吉林省长白山地区植物繁茂，盛产酸浆果（Fructus physalis）。酸浆果又称锦灯笼、红菇娘，成熟时果实为橘红色，酸甜多汁，其生长耐寒耐热，对土地适应性强。由于东北地区秋季昼夜温差大，有利于酸浆果糖分转化，因此，东北地区产出的酸浆果在口感和质量方面均属上乘。酸浆果富含包括酚类和黄酮类化合物在内的多种营养物质[1]，具有抗氧化[2]、清除自由基[3]、抑菌消炎[4]等作用。长白山也拥有丰富的蜜源植物，适合蜜蜂繁衍，很多蜜源植物属于长白山区的“道地药材”。长白山蜂蜜经蜜蜂采集后加以酿造，含椴树蜜80%～90%、杂花蜜10%～20%。蜂蜜由于含有多酚类物质而具有抗氧化性，由于蜜源不同，其多酚类物质的含量差异较大[5]。《本草纲目》记载蜂蜜能“除众病，久服强志轻身，不饥不老延年”[6]。在我国，酸浆果除鲜食外，其加工品很少在市面上销售，有关酸浆果开发方面的研究主要集中于酿酒[7-8]、饮料[3]及酸奶[9]等产品的研制。
酸奶由于其酸甜可口、营养丰富并能改善人体肠道菌群平衡状态，因此广受国内外消费者欢迎。目前，国内外的相关研究主要集中在酸奶的功能性方面。赵永波[10]研究蓝莓酸奶中的多酚类物质在贮藏、消化以及抗氧化活性等方面的变化情况，进而确定产品的营养功效；张鸿儒[11]以牛奶蛋白和大豆蛋白为主要原料，研制双蛋白益生菌酸奶并研究成品在贮藏期的理化性质和感官性质变化情况；苏颖晶[12]以山药、薏米、红豆、乳粉为原料制备全谷物酸奶，并研究益生菌对产品理化、流变学、抗氧化、抗消化以及糖代谢作用等的影响。
在机体的正常生命活动中，自由基处于生成和清除的平衡中，自由基代谢失衡易导致机体衰老并易引发多种疾病。本试验应用长白山酸浆果和蜂蜜等具有抗氧化活性的物质，制成酸浆果蜂蜜酸奶，并对酸奶在发酵及贮藏过程中抗氧化活性物质（总酚及总黄酮）含量及2,2-联氮-二（3-乙基-苯并噻唑-6-磺酸）二胺盐（2,2'-azino-bis（3-ethylbenzthiozoline-6）-sulphonic acid，ABTS）、1,1-二苯基-2-三硝基苯肼（1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl，DPPH）及羟基自由基清除能力进行检测；通过相关性分析和主成分分析等方法，研究酸浆果蜂蜜酸奶抗氧化活性的变化趋势，以期为具有抗氧化活性的功能性发酵乳制品的开发提供数据支持。
1 材料与方法
1.1 材料与试剂
1.1.1 材料
酸浆果：本地农贸市场；牛乳（蛋白质≥2.9%，脂肪≥3.1%）：黑龙江省完达山乳业股份有限公司；蜂蜜：本地农贸市场；酸奶发酵剂（保加利亚乳杆菌∶嗜热链球菌比例=2∶1）：安琪酵母股份有限公司。
1.1.2 化学试剂
ABTS、DPPH：美国Sigma公司；没食子酸（纯度98%）：上海纯优生物科技有限公司；芦丁（纯度98%）：北京坛墨质检科技有限公司；维生素C（vitamin C，VC）：上海阿拉丁生化科技股份有限公司；亚硝酸钠：吉林市友诚化工有限公司；硝酸铝：天津市富宇精细化工有限公司；氢氧化钠：郑州百利化工产品有限公司；水杨酸：南京华丰化工有限责任公司；所有化学试剂均为分析纯。
1.2 仪器与设备
HH-W600电热恒温水浴箱：金坛市医疗仪器厂；UV1900紫外可见分光光度计：上海棱光技术有限公司；GNP9080发酵箱：常州菲普实验仪器厂；CRS300实验室乳化机：上海驰翔新能源设备科技有限公司。
1.3 方法
1.3.1 酸浆果蜂蜜酸奶的制备工艺及操作要点
酸浆果料的制备：选择冷冻酸浆果，冲洗至表面洁净，然后利用乳化机1 000 r/min进行破碎处理5 min，过滤去籽，加入蜂蜜10%，混合均匀，制成酸浆果料，可溶性固形物含量为11.30%。
酸浆果蜂蜜乳液的制备：在牛奶中加入15%的酸浆果料，再加入蜂蜜6%，混合均匀，利用乳化机1 300 r/min进行乳化处理10 min，然后加热至85℃，保持10 min后冷却至42℃。
酸浆果蜂蜜酸奶的制备：在酸浆果蜂蜜乳液中接入0.1%酸奶发酵剂（保加利亚乳杆菌∶嗜热链球菌=2∶1），混合均匀，在42℃的恒温条件下进行发酵12 h，发酵完成后，在4℃条件下冷藏12 h，即制得酸浆果蜂蜜酸奶。
1.3.2 分析检测
（1）样品中多酚类物质提取
称取酸浆果蜂蜜酸奶10 g置于离心管中，加入盐酸含量为0.33%的酸化甲醇，10 000 r/min离心2 min。将离心管置于-20℃的冰箱中，直立放置1 h，然后将离心管中的样品再次进行离心处理，8 000 r/min离心处理10 min，处理完毕后，小心取出离心管，用针管吸取出上清液，待测。
（2）样品中总酚含量测定
总酚含量检测采用福林-肖卡法[10，13]。取多酚类物质提取液0.3 mL置于10 mL具塞试管，加入福林酚试剂0.3 mL，混合均匀后放置5 min，再加入碳酸钠溶液（75 g/L）3 mL，混合均匀后放置5 min，用超纯水定容至10 mL，置于50℃水浴锅中，避光加热5 min，利用紫外分光光度计，在750 nm波长下测定样品吸光度值。以质量浓度分别为0、0.025 mg/mL、0.050 mg/mL、0.075 mg/mL、0.100 mg/mL、0.125 mg/mL、0.150 mg/mL、0.175 mg/mL、0.200 mg/mL、0.225 mg/mL、0.250 mg/mL的没食子酸标准溶液按照上述方法制作样品待测液，将0样作为空白，以没食子酸质量浓度（x）为横坐标，吸光度值（y）为纵坐标制作没食子酸标准曲线，酸浆果蜂蜜酸奶中多酚含量以没食子酸当量（gallic acid equivalent，GAE）表示（mg GAE/100 g）。
总黄酮含量检测采用亚硝酸钠-硝酸铝比色法[10]。取提取液1 mL置于5 mL具塞试管，加入5%亚硝酸钠溶液0.3 mL，混合均匀后静置6 min，然后加入10%硝酸铝溶液0.3 mL，混合均匀后静置6 min，再加入1 mol/L氢氧化钠溶液，用体积分数为85%甲醇定容至5 mL，混合均匀，于避光处放置15min，于562nm波长处测定样品吸光度值。以0、0.025mg/mL、0.05 mg/mL、0.075 mg/mL、0.100 mg/mL、0.125 mg/mL、0.150 mg/mL、0.175 mg/mL、0.200 mg/mL、0.225 mg/mL、0.250 mg/mL芦丁标准溶液制作标准曲线，酸浆果蜂蜜酸奶中黄酮含量以芦丁当量（rutin equivalent，RE）表示（mg RE/100 g）。
（3）羟基自由基清除能力检测
羟基自由基清除能力检测采用水杨酸法[14]。首先利用乳化机将酸浆果蜂蜜酸奶样品进行处理5 min，然后采用单层纱布过滤，移取滤液0.5 mL置于10 mL具塞试管中，再向试管中加入硫酸亚铁、水杨酸乙醇溶液、过氧化氢溶液各2 mL，混合均匀，置于37℃水浴中恒温30 min，于562 nm波长处测定样品吸光度值。样品的羟基自由基清除能力计算公式如下：
式中：Ax为加入酸浆果蜂蜜酸奶样品的吸光度值；A 0为超纯水代替样品的吸光度值；Ac为超纯水代替水杨酸的吸光度值。
（4）ABTS自由基清除能力检测
参照李俶等[15]的方法测定ABTS自由基清除能力。将7 mmol/L ABTS溶液和2.45 mmol/L过硫酸钾溶液等体积混合，置于避光处14 h。使用前，将其用无水乙醇稀释，使其在波长734 nm处的吸光度值为0.7±0.02，制成ABTS储备液。移取0.04 mL样品，向其中加入ABTS储备液3 mL，置于避光处6 min，在波长734 nm处测定其吸光度值。以质量浓度分别为0.025、0.050、0.075、0.10、0.125、0.150、0.175、0.200、0.225、0.250 mg/mL VC溶液制作VC标准曲线，结果用VC当量（VC equivalent，VCE）表示（mg VCE/100g）。样品的自由基（ABTS）清除能力计算公式如下：
式中：Ax为加入酸浆果蜂蜜酸奶样品的吸光度值；A 0为超纯水代替样品的吸光度值；Ac为超纯水代替ABTS储备液加入样品的吸光度值。
（5）DPPH自由基清除能力检测
参照MCCUE P P等[16-17]的方法测定DPPH自由基清除能力。称取0.1 mmol/L DPPH乙醇溶液8 mL分别与酸浆果蜂蜜酸奶样品2 mL或体积分数为95%乙醇2 mL（对照样品）混合均匀，避光静置30 min。将其用离心机3 500 r/min离心处理10 min，吸取上清液，在517 nm波长下测定吸光度值。样品的DPPH自由基清除能力计算公式如下：
式中：A 0为对照样品吸光度值；A 1为酸浆果蜂蜜酸奶样品吸光度值。
1.3.3 数据分析
试验数据平行检测3次，采用SPSS20.0软件对试验数据进行统计分析、相关性分析与主成分分析。
2 结果与分析
2.1 发酵及贮藏过程中总酚和总黄酮含量的变化
如图1所示，在发酵过程中，酸浆果蜂蜜酸奶中总酚含量呈现出明显的增加趋势，总增加幅度为41.31%。从发酵初期0～6 h，酸浆果蜂蜜酸奶中总酚含量从（61.24±1.25）mg/100 g增加至（67.54±3.11）mg/100 g；当发酵时间继续增加至12 h时，总酚的含量增加至（86.54±2.63）mg/100 g；总酚含量在发酵0～6 h和6～12 h的增加幅度分别为10.29%和28.13%，表明在发酵中后期，酸奶中总酚含量得到了大幅度的提高。酸奶中总黄酮含量随着发酵时间的增加而升高，发酵前总黄酮含量为（0.23±0.024）mg/100 g，发酵后总黄酮的含量为（0.41±0.027）mg/100 g，发酵后酸奶中总黄酮的含量约为发酵前的1.78倍，增加幅度为78.26%。
图1 酸浆果蜂蜜酸奶发酵过程中总酚及总黄酮含量的变化
Fig.1 Changes of total phenols and total flavonoids contents during fermentation process of Fructus physalis honey yoghourt
如图2所示，在贮藏过程（1～9 d）中，酸浆果蜂蜜酸奶中总酚的含量呈现出下降的趋势，总下降幅度为3.30%。在贮藏期1～7 d，酸奶中总酚含量从（86.05±3.02）mg/100 g下降至（84.82±1.69）mg/100 g，下降幅度为1.43%；在贮藏期7～9 d，总酚含量从（84.82±2.82）mg/100 g下降至（83.21±2.52）mg/100 g，下降幅度为1.90%，说明酸奶贮藏7 d后，总酚的含量大幅度下降，这可能是由于在酸奶体系中，乳酸菌的代谢导致了多酚类物质的转化或降解，导致多酚类物质的稳定性降低[18-19]。同时，酸奶中总黄酮的含量随着贮藏时间（1～9 d）的增加而降低，下降幅度为10.0%。在贮藏期1～5 d，酸奶中总黄酮含量从（0.40±0.021）mg/100 g下降至（0.37±0.019）mg/100 g，下降幅度为7.50%；在贮藏期5～9 d，总酚含量从（0.37±0.014）mg/100 g下降至（0.36±0.013）mg/100 g，下降幅度为2.70%，说明贮藏期前5 d，酸乳中总黄酮的含量大幅度下降，而贮藏中后期，总黄酮的下降速率放缓，这可能是由于酸奶体系中的酪蛋白、球蛋白等物质易与体系中的包括黄酮在内的多酚类物质结合，导致游离态的多酚类物质含量降低。
图2 酸浆果蜂蜜酸奶贮藏期总酚及总黄酮含量的变化
Fig.2 Changes of total phenols and total flavonoids contents during storage period of Fructus physalis honey yoghourt
2.2 发酵及贮藏过程中自由基清除能力的变化
如图3所示，在发酵过程中，酸浆果蜂蜜酸奶的三种自由基（羟基、ABTS、DPPH）清除能力均表现不同程度的提升，提升幅度分别为122.45%、145.89%、160.42%。在发酵初期0～3 h，酸奶样品的羟基、ABTS、DPPH自由基的清除能力分别从（23.12±1.01）mg/100 g、（25.08±1.32）mg/100 g、（20.64±1.17）mg/100 g增加至（28.23±1.08）mg/100 g、（31.14±0.87）mg/100 g、（26.53±1.12）mg/100 g，三种自由基清除能力的增加幅度分别为22.10%、24.16%、28.54%；从图3可以看出，酸奶样品发酵3～6 h，3种自由基清除能力的增加速率相近，但发酵6～9 h，ABTS、DPPH自由基的清除能力分别从（45.73±2.45）mg/100 g、（41.55±1.43）mg/100 g增加至（61.67±1.57）mg/100 g、（53.75±1.57）mg/100 g，增加幅度分别为34.86%、29.36%，然而羟基自由基的清除能力从（43.66±2.03）mg/100 g增加至（51.43±1.65）mg/100 g，增加幅度为17.80%；酸乳样品发酵9～12 h，其羟基、ABTS、DPPH自由基的清除能力的增加幅度分别为13.57%、8.24%、13.30%。由此可知，酸浆果蜂蜜酸奶在发酵0～9 h，其ABTS、DPPH自由基的清除能力快速提升，在发酵9～12 h，这两种自由基清除能力的增速放缓；而羟基自由基的清除能力在酸乳样品发酵0～6 h得到快速提升，在发酵6～12 h，其增速放缓。这可能是由于乳酸菌发酵作用使酸浆果中结合态的多酚类物质分解为游离酚，促使酸乳样品中游离多酚和游离黄酮含量增加，既能够清除自由基，也能够有效终止自由基反应，因此不同程度的提高了三种自由基的清除能力[19]。有研究表明，蜂蜜对羟基、ABTS、DPPH自由基的清除能力存在显著性差异，其中，对羟基自由基的清除能力相对较低，这可能与本试验中酸奶样品在发酵中后期对羟基自由基的清除能力增加速率放缓有关[20-21]。
图3 发酵过程中酸奶样品的羟基、ABTS和DPPH自由基清除能力的变化
Fig.3 Changes of hydroxyl,ABTS and DPPH radical scavenging activity of yoghourt samples during fermentation process
如图4所示，在贮藏过程中，酸浆果蜂蜜酸奶的羟基、ABTS、DPPH自由基清除能力均呈现不同程度的下降，下降幅度分别为11.92%、9.77%、12.74%。在贮藏1～3 d，其羟基、ABTS、DPPH自由基的清除能力分别从（58.40±2.47）mg/100 g、（66.51±2.32）mg/100 g、（60.89±1.98）mg/100 g降低至（57.33±1.74）mg/100 g、（65.11±1.54）mg/100 g、（58.42±1.79）mg/100 g，三种自由基清除能力的下降幅度分别为1.83%、2.10%、4.06%；从图4可以看出，在贮藏3～5 d，酸乳样品的三种自由基清除能力的下降速率相近；在贮藏5～7 d，酸乳样品的羟基、ABTS、DPPH自由基的清除能力分别从（55.7±1.08）mg/100 g、（63.85±2.30）mg/100 g、（57.13±1.13）mg/100 g降低至（53.21±1.72）mg/100 g、（61.32±1.67）mg/100 g、（55.93±1.70）mg/100 g，下降幅度分别为4.61%、3.96%、2.10%；在贮藏7～9 d，三种自由基下降幅度分别为3.33%、2.14%、5.01%。由此可以得出，在贮藏1～9 d，酸乳样品的羟基、ABTS、DPPH自由基清除能力的下降速率均非一致，并且下降速率变化没有明显规律。这可能是由于在酸乳样品贮藏过程中，酸乳体系中的蛋白与多酚类物质相结合，降低了多酚类物质的抗氧化性，因此在贮藏过程中，三种自由基的清除能力均呈现下降的趋势，也有研究表明，在酸奶中添加含有多酚类物质的果汁后，对体系中自由基的清除能力起到协同增效的效果，这可能是导致自由基清除能力下降幅度不同的部分原因[22-23]。
图4 贮藏期酸奶样品的羟基、ABTS和DPPH自由基清除能力的变化
Fig.4 Changes of hydroxyl,ABTS and DPPH radical scavenging activity of yoghourt samples during storage period
2.3 抗氧化活性主成分分析
主成分分析是在大量指标数据中，找到具有代表性的指标数据，其基本能表达整体数据信息，而达到简化数据信息的效果。在主成分分析中，指标数据的特征值越大，其包含的数据信息比例就越大，其作为主成分的贡献率就越高。由表1可知，在发酵过程中，酸奶样品总酚含量的特征值4.932明显高于其他四个指标的特征值，其方差贡献率为98.638%。因此，在发酵过程中，总酚含量这个主成分能代表抗氧化试验的数据信息特征。
由表2可知，在贮藏过程中，酸奶样品总酚含量的特征值4.739明显高于其他四个指标的特征值，其贡献率为94.777%。综合表1和表2，在发酵及贮藏过程中，在酸奶样品的总酚、总黄酮含量、羟基、ABTS、DPPH自由基清除能力五个指标中，仅有总酚含量一项主成分，说明五项指标数据具有较高的相关性。
表1 酸奶样品发酵过程中抗氧化活性主成分分析
Table 1 Principal component analysis of antioxidant activity during fermentation process of yoghourt sample
指标 总酚含量总黄酮含量羟基自由基清除能力ABTS自由基清除能力DPPH自由基清除能力总酚含量总黄酮含量羟基自由基清除能力ABTS自由基清除能力DPPH自由基清除能力特征值贡献率/%累计贡献率/%1.000 0.980 0.948 0.968 0.966 4.932 98.638 98.638 0.980 1.000 0.987 0.998 0.996 0.60 1.200 99.838 0.948 0.987 1.000 0.992 0.997 0.007 0.147 99.985 0.968 0.998 0.992 1.000 0.999 8 0.001 0.015 100.000 0.966 0.996 0.997 0.998 1.000 4.7×10-16 9.3×10-15 100.000
表2 酸奶样品贮藏过程中抗氧化活性主成分分析
Table 2 Principal component analysis of antioxidant activity during storage period of yoghourt sample
指标 总酚含量总黄酮含量羟基自由基清除能力ABTS自由基清除能力DPPH自由基清除能力总酚含量总黄酮含量羟基自由基清除能力ABTS自由基清除能力DPPH自由基清除能力特征值贡献率/%累计贡献率/%1.000 0.836 0.949 0.932 0.958 4.739 94.777 94.777 0.836 1.000 0.881 0.895 0.953 0.182 3.648 98.425 0.949 0.881 1.000 0.998 0.970 0.077 1.542 99.967 0.932 0.895 0.998 1.000 0.971 0.002 0.033 100.000 0.958 0.953 0.970 0.971 1.000-1.7×10-16-3.5×10-15 100.000
2.4 抗氧化活性相关性分析
试验采用皮尔森相关系数分析酸浆果蜂蜜酸奶在发酵及贮藏过程中总酚、总黄酮含量与三种自由基清除能力的相关性，结果见表3。由表3可知，在发酵过程中，酸浆果蜂蜜酸奶总酚含量与总黄酮含量及ABTS、DPPH自由基清除能力呈极显著正相关（P＜0.01），总酚含量与羟基自由基清除能力呈显著正相关（P＜0.05），总酚含量与三种自由基清除能力相关系数R在0.948～0.968；总黄酮含量与三种自由基清除能力均呈极显著正相关（P＜0.01），相关系数R在0.987～0.996。
由表4可知，在贮藏过程中，酸浆果蜂蜜酸奶的总酚、总黄酮含量分别与三种自由基清除能力呈显著正相关（P＜0.05），多酚含量与三种自由基清除能力相关系数R在0.949～0.958，黄酮含量与三种自由基清除能力相关系数R在0.881～0.953。相关研究表明，酚类物质含量与抗氧化能力呈正相关，这与酸浆果蜂蜜酸奶中酚类物质含量与自由基清除能力的相关性结果一致。在发酵及贮藏的过程中，酸奶样品的羟基、ABTS、DPPH自由基清除能力之间极显著相关（P＜0.01），在发酵过程中，三种自由基清除能力之间相关性系数R在0.992～0.998；在贮藏过程中，三种自由基清除能力之间相关系数R在0.970～0.998。有研究表明，机体内自由基的氧化与电子链的传递密切相关，这也许与三种自由基显著相关性有关[24]。
表3 酸奶样品发酵过程中自由基清除能力与总酚、总黄酮含量相关性分析
Table 3 Correlation analysis between free radical scavenging abilities and the contents of total phenols and total flavonoids during fermentation process of yoghourt sample
注：“*”代表数据相关性在 0.05 水平上为显著（P＜0.05）；**”代表数据相关性在0.01水平上为显著（P＜0.01）。下同。
指标 总酚含量总黄酮含量羟基自由基清除能力ABTS自由基清除能力DPPH自由基清除率能力总酚含量总黄酮含量羟基自由基清除能力ABTS自由基清除能力DPPH自由基清除能力1 0.980**0.948*0.968**0.969**0.980**1 0.987**0.998**0.996**0.948*0.987**1 0.992**0.997**0.968**0.998**0.992**1 0.998**0.969**0.996**0.997**0.998**1
表4 酸奶样品贮藏过程中自由基清除能力与总酚、总黄酮含量相关性分析
Table 4 Correlation analysis between free radical scavenging abilities and the contents of total phenols and total flavonoids during storage period of yoghourt sample
指标 总酚含量总黄酮含量羟基自由基清除率ABTS自由基清除率DPPH自由基清除率总酚含量总黄酮含量羟基自由基清除率ABTS自由基清除率DPPH自由基清除率1 0.836 0.949*0.932*0.958*0.836 1 0.881*0.895*0.953*0.949*0.881*1 0.998**0.970**0.932*0.895*0.998**1 0.971**0.958*0.953*0.970**0.971**1
3 结论
对酸浆果蜂蜜酸奶发酵及贮藏过程中总酚、总黄酮含量和羟基、ABTS、DPPH自由基清除能力进行了分析，并对酸浆果蜂蜜酸奶的抗氧化性进行了评价。结果发现，在发酵过程中，抗氧化物质（多酚、黄酮）含量增加，三种自由基的清除能力增加，其中，ABTS、DPPH自由基清除能力的增加趋势相近；在贮藏过程中，总酚、总黄酮含量呈不同幅度下降，3种自由基清除能力下降，其中，ABTS自由基清除能力在贮藏期保持相对较高的水平。
主成分分析结果表明，在发酵和贮藏中，总酚含量均为酸浆果蜂蜜酸奶抗氧化活性的主要成分，主成分方差贡献率分别为98.638%和94.777%。通过分析总酚、总黄酮含量以及羟基、ABTS、DPPH自由基清除能力的关系，结果表明，在发酵过程中，酸浆果蜂蜜酸奶总酚含量与总黄酮含量及ABTS、DPPH自由基清除能力呈极显著正相关（P＜0.01），总酚含量与羟基自由基清除能力呈显著正相关（P＜0.05），总黄酮含量与三种自由基清除能力均呈极显著正相关（P＜0.01）；在贮藏过程中，总酚、总黄酮含量分别与三种自由基清除能力呈显著正相关（P＜0.05）。可为酸浆果蜂蜜酸奶等功能性发酵乳制品开发提供理论数据和实践依据。
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