65±0.04a 55.30±1.05c 4.07±0.01a 0.91±0.01a 0.95±0.03a 0.20±0.03a 0.42±0.01a 12.64±0.04a 58.60±1.13b 4.06±0.01a 0.92±0.03a 0.99±0.01a 0.21±0.01a 0.41±0.04a 12.65±0.03a 36.85±2.05d 4.06±0.03a 0.92±0.01a 0.98±0.01a 0.15±0.01a 0.42±0.03a 12.58±0.03a 1.45±0.92e 4.06±0.01a 0.91±0.01a 0.98±0.03a 0.22±0.01a 0.42±0.04a 12.64±0.03a
表7 食醋感官评价结果
Table 7 Results of sensory evaluation of vinegar
项目 色泽 香气 滋味 体态原醋深褐色，无光泽复合澄清红棕色，鲜亮香气浓郁，刺激香气浓郁，醋香纯正酸味浓郁，无异味酸味柔和，无异味浑浊，浓稠，有沉淀体态均一，澄清
由表7可知，复合澄清后的食醋外观呈红棕色，色泽清亮，体态均一，澄清，香气浓郁，酸味柔和。
3 结论
复合澄清剂对食醋的澄清效果优于单一澄清剂，其澄清速度快，透明度高。其中壳聚糖与硅藻土作为复合澄清剂的澄清效果最好，最佳澄清条件为壳聚糖与硅藻土质量比1.0∶1，处理温度31 ℃，处理时间20 min。在此条件下，食醋浊度的实际值为1.45 NTU，比原醋降低了98.89%，与预测值1.41 NTU基本一致。经复合澄清剂处理后的食醋呈红棕色，色泽清亮，无沉淀，酸味柔和，口感协调，且理化指标变化甚微。
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