可食用抑菌保鲜膜已成为近年来研究的热点之一，可食用抑菌保鲜膜是以蛋白质、多糖和脂质为基质，辅以增塑剂和疏水剂，通过分子间不同种类的作用力而形成的膜。其不仅可以直接食用，还可被生物降解，可有效代替传统保鲜材料。目前可食性保鲜膜已在鲜肉及肉制品、水产品、葡萄保鲜技术[1-2]中进行应用研究。壳聚糖是一种类似纤维素结构的天然多糖，由于其具有良好的成膜性、透明度高、抗拉强度好、安全环保等优点，因此以壳聚糖为基质制成的保鲜膜（液），被广泛用于蓝莓[3]、圣女果[4]、鲜切茄子[5]、鲜切莴苣[6]等水果、蔬菜[7]保鲜技术中。在我国GB 2760—2007《食品添加剂使用卫生标准》中明确规定壳聚糖、溶菌酶和纳他霉素可用作食品防腐剂。溶菌酶是一种天然缩氨酸蛋白质抑菌剂，能够水解细胞壁所含的糖苷键，使细胞壁失去原本的功能；并且溶菌酶能够与病毒蛋白、细菌和真菌细胞内的遗传物质发生反应，以达到杀菌消毒的目的[8]。纳他霉素能有效抑制酵母菌和霉菌，其抑菌作用是山梨酸的50～300倍，广泛应用于干酪、发酵香肠、果汁、水果等食品中[9-10]。本试验将壳聚糖、溶菌酶、纳他霉素三种抑菌剂复合，弥补单一抑菌剂的不足，制备壳聚糖复合抑菌保鲜膜，并研究该保鲜膜的性能，为可食性抑菌保鲜膜在食品保鲜中的应用提供理论基础。
1 材料与方法
1.1 材料与试剂
壳聚糖（脱乙酰度≥90）：郑州雅菲生物科技有限公司；溶菌酶（酶活＞1.8万U/g）、纳他霉素：浦城保康生化有限公司；
大肠杆菌（Escherichia coli）、金黄色葡萄球菌（Staphyloccocus aureus）、酵母菌（Saccharomyces cerevisiae）、黑根霉（Rhizopus stolonifer）：均由北华大学病理实验室提供。
纯化甘油（分析纯）：檀博化工工业公司；海藻酸钠、羧甲基纤维素钠（sodium carboxymethyl cellulose，CMC-Na）（分析纯）：上海申光食用化学品有限公司；蛋白胨、琼脂、牛肉膏（均为生化试剂）：辽宁泉瑞试剂有限公司；葡萄糖（分析纯）：天津大茂化学试剂厂。
1.2 仪器与设备
FA2004A型电子分析天平：大连美翼实验室设备科技有限公司；Universal TA型质构仪：上海腾拔仪器科技有限公司；722N型可见分光光度计：合肥塞洛测控科技有限公司；HH-1型数显恒温水浴锅：金坛市富华仪器有限公司；LDZX-50FB型高压灭菌锅：上海申安医疗器械厂；SPX-2500S-Ⅱ型生化培养箱：上海新苗医疗器械制造有限公司；PHS-3C型pH计：北京京海佳业科贸有限公司。
1.3 实验方法
1.3.1 壳聚糖复合抑菌保鲜膜的制备
分别配制一定浓度的溶菌酶溶液、纳他霉素溶液、壳聚糖溶液、海藻酸钠溶液和CMC-Na溶液，按照比例混合均匀，最后加入甘油搅拌均匀。将（25±1）mL混合溶液倾倒入90 mm玻璃平板中，（25±1.5）℃条件下烘干24 h，成膜后揭膜，形成厚度1 mm左右的复合膜[11]。
1.3.2 影响壳聚糖复合抑菌保鲜膜的单因素试验
影响壳聚糖复合抑菌保鲜膜性质的主要因素有溶菌酶添加量、纳他霉素添加量、壳聚糖添加量、海藻酸钠添加量、CMC-Na添加量和甘油添加量。通过比较抑菌圈的直径，分别确定溶菌酶及纳他霉素的最佳添加量。以壳聚糖添加量分别为1.0%、1.5%、2.0%、2.5%、3.0%；海藻酸钠添加量分别为0.05%、0.10%、0.15%、0.20%、0.25%；CMC-Na添加量分别为0.05%、0.10%、0.15%、0.20%、0.25%；甘油添加量分别为0.5%、1.0%、1.5%、2.0%、2.5%进行混合，通过烘干、揭膜等工艺，根据评定标准进行评分，确定壳聚糖复合抑菌保鲜膜的最佳配方。
1.3.3 壳聚糖复合抑菌保鲜膜抑菌作用
壳聚糖复合抑菌保鲜膜采用滤纸圆片法[12]考察其分别对大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、酵母菌、黑根霉的抑菌作用。每个菌种做三组平行试验，空白组选用无菌水。
1.3.4 抑菌保鲜膜评价标准
分别测定复合膜的不同性能，根据表观黏性（20分）、抗拉强度（tensile strength，TS）（20分）、断裂延伸率（elongation at break，EAB）（20分）、水蒸气透过率（water vapor permeability，WVP）（20分）和透光率（20分）进行评分，综合评分满分100分，评分标准见表1。
表观黏性的测定：将复合膜固定在测试平台上，使用柱型探头，探头到平台的距离设定为20 mm，测定膜的黏性。每个样品做5个平行试验。
抗拉强度和断裂延伸率的测定：按照ARVENITOY ANNIS I等[13]的方法，采用质构仪测定膜的抗拉伸强度和断裂拉伸率。每个样品做5个平行实验，每个样品大小为30 mm×50 mm。抗拉强度值越大，表示韧性越大，评分越高；断裂延伸率值越大，评分越高。抗拉强度和断裂延伸率分别按照公式（1）和公式（2）计算。
表1 壳聚糖复合抑菌保鲜膜综合评价指标及标准
Table 1 Comprehensive evaluation indexes and standards of chitosan compound antibacterial fresh-keeping film
指标 标准 评分表观黏性/gf抗拉强度/MPa断裂延伸率/%水蒸气透过率/[（g·mm）/（h·m2·kPa）]透光率/%0～3 4～7 8～10 25～30 20～24 15～19 81～120 41～80 0～40 0.2～0.3 0.3～0.4 0.5～0.4 86～95 76～85 65～75 16～20 6～15 0～5 16～20 11～15 0～10 11～20 6～10 0～5 11～20 6～10 0～5 16～20 11～15 0～10
式中：TS为抗拉强度，MPa；F m为膜断裂时承受的最大拉力，N；L为膜的厚度，m；W为膜的宽度，m。测试方式设为拉伸，测试前速度1 mm/s。
式中：EAB为断裂延伸率，%；l max为膜断裂时抵达的最大长度，m；l0为膜的初始长度，m。
水蒸气透过率的测定：参考美国材料与试验协会制定的E 96-93标准[14]方法测定，每个样品做5个平行实验。水蒸气透过率值越大，评分越低。水蒸气透过率计算公式如下：
式中：WVP为试样的水蒸气透过率[（g·mm）/（h·m2·kPa）]；q/t为单位时间内透湿杯增加质量的算术平均值，g/h；d样品膜厚度，mm；S样品膜实验面积（m2），ΔP试样两侧的蒸汽压（kPa），由于膜两侧的梯度为50%，测定温度为25℃，ΔP为1.583 KPa。
透光率的测定：将复合膜剪成30 mm×50 mm的长条，贴在比色皿内侧，参考美国材料与试验协会制定的D1003-07标准[15]的方法在波长800 nm条件下测定其透光率（T），以空白为对照。透光率间接表示膜的透明度；透光率值越大，表示透明度越高，评分越高。
2 结果与分析
2.1 壳聚糖复合抑菌保鲜膜配方的试验结果
2.1.1 溶菌酶最佳抑菌添加量的确定
培养基在37℃条件下培养24 h后，比较不同溶菌酶添加量对大肠杆菌和金黄色葡萄球菌的抑菌圈的大小，确定溶菌酶的最佳抑菌添加量，试验结果见表2。
表2 不同溶菌酶添加量对抑菌圈直径的影响
Table 2 Effect of different lysozyme addition on the inhibitory zone diameter mm
溶菌酶添加量/% 0.007 5 0.015 0.03 0.06 0.12大肠杆菌金黄色葡萄球菌6.2±0.3 4.3±0.2 9.4±0.3 8.1±0.4 15.1±0.5 11.2±0.4 21.8±0.6 20.7±0.7 22.3±0.7 21.1±0.5
由表2可知，通过比较抑菌圈直径，当溶菌酶添加量＞0.06%时，溶菌酶的抑菌圈直径略微增大，而且溶菌酶会降低膜的透光率。因此确定溶菌酶最佳抑菌添加量为0.06%。
2.1.2 纳他霉素最佳抑菌添加量的确定
培养基在28℃条件下培养48 h后，比较不同纳他霉素添加量对酵母菌和黑根霉的抑菌圈的大小，确定纳他霉素的最佳抑菌添加量，试验结果见表3。
表3 不同纳他霉素添加量对抑菌圈直径的影响
Table 3 Effect of different natamycin addition on the inhibitory zone diameter mm
纳他霉素添加量/% 0.007 5 0.015 0.03 0.06 0.12酵母菌黑根霉8.7±0.4 13.1±0.4 11.2±0.5 17.2±0.6 22.8±0.7 23.7±0.5 22.3±0.7 23.3±0.8 22.7±0.6 24.2±0.8
由表3可知，纳他霉素添加量＞0.03%时，酵母菌的抑菌圈没有明显变化，而黑根霉的抑菌圈虽增大但不明显。因此选择0.03%作为纳他霉素最佳抑菌添加量。
2.1.3 壳聚糖添加量对复合膜综合评分的影响
图1 壳聚糖添加量对复合膜综合评分的影响
Fig.1 Effect of chitosan addition on comprehensive evaluation score of compound film
由图1可知，膜的综合评分随壳聚糖添加量的增加先增加后降低，主要是由于壳聚糖分子与海藻酸钠等成分通过分子间的静电、氢键相互作用，使得膜的抗拉强度有所增加，水蒸气透过率降低，但当壳聚糖添加量＞2.0%时，膜的抗拉强度基本没有变化；且膜的透光率有所下降。故综合考虑，壳聚糖添加量为2.0%。
2.1.4 海藻酸钠添加量对复合膜综合评分的影响[16]
图2 海藻酸钠添加量对复合膜综合评分的影响
Fig.2 Effect of sodium alginate addition on comprehensive evaluation score of compound film
由图2可知，随着海藻酸钠添加量增加，海藻酸钠与壳聚糖发生的静电相互作用也增强，因此膜的抗拉强度和断裂延伸率得到显著改善。但由于海藻酸钠亲水性较强，随着添加量的继续增加，膜的水蒸气透过率也相应增加[17]。根据综合评分，确定海藻酸钠添加量为0.15%。
2.1.5 CMC-Na添加量对复合膜综合评分的影响
图3 CMC-Na添加量对复合膜综合评分的影响
Fig.3 Effect of CMC-Na addition on comprehensive evaluation score of compound film
由图3可知，CMC-Na钠添加量在0.05%～0.15%时，膜的抗拉强度显著增加，在CMC-Na钠添加量为0.15%～0.25%时，膜的黏性过高，不易揭膜，而且透光率降低，使得膜综合评分降低。故根据综合评分，确定CMC-Na添加量为0.15%。
2.1.6 甘油添加量对复合膜综合评分的影响[18-20]
图4 甘油添加量对复合膜综合评分的影响
Fig.4 Effect of glycerin addition on comprehensive evaluation score of compound film
由图3可知，当甘油添加量＞1.5%时，甘油可以使基质分子内部氢键减弱，增加膜内部分子间的空隙，使得膜的水蒸气透过率增加，降低了膜的综合评分。故根据综合评分，确定甘油的添加量为1.5%。
2.1.7 壳聚糖复合抑菌保鲜膜最佳配方的确定
在单因素试验基础上，以壳聚糖添加量（A）、甘油添加量（B）、海藻酸钠添加量（C）、CMC-Na添加量（D）为评价因素，运用L9（34）正交试验进行优化确定最佳配方。采用模糊数学评价法对保鲜膜进行性能评定，从表观黏性、抗拉强度、断裂延伸率、水蒸气透过率、透光率五个方面进行综合评价，满分100分。试验结果见表4。
表4 复合膜配方优化正交试验结果与分析
Table 4 Results and analysis of orthogonal experiments for compound film formula optimization
试验号 A壳聚糖/%B C D甘油/%海藻酸钠/%CMC-Na/%综合评分/分1 2 3 4 5 6 7 8 9 1（1.5）1 1 1（1.0）2（1.5）3（2.0）1（0.10）2（0.15）3（0.20）1（0.10）2（0.15）3（0.20）2（2.0）2 2 3（2.5）3 3 1 2 3 1 2 3 2 3 1 3 1 2 3 1 2 2 3 1 80.38 96.00 88.25 92.74 93.00 92.50 90.32 94.50 88.60 k1 k2 k3 R 88.21 92.75 91.14 4.54 87.81 94.50 89.78 6.69 89.13 92.45 90.52 4.65 87.33 92.94 91.83 5.61因素主次最优组合B＞D＞C＞A A2B2C2D2
由表4可知，保鲜膜最佳配方组合为A 2B2C2D2，将表4中第2组A 1B2C2D2做对比试验，A 2B2C2D2综合评分97分高于A 1B2C2D2综合评分96分，因此壳聚糖复合抑菌保鲜膜的最佳配方为A2B2C2D2，即壳聚糖添加量2.0%、甘油添加量1.5%、海藻酸钠添加量0.15%、CMC-Na添加量0.15%。按照此配方制得的壳聚糖复合抑菌保鲜膜表观黏性为0.54 gf；抗拉强度为29.37 MPa；断裂延伸率为116.9%，透光率91.17%，水蒸气透过率0.221[（g·mm）/（h·m2·kPa）]。在此最佳配方条件下，保鲜膜综合评分为97分。
2.2 壳聚糖复合抑菌保鲜膜的抑菌试验结果
复合膜对大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、酵母菌和黑根霉的抑菌效果，结果见表5。
表5 复合膜对各菌种的抑菌圈直径的影响
Table 5 Effect of compound film on inhibitory zone diameter of various strains
菌种 大肠杆菌 金黄色葡萄球菌 酵母菌 黑根霉抑菌圈直径/mm 26.1±0.3 23.3±0.7 25.2±0.4 32.7±0.6
由表5可知，壳聚糖复合抑菌保鲜膜对大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、酵母菌、黑根霉均具有抑菌作用，且高于溶菌酶和纳他霉素单独对菌株的抑菌效果，各试验组的空白抑菌圈直径均为0。试验结果可以为壳聚糖复合抑菌保鲜膜在不同食品保鲜中的应用提供理论基础。
3 结论
通过综合评价，确定壳聚糖复合抑菌保鲜膜最佳配方为溶菌酶添加量0.06%，纳他霉素添加量0.03%，壳聚糖添加量2.0%，海藻酸钠添加量0.15%，CMC-Na添加量0.15%，甘油添加量1.5%。在此最佳配方条件下，保鲜膜综合评分为97分。壳聚糖复合抑菌保鲜膜无黏性，抗拉强度和断裂延伸率、透光率较高，水蒸气透过率较小，能够有效抑制大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、酵母菌、黑根霉。
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