脱氧雪腐镰刀菌烯醇（deoxynivalenol，DON），又称呕吐毒素，是最常见的一种污染粮食、饲料和食品的霉菌毒素之一[1]，属于单端孢霉烯族化合物，主要由禾谷镰刀菌（Fusarium graminearum）、黄色镰刀菌（Fusarium culmorum）、雪腐镰刀菌（Fusarium nivale）等真菌产生的次级有毒代谢物[2-34]。DON可以干扰核糖体肽基转移酶的活性，阻碍体内的核糖体正常循环，并且抑制蛋白质的合成，大量摄入会引起急性中毒，主要表现有头疼、头晕及呕吐，中枢神经系统紊乱等[5-6]。DON稳定性强，具有较强的耐热性和耐酸性[7]，在中性或酸性环境中，100℃、2 h只能小部分被破坏，有研究表明，DON使家兔的心、肝、肾和脾的组织细胞出现肿胀、空泡变性、炎性细胞浸润及细胞坏死的病理变化[8]，可促进免疫细胞凋亡并抑制免疫细胞增长，严重影响人和牲畜的健康。检测被其污染粮食作物（小麦、大麦、玉米等）刻不容缓，以避免人蓄误食，引起不必要的损害。
国标GB 5009.111—2016《食品中脱氧雪腐镰刀菌烯醇及其乙酰化衍生物的测定》中规定了DON的四个检测方法，分别是同位素稀释液相色谱-串联质谱法（liquid chromatography-massspectrometry，LC-MS）、免疫亲和层析净化高效液相色谱（high performance liquid chromatography，HPLC）法、薄层色谱测定法、酶联免疫吸附筛查法。前人做过很多工作，研究出很多DON的检测方法，比较常见成熟检测方法有高效液相色谱法[9-10]、气相色谱法[11-12]、液相色谱质谱联用法[13-15]、胶体金试纸条法[16]、薄层色谱法和酶联免疫吸附筛查法[17]等。胶体金试纸条法、薄层色谱和酶联免疫法成本较低，对检测人员要求不高，前处理方法较简单，一般用于定性和半定量检测。高效液相色谱法和液相色谱串联质谱法，前处理相较麻烦，灵敏度高，能够准确的定性和定量检测。本研究分别比较免疫亲和柱-高效液相色谱法、免疫亲和柱-液质联用外标法和免疫亲和柱-液质联用内标法对脱氧雪腐镰刀菌烯醇进行检测分析，旨在选择更准确高效、经济适用、环保的检测方法。
1 材料与方法
1.1 材料与试剂
玉米：市售；乙腈、甲醇（均为色谱纯）：美国Fisher Chemical公司；氨水、聚乙二醇（均为分析纯）：成都科龙化工试剂公司；IAC-SEP免疫亲和柱（1.2μg/2 mL）：北京中检维康生物技术有限公司；13C15-脱氧雪腐镰刀菌烯醇（25μg/mL，1 mL/支）：美国SIGMA-ALDRICH公司；脱氧雪腐镰刀菌烯醇（1 mg/支）：新加坡PRIBOLAB公司。
1.2 仪器与设备
SCIEX QTrap 4500液质联用仪：美国AB公司；e2695/2298液相色谱仪：美国Waters公司；ULUP-II-107超纯水机：西安优普仪器设备有限公司；HSC-24A氮吹仪：天津市恒奥科技发展有限公司；LD5-2A离心机：北京京立离心机有限公司；SB25-12超声波仪：宁波新芝生物科技公司。
1.3 方法
1.3.1 高效液相色谱条件
Waters Symmetry C18色谱柱（4.6 mm×250 mm，5μm），进样体积：20 μL，流速：1 mL/min，停止时间：15 min，流动相：水∶乙腈=90∶10（V/V），等度洗脱，柱温35 ℃，紫外检测波长218 nm。
1.3.2 液相色谱串联质谱条件
Waters Symmetry C18色谱柱（4.6 mm×250 mm，5μm），进样体积：5 μL，流速：0.8 mL/min，停止时间：10 min，流动相：0.01%氨水溶液+乙腈，梯度洗脱，洗脱程序为98%氨水溶液+2%乙腈，维持0.8 min，98%氨水溶液+2%乙腈，维持0.8 min，76%氨水溶液+24%乙腈，维持3.2 min，100%乙腈，维持1 min，98%氨水溶液+2%乙腈，维持5 min。
质谱条件：多反应监测（multiple reaction monitoring，MRM），喷雾电压4 500 V，离子源温度600℃，喷雾器Gas 1∶60，辅助气Gas 2∶70，碰撞气：中气压模式medium，MRM参数见表1。
表1 脱氧雪腐镰刀菌烯醇分析的MRM参数
Table 1 MRM parameters of deoxynivalenol analysis
化合物 母离子 子离子 去簇电压/V 碰撞能量/eV DON DON 13C15-DON 295 295 310.2 265.3（定量）138.1（定性）279.1-70-70-55-13-20-12
1.3.3 标准溶液制备
加乙腈1 mL于脱氧雪腐镰刀菌烯醇标准品装样瓶，振荡，使溶解，转移至10 mL容量瓶中，多次用乙腈洗涤标准品装样瓶，洗涤液均转移至容量瓶中，最后用乙腈定容至10 mL，摇匀，得到质量浓度为100μg/mL标准储备液。取1 mL标准储备液于10 mL容量瓶中，用乙腈定容至刻度，摇匀，得到质量浓度为10μg/mL标准工作液。
精密量取13C15-脱氧雪腐镰刀菌烯醇内标1 mL于25 mL容量瓶中，用乙腈溶解并定容至25 mL摇匀，配成内标溶液，质量浓度为1 000 ng/mL。
HPLC法标准曲线配制：准确移取10μg/mL标准工作液10μL、20μL、50μL、100μL、200μL、500μL于进样瓶中，用乙腈+水（10∶90，V/V）定容至1 mL，得到质量浓度分别为100 ng/mL、200 ng/mL、500 ng/mL、1 000 ng/mL、2 000 ng/mL、5 000 ng/mL的系列标准溶液。LC-MS法标准曲线配制：将10μg/mL标准工作液用乙腈稀释10倍，得到质量浓度为1 000 ng/mL标准工作液，准确移取上述标准工作液10μL、20μL、50μL、100μL、200μL、500μL于进样瓶中，再分别加入100μL内标溶液（外标法不加入内标），用0.01%氨水+乙腈（98∶2，V/V）定容至1 mL，得到质量浓度为10 ng/mL、20 ng/mL、50 ng/mL、100 ng/mL、200 ng/mL、500 ng/mL的系列标准溶液，内标质量浓度为100 ng/mL。
1.3.4 样品制备
HPLC法前处理：称取打碎的谷物制品25 g（精确到0.1 g）于具塞三角瓶中，加入5 g聚乙二醇（分散剂），加入纯水100 mL，振荡混匀，置于超声波仪中超声30 min，4 000 r/min离心5 min，收集上清液待净化；先将冷藏的免疫亲和柱恢复至室温，待免疫亲和柱内原有液体流尽后，准确移取上清液2 mL至免疫亲和柱中，控制流速1滴/秒，直至空气进入免疫亲和柱中，再分别用5 mL磷酸盐缓冲溶液（phosphate buffered solution，PBS）和5 mL水先后淋洗免疫亲和柱，控制流速每秒1～2滴，弃去全部流出液，抽干小柱。准确加入2 mL甲醇洗脱免疫亲和柱，控制流速每秒1滴，收集全部流出液，再于45℃水浴氮吹近干，准确加入1 mL初始流动相，涡旋30 s溶解残渣，过0.45μm滤膜，收集滤液于进样瓶中供液相色谱测定。
LC-MS法前处理：称取打碎的谷物制品约2 g（精确到0.01 g）于50mL离心管中，内标法加入400μL内标溶液，外标法不加，振荡混合后静置30 min，加入20 mL乙腈-水（84∶16，V/V）溶液置于超声波仪中超声30 min，4 000 r/min离心5 min，收集上清液待净化；准确移取上清液5 mL于45℃水浴氮吹干，加入2 mL水充分溶解残渣，事先将冷藏的免疫亲和柱恢复至室温，待免疫亲和柱内原有液体流尽后，将上述溶液转移至免疫亲和柱中，后续步骤同液相法的净化过程，不同的是过0.22μm滤膜，收集滤液于进样瓶中供液相色谱串联质谱测定。
1.3.5 方法学验证
精密度试验：按照样品测定方法，HPLC法吸取质量浓度为1 000 ng/mL标准溶液，LC-MS法吸取质量浓度为100 ng/mL标准溶液，分别连续测定6次，比较测定结果的相对标准偏差（relative standard deviation，RSD），考察两种方法的精密度。
加标回收试验：取空白玉米样品，分别做3个水平加标回收试验，每个水平做3个平行，分别根据上述前处理方法处理，色谱方法上机检测，考察检测方法的准确度。
重复性试验：分别取3个不同的玉米样品，各做两个平行试验，前处理按照上述方法进行，免疫亲和柱净化，分别上高效液相色谱和液质联用仪分析，考察检测方法的重复性。
2 结果与分析
2.1 线性关系对比
在HPLC条件下，取上述不同质量浓度标准溶液供HPLC分析，以出峰时间定性，峰面积定量，标准曲线及液相色谱图结果分别见图1和图2。由图1可知，脱氧雪腐镰刀菌烯醇标准曲线回归方程为y=74 700x-1 770，相关系数R=0.999 9，表明二者线性关系良好。由图2可知，脱氧雪腐镰刀菌烯醇的保留时间为8.279 min。
图1 脱氧雪腐镰刀菌烯醇液相色谱法标准曲线
Fig.1 Standard curve of deoxynivalenol by HPLC
试验过程中发现标准溶液质量浓度5 000 ng/mL的点峰型趴，不尖锐，不对称，当把标准工作液的配制溶液由乙腈换成乙腈+水（10∶90，V/V）之后，再配制标准曲线的最大浓度点，峰型既对称又尖锐，分析原因是受溶剂效应影响，标准工作溶液是纯乙腈配制，标准曲线是用流动相配的，而最大的浓度点添加了500μL的标准工作溶液，水的极性大于乙腈极性，导致最大浓度点的溶液极性强度小于流动相极性强度，峰型变趴，换了标准工作溶液的配制溶剂后，再配制标准曲线的点，峰型既对称又尖锐。
图2 脱氧雪腐镰刀菌烯醇液相色谱图
Fig.2 Liquid chromatogram of deoxynivalenol
在LC-MS条件下，取上述不同质量浓度标准溶液供LC-MS分析，标准曲线及离子色谱图结果分别见图3和图4。内标法以出峰时间和定性离子与定量离子的离子比定性，内标准确定量；外标法以出峰时间和定性离子定性，定量离子峰面积定量。由图3可知，内标法标准曲线回归方程为y=0.008 39x+0.011 06，外标法标准曲线回归方程为y=7 333.5x+3 752.4，相关系数R2均为0.999 9，表明二者线性关系良好。由图4可知，LC-MS条件下，外标法和内标法脱氧雪腐镰刀菌烯醇的保留时间均为5.34 min。试验过程中没有发现峰型趴而不尖锐，可能是因为液质条件下进样体积减小，受溶剂效应影响小。
图3 脱氧雪腐镰刀菌烯醇液质联用内标法（A）及外标法（B）分析标准曲线
Fig.3 Standard curve of deoxynivalenol analysis by LC-MS with internal(A)and external(B)standard method
图4 脱氧雪腐镰刀菌烯醇液质联用分析离子色谱图
Fig.4 Ion chromatogram of deoxynivalenol analysis by LC-MS
结果表明，无论是高效液相色谱法还是液质联用法，线性关系都非常好，LC-MS出峰时间比HPLC法快。HPLC法受溶剂效应影响大，避免溶剂效应要用流动相配制标准品和样品。
2.2 精密度试验
表2 精密度试验结果
Table 2 Results of precision tests
项目 HPLC法 LC-MS外标法 LC-MS内标法上机质量浓度/（ng·mL-1）检测质量浓度/（ng·mL-1）RSD/%1 000 980.66 993.96 1 005.24 1 012.65 988.38 1 011.31 1.31 100 99.56 99.98 99.12 102.35 100.99 101.25 1.20 100 100.32 100.21 99.85 100.09 99.58 99.37 0.37
按照样品测定方法，HPLC法吸取质量浓度为1000 ng/mL标准溶液，LC-MS法吸取质量浓度为100 ng/mL标准溶液，分别连续上机测定6次，得到两种方法精密度试验结果如表2所示。由表2可知，HPLC法相对标准偏差最大，为1.31%，LC-MS外标法其次，为1.20%，LC-MS内标法最小，为0.37%，即LC-MS内标法精密度最高。但两种方法精密度均能满足试验需求。
2.3 回收率试验
取空白玉米样品，分别做低、中、高3个水平加标回收试验，每个水平做3个平行。LC-MS内标法同时还加入内标，LC-MS法的加标量分别是40μg/kg、200μg/kg、1 000μg/kg，HPLC法的加标量分别是200μg/kg、1 000μg/kg、2 000μg/kg。按照上述试验方法处理上机，得到加标回收率试验结果见表3。由表3可知，LC-MS内标法的回收率在113.48%～119.27%，LC-MS外标法回收率在105.56%～108.71%，HPLC法的回收率在80.77%～91.92%，其结果相对标准偏差（RSD）均＜5%。结果表明，3种方法均具有良好的准确度，均能满足检测要求。
表3 加标回收率试验结果
Table 3 Results of adding standard recovery rate tests
测定方法 加标量/（μg·kg-1）回收率/%1 2 3平均回收率/%RSD/%液质联用内标法液质联用外标法高效液相色谱法40 200 1 000 40 200 1 000 200 1 000 2 000 118.35 110.35 113.25 108.54 108.64 103.39 80.32 90.21 84.65 119.25 113.23 111.21 109.37 105.94 107.86 79.89 92.32 83.81 120.2 118.47 115.98 108.22 110.05 105.43 82.11 93.22 83.98 119.27 114.02 113.48 108.71 108.21 105.56 80.77 91.92 84.15 0.93 4.12 2.39 0.59 2.09 2.24 1.18 1.55 0.44
2.4 重复性试验
按照样品测定方法，分别测定样品1、2、3中脱氧雪腐镰刀菌烯醇含量，考察方法的重复性，结果见表4。
表4 重复性试验结果
Table 4 Results of repeatability tests
样品 含量/（μg·kg-1）HPLC法 LC-MS内标法 LC-MS外标法RSD/%含量/（μg·kg-1）RSD/%含量/（μg·kg-1）RSD/%1 2 3/ / / // /4.270.77 26.96 25.38 60.47 59.97 235.68 232.58 0.591.94 218.61 224.181.780.94 24.82 24.55 53.67 52.22 228.64 226.810.57
由表4可知，样品1没有被脱氧雪腐镰刀菌烯醇污染，样品2和样品3轻度污染，GB 2761—2017《食品安全国家标准食品中真菌毒素限量》为1 000μg/kg，3个玉米样品均符合国家标准要求。每个样品两次测定结果非常接近，重复性试验结果RSD均＜5%，表明重复性良好。
2.5 方法定量限和检出限
按照S/N=10和S/N=3分别计算两种方法的定量限和检出限，得到HPLC法的定量限和检出限分别为76.82μg/kg、23.05 μg/kg，低于国标[17]给定的定量限200 μg/kg、检出限100μg/kg。LC-MS法的定量限和检出限分别为1.67μg/kg、0.502 μg/kg，低于国标[17]给定的定量限20 μg/kg、检出限10μg/kg。结果表明，LC-MS法比HPLC法灵敏度高，两种方法均能满足国家标准要求。
2.6 样品实际检测
分别取3个不同的玉米样品，各做两个平行试验，前处理按照上述方法进行，免疫亲和柱净化[18-21]，分别上高效液相色谱和液质联用仪分析，检测结果见表5。由表5可知，HPLC法检测发现只有1个阳性样品，而LC-MS内标法和外标法检测发现3个样品均为阳性样品。对比两个试验结果发现，样品1和样品2，用HPLC法检测是阴性，而LC-MS法检测是阳性，含量均＜100μg/kg。
表5 不同玉米样品中脱氧雪腐镰刀菌烯醇含量的检测结果
Table 5 Determination results of deoxynivalenol content in different corn samples
样品 检测值/（ng·mL-1）含量/（μg·kg-1）HPLC法 LC-MS内标法 LC-MS外标法均值/（μg·kg-1）检测值/（ng·mL-1）含量/（μg·kg-1）均值/（μg·kg-1）检测值/（ng·mL-1）含量/（μg·kg-1）均值/（μg·kg-1）1 2 3/ / / /109.961 113.255/ / / /218.61 224.18/ /221.395 15.317 13.654 33.563 35.231 129.034 133.154 26.96 25.38 60.47 59.97 235.68 232.58 26.17 60.22 234.13 15.017 13.654 28.85 30.68 133.18 124.18 24.82 24.55 53.67 52.22 228.64 226.81 24.69 52.95 227.73
为分析原因，做了空柱回收试验，即按试验流程，不加任何样品，只用试剂，上机检测发现高效液相色谱未检测到任何峰图，而液质联用仪检测出脱氧雪腐镰刀菌烯醇，质量浓度为19.384 ng/mL，说明这批免疫亲和柱有本底，而液质联用方法灵敏度比液相法高，检出限更低，造成样品1为假阳性，样品2被脱氧雪腐镰刀菌烯醇轻度污染，因为液相色谱灵敏度低，在其检出限以下，未能检测出来。样品3两种仪器均检测出脱氧雪腐镰刀菌烯醇，液相色谱检测出来比液质联用法低一些，是由于液质联用仪灵敏度高，免疫亲和柱有本底，液质联用外标法检测的结果中有本底，液质联用内标法经内标校正后造成结果偏高。
3 结论
比较免疫亲和柱-高效液相色谱（HPLC）法和免疫亲和柱-液质联用（LC-MS）法检测脱氧雪腐镰刀菌烯醇。结果表明，两种方法的线性关系均良好，R2=0.999 9；HPLC法、LC-MS外标法及内标法精密度试验结果相对标准偏差（RSD）分别为1.31%、1.20%及0.37%，回收率分别在80.77%～91.92%、108.71%～105.56%及113.48%～119.27%，精密度，回收率及重复性试验结果RSD均＜5%；HPLC法的定量限和检出限分别为76.82 μg/kg、23.05 μg/kg，LC-MS法的定量限和检出限分别为1.67μg/kg、0.502μg/kg，均低于国标给定标准。
比较两种仪器的检测方法，LC-MS内标法，需要脱氧雪腐镰刀菌烯醇内标，我国尚未研制脱氧雪腐镰刀菌烯醇生物标准物质[22]，这些标准物质一般都是进口，价格昂贵，一支13C15-脱氧雪腐镰刀菌烯醇内标几千块，只能做50批样品左右，试验成本大大提高。LC-MS法使用乙腈浸提，HPLC法使用水浸提，乙腈价格较高，有机物对实验人员也有一定伤害。在食品检测过程中，两种方法均能满足检测要求，综合考虑HPLC法更经济环保。在食品的脱氧镰刀菌烯醇的检测试验中，HPLC法线性和加标回收均能满足检测需要，实验室大批量检测时，HPLC法是较理想的选择。
[1]JAJIC I,KRSTOVIC S,KOS J,et al.Incidence of deoxynivalenol in Serbian wheat and barley[J].J Food Protect,2014,77(5)：853-858.
[2]BENNETT J W,KLICH M.Mycotoxins[J].Clin Microbiol Rev,2003,16(3)：497.
[3]陆晶晶，杨大进.2013年中国小麦粉中脱氧雪腐镰刀菌烯醇污染调查[J].卫生研究，2015，44（4）：658-660.
[4]TÜRKER L,GÜMÜS S.A theoretical study on vomitoxin and its tautomers[J].J Hazard Mat,2009,163(1)：285-294.
[5]PESTKA J J,SMOLINSKIA T.Deoxynivalenol：toxicology and potential effectson humans[J].J Toxicol Environ Health Part B,2005,8(1)：39.
[6]万小乐.高效液相色谱法测定粮食中呕吐毒素的方法研究[J].粮食加工，2016，41（4）：74-76.
[7]霍星华，赵宝玉，万学攀，等.脱氧雪腐镰刀菌烯醇的毒性研究进展[J].毒理学杂志，2008，22（2）：151-154.
[8]李群伟，侯海峰，李亚鲁，等.脱氧雪腐镰刀菌烯醇致家兔多脏器损伤的实验观察[J].中国地方病防治杂志，2007，22（1）：19-22.
[9]何樊，闫冬阁，陈渠玲，等.免疫亲和高效液相色谱法测定小麦粉品中脱氧雪腐镰刀菌烯醇的方法改进[J].现代食品科技，2018，34（1）：1-6.
[10]KARAMI-OSBOO R,MAHAM M,MIRIR,et al.Evaluation of dispersive liquid-liquid microextraction-HPLC-UV for determination of deoxynivalenol(DON)in wheat flour[J].Food Anal Meth,2013,6(1)：176-180.
[11]魏润蕴，王竹天.谷物中脱氧雪腐镰刀菌烯醇和雪腐镰刀菌烯醇的气相色谱测定[J].卫生研究，1996，25（4）：243-245.
[12]SHAR Z H,SUMBAL G A,SHERAZI S T H,et al.Determination of deoxynivalenol in poultry feed by three gas chromatographic detection techniques[J].Chromatographia,2014,77(3-4)：337-346.
[13]朱群英，索莉莉，胡美华.液质联用同位素内标法同时测定小麦粉中7 种真菌毒素[J].现代预防医学，2014，41（23）：4362-4365.
[14]KLINGLMAYR C,NOBAUER K,RAZZAZI-FAZELI E,et al.Determination of deoxynivalenol in organic and conventional food and feed by sol-gel immunoaffinity chromatography and HPLC-UV detection[J].J Chromatogr B,2010,878(2)：187-193.
[15]SOLEIMANY F,JINAP S,FARIDAH A,et al.A UPLC-MS/MS for simultaneousdetermination of aflatoxin A,zearalenone,DON,fumonisins,T-2 toxin and HT-2 toxin,in cereals[J].Food Control,2012,25(2)：647-653.
[16]熊齐荣，金涌，刑仕歌，等.胶体金试纸条法快速筛查小麦和玉米中脱氧雪腐镰刀菌烯醇的研究[J].食品科技，2014，39（2）：292-296.
[17]中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局，中国国家标准化管理委员会.GB 5009.111—2016食品安全国家标准食品中脱氧雪腐镰刀菌烯醇及其乙酰化衍生物的测定[D].北京：中国标准出版社，2016.
[18]王培，徐广超，尹丽梅，等.免疫亲和柱净化-高效液相色谱法同时检测小麦中脱氧雪腐镰刀菌烯醇及其衍生物[J].粮油食品科技，2015，23（1）：63-66.
[19]何攀，闫东阁，陈渠玲，等.免疫亲和高效液相色谱法测定小麦粉品中脱氧雪腐镰刀菌烯醇的方法改进[J].现代食品科技，2018，34（1）：1-6.
[20]免疫亲和层析净化高效液相色谱法测定小麦粉中脱氧雪腐镰刀菌烯醇方法的研究[J].食品科学，2018，39（2）：48-50.
[21]吴振兴，鲍蕾，静平，等.小麦和玉米中脱氧雪腐镰刀菌烯醇与雪腐镰刀菌烯醇的免疫亲和净化-高效液相色谱方法研究[J].食品安全质量检测学报，2014，5（12）：3848-3852.
[22]许娇娇，黄百芬，蔡增轩，等.面粉中脱氧雪腐镰刀菌烯醇标准物质的研制[J].中国食品卫生杂志，2016，28（3）：291-294.