黄酒，作为世界三大古酒之一，有着丰富的营养成分，且酒度较低，故既可用做食品调味品，也能用做传统健康食品[1]。目前，黄酒的产地和消费主要集中在浙江、江苏两带，且其产量逐年可观，产品越来越多样化，包装更多元化。随着国内居民生活水平与健康意识的不断提高，健康、绿色、营养的消费观念已成为主流，黄酒不断更新发展[2]。广东客家黄酒中含有丰富的维生素族，对女性来说，长期饮用有很好的美容抗衰老效果。由于客家黄酒酒精度较为适中，还可作为药引子加以使用。目前在广东客家黄酒的产地主要集中在河源梅州一带，家家户户都会酿造属于自己的黄酒，不仅可以自己饮用，还可作为特产赠送给亲朋好友；客家人称黄酒为老酒，在当地，客家黄酒也被称为“月子酒”或者“鸡子酒”，适量饮用能够很好地让产妇在坐月子期间恢复元气，更加亮眼美丽[3]。有研究表明是黄酒之所以具有的较高抗氧化力，主要源于其所含的几种活性酚物质，酚物质易消耗氧，降低氧含量[4]。有报道表明，黄酒可发生美拉德反应，其产物有一定的抗氧化功能[5]，但是由于缺乏系统科学的探究，故而黄酒特有的保健功效尚未被证实[6]。本实验对黄酒的抗氧化性进行研究，以广东客家黄酒为原料来探究其体外的抗氧化能力，从而为更深层次的探究广东客家黄酒提供了有力的基础，有助于人们能科学地认识黄酒的保健功能，也为更深入研究黄酒的功能打下基础。
1 材料与方法
1.1 材料与试剂
牛血清蛋白（bovine serumal bumin，BSA）、2,2'-联氮-双（3-乙基-苯并噻唑啉-6-磺酸）二铵盐（2,2'-azino-bis（3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonate）diammonium，ABTS）、1,1-二苯基-2-三硝基苯肼（1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl，DPPH）、维生素E（vitamin E，VE）（均为分析纯）：美国Sigma公司；邻苯三酚、乙二胺四乙酸（ethylenediamine tetraacetic acid，EDTA）、没食子酸丙酯（propyl gallate，PG）、3,5-二硝基水杨酸（3,5-dinitrosalicylic acid，DNS）（均为分析纯）：阿拉丁试剂（上海）有限公司；广东客家黄酒：梅州市龙轩实业有限公司；福林酚试剂盒：合肥博美生物科技有限公司。
1.2 仪器与设备
TU-1901型紫外可见分光光度计：北京普析通用仪器有限公司；GM-1.0A隔膜真空泵：天津市津腾实验设备有限公司；DK-98II型电热恒温水浴锅：天津市泰斯特仪器有限公司；KDN-103F型自动定氮仪、308型消化炉：上海纤检仪器有限公司；TG16-WS台式高速离心机：湖南湘仪实验室仪器开发有限公司；LGJ-12型真空冷冻干燥机：北京松源华兴生物技术有限公司。
1.3 实验方法
1.3.1 ABTS+自由基清除能力[7]
ABTS+溶液的配制：采用2.45 mmol/L过硫酸钾溶液溶解0.384 1 g ABTS，配制7 mmol/L的ABTS+储备液，室温、避光条件下静置14 h待用。用10 mmol/L、pH为7.4磷酸盐缓冲溶液（phosphate buffered solution，PBS）稀释 ABTS+储备液，使其吸光度值在波长734 nm处达0.700。
样品测定：为评价广东客家黄酒的ABTS+的清除能力，以VE作为阳性对照，在20μL、40μL、60μL、80μL的黄酒中分别加入水至4 mL，即体积分数为5μL/mL、10μL/mL、15μL/mL、20μL/mL，加入到等体积的ABTS+充分混匀30 s，空白对照为4 mL ABTS+溶液和4 mL蒸馏水，分别测定于波长734 nm处的吸光度值。ABTS+的清除率计算公式如下：
式中：U为ABTS+的清除率，%；U0为空白对照的吸光度值；
Ux为待测样品的吸光度值。
1.3.2 DPPH自由基清除能力[7-8]
为评价广东客家黄酒的DPPH自由基清除能力，在0.2 mL、0.4 mL、0.6 mL、0.8 mL、1.0 mL的黄酒中分别加入水至2 mL，即体积分数为0.05 mL/mL、0.1mL/mL、0.15 mL/mL、0.2 mL/mL、0.25 mL/mL，加入等体积的浓度为0.1 mmol/L的DPPH溶液，混匀后在室温下避光反应0.5 h，取上清液在波长517 nm处测定吸光度值；空白对照组为2 mL的无水乙醇和2 mL样品液，以100μg/mL的VE溶液作为阳性对照。DPPH自由基清除率计算公式如下：
式中：X为DPPH自由基的清除率，%；A0为乙醇溶液替代样液的吸光度值；Ax为待测样品的吸光度值；Ax0为空白对照组的吸光度值。
1.3.3 超氧阴离子自由基清除能力[7-9]
在0.1 mL、0.2 mL、0.3 mL、0.4 mL、0.5 mL的黄酒分别加入水至1 mL，即体积分数为0.1 mL/mL、0.2 mL/mL、0.3 mL/mL、0.4 mL/mL、0.5 mL/mL，加入pH为8.2的Tris-HCl溶液5.0 mL，于25℃条件下保温20 min后立即加入相同温度的50 mmol/L邻苯三酚溶液1 mL，摇匀，在25℃条件下恒温水浴继续保持5 min，再加8 mol/L HCl溶液1 mL终止反应。在波长325 nm处测出各样品的吸光度值，由此算出邻苯三酚溶液的吸光度值随着时间的变化率。用超纯水调零，以100μg/mL没食子酸溶液为阳性对照。超氧阴离子自由基清除率计算公式如下：
式中：X为超氧阴离子的清除率，%；A 0为蒸馏水代替样液的吸光度值，Ax0为蒸馏水代替邻苯三酚溶液所得本底的吸光度值；Ax为待测样品的吸光度值。
1.3.4 羟自由基清除能力[10-11]
在0.05 mL、0.10 mL、0.20 mL、0.30 mL的黄酒中分别加入水至1 mL，即体积分数为0.05 mL/mL、0.10 mL/mL、0.20 mL/mL、0.30 mL/mL，分别加入2.25 mmol/L的FeSO4、9 mmol/L的水杨酸-乙醇溶液和8.8 mmol/L H2O2各1 mL，摇匀，在37℃条件下静置30 min，以超纯水调零，测出波长510 nm处的样品吸光度值[9]。用2 mL蒸馏水作为空白，以100μg/mL VE溶液作为阳性对照[10]。羟自由基清除率计算公式如下：
式中：X为羟自由基清除率，%；Ax为样品液吸光度值；Ax0为蒸馏水代替H2O2所得本底的吸光度值；A 0为蒸馏水代替样液的吸光度值。
1.3.5 还原能力测定[12-13]
在0.1 mL、0.2 mL、0.3 mL、0.4 mL、0.5 mL的黄酒中分别加入水至1 mL，即体积分数为0.1 mL/mL、0.2 mL/mL、0.3 mL/mL、0.4 mL/mL、0.5 mL/mL，将样品与pH值为6.6、浓度为0.2 mol/L、体积为2.5 mL的磷酸和30 mmol/L铁氰化钾2.5 mL混合，在50℃水浴条件中进行反应，20 min后加入0.6 mol/L三氯乙酸（trichloroacetic acid，TCA）2.5 mL并混匀。取2.5 mL的混合液，与2.5 mL蒸馏水、0.5 mL 6 mmol/L FeCl3混合，测出波长700 nm处吸光度值，以100μg/mL的VE溶液作为阳性对照。
1.3.6 测定金属离子鳌合能力[14-16]
在0.235 mL、0.47 mL、0.705 mL、0.94 mL的黄酒分别加入水至4.7 mL，即体积分数为0.05 mL/mL、0.10 mL/mL、0.20 mL/mL、0.30 mL/mL，分别与2 mmol/L的FeCl2溶液0.1 mL、5 mmol/L菲啰嗪（Ferrozine）溶液0.2 mL反应，静置20 min后，测出562 nm处吸光度值，以1 mmol/L EDTA作为阳性对照。吸光度值越高，则反映待测样品的金属离子鳌合能力越大，其计算公式如下：
式中：X为金属离子螯合能力，%；Ax为样品溶液吸光度值；Ax0为用蒸馏水替代Ferrozine溶液吸光度值；A0为用蒸馏水替代样品吸光度值。
2 结果与分析
2.1 ABTS+清除能力
广东客家黄酒对ABTS+的清除率，结果见图1。由图1可知，随着黄酒体积分数在5～20μL/mL范围的增加，黄酒对ABTS+清除率随之增加，并当广东客家黄酒添加量增至20μL/mL时其ABTS+清除率与VE相当。VE清除ABTS+的半抑制浓度（50%inhibiting concentration，IC50）值为（6.84±0.04）μL，而广东客家黄酒清除ABTS+的IC50值为（6.83±0.07）μL。结果表明，广东客家黄酒的ABTS+清除率与VE基本相当。
图1 广东客家黄酒清除ABTS+自由基能力
Fig．1 Scavenging ability of Guangdong Hakka Huangjiu on ABTS+free radical
2.2 DPPH自由基清除能力
广东客家黄酒与VE对DPPH自由基的清除率，结果见图2。由图2可知，当黄酒体积分数为0.05～0.15 mL/mL时，广东客家黄酒对DPPH自由基的清除能力低于VE；当黄酒体积分数为0.2 mL/mL，二者对DPPH自由基的清除能力相当；当黄酒的体积分数超过0.2 mL/mL之后，广东客家黄酒对DPPH自由基的清除能力有所下降。广东客家黄酒及VE的IC50值分别为（0.14±0.02）mL、（0.14±0.01）mL。结果表明，广东客家黄酒的ABTS+清除率与VE基本相当。
图2 广东客家黄酒清除DPPH自由基能力
Fig．2 Scavenging ability of Guangdong Hakka Huangjiu on DPPH free radical
2.3 超氧阴离子自由基清除能力
超氧阴离子自由基具有毒性，能使机体发生氧中毒，引发多种疾病[17]。广东客家黄酒与没食子酸对超氧阴离子自由基清除率，结果见图3。由图3可知，随着黄酒体积分数在0.1～0.5 mL/mL范围的增加，黄酒对超氧阴离子自由基清除率随之增加，但始终高于没食子酸。广东客家黄酒和没食子酸清除超氧阴离子自由基IC50值分别为（0.27±0.05）mL和（0.53±0.01）mL。结果表明，广东客家黄酒对超氧阴离子自由基清除率高于没食子酸。
图3 广东客家黄酒清除O2-·能力
Fig．3 Scavenging ability of Guangdong Hakka Huangjiu on superoxide anion free radical
2.4 羟自由基清除能力
羟自由基能破坏机体的DNA、核酸等生命物质，从而引发机体的多种疾病[18]。广东客家黄酒与VE对羟自由基清除率，结果见图4。由图4可知，随着黄酒体积分数在0.05～0.20 mL/mL范围内增加，广东客家黄酒和VE清除羟自由基的能力都在上升并清除率相当。在黄酒体积分数＞0.2 mL/mL之后，黄酒清除羟自由基的能力有所下降。广东客家黄酒与VE清除羟自由基的IC50值分别为（0.16±0.09）mL和（0.15±0.09）mL。结果表明，广东客家黄酒的羟自由基清除率与VE基本相当。
图4 广东客家黄酒清除OH-·能力
Fig．4 Scavenging ability of Guangdong Hakka Huangjiu on hydroxyl free radical
2.5 还原能力
图5 广东客家黄酒还原能力
Fig．5 Reducing power of Guangdong Hakka Huangjiu
待测样品的吸光度值可与其还原能力有关[19]。广东客家黄酒与VE还原能力，结果见图5。由图5可知，对比广东客家黄酒、VE的吸光度值变化曲线可知，当黄酒体积分数＞0.3 mL/mL以后，广东客家黄酒的还原能力与VE相当。结果表明，广东客家黄酒的还原能力与VE相当。
2.6 金属离子鳌合能力
当有其他相互竞争、能发生反应的络和剂存在时，会使Fe2+与Ferrozine溶液反应形成的物质颜色变淡[20]。广东客家黄酒与EDTA对金属离子螯合能力，结果见图6。由图6可知，金属离子的螯合能力最高，广东客家黄酒IC50值为（1.61±0.01）mL，相比于EDTA（IC50值为（0.14±0.02）mL），其金属离子螯合能力甚小。结果表明，广东客家黄酒的金属离子螯合能力低于EDTA。
图6 广东客家黄酒的金属鳌合能力
Fig.6 Metal ion chelating ability of Guangdong Hakaa Huangjiu
3 结论
经过试验证明，广东客家黄酒有着较好的抗氧化作用，不但还原能力强，对ABTS+自由基、DPPH自由基、超氧阴离子自由基和羟自由基等的清除作用明显。结果表明，客家黄酒清除ABTS+、DPPH、O2-、OH自由基及金属离子的螯合能力的IC50值分别为（6.83±0.07）μL、（0.14±0.02）mL、（0.27±0.05）mL、（0.16±0.09）mL及（1.61±0.01）mL，客家黄酒还原力为2.1。结果表明广东客家黄酒有着较好的体外抗氧化性能。
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