稻壳约占稻谷质量的20%，含有约40%粗纤维和20%五碳糖聚合物及少量的粗脂肪、蛋白等有机物[1-2]。稻壳外壳坚硬，不易被土壤消化，同时较低的营养价值使其不适宜作饲料，因此产量较大的稻壳就会造成环境污染，放置时间较长还会容易发生自燃，如何充分利用稻壳是当前急需解决的问题。低聚木糖是由2～7个木糖分子以β-1,4糖苷键联结而成的功能性聚合糖，以木二糖和木三糖为主[3-4]，具有安全、无毒、低热、耐酸、耐热等良好的理化特性，还具有促进双歧杆菌增值，保护肝脏、降血压、增强机体免疫力等重要生理功能[5-8]，广泛应用于医药、功能性食品、饲料添加剂等方面[9-10]。
目前低聚木糖的提取方法常用酸水解法，利用该法水解不仅要求设备要防止酸腐蚀，而且需要耐高温、高压，需要的成本较高，同时木聚糖在酸性条件下水解速度较快，在低聚木糖水平上较难控制且还会产生较多的有害物质，使得到的低聚木糖质量较低[11]。近些年，微波技术由于其升温速度快，热效率高，能量传递迅速且利用充分，细胞内有效成分能快速溶出[12-13]等优点，被广泛应用于植物有效成分的提取方面，而且微波技术不需要太多的溶剂，被视为清洁高效的提取技术[14]。木聚糖酶是能够降解木聚糖的最主要酶之一，能进行定向酶水解生产低聚木糖[15]。李秀婷等[16]报道，木聚糖酶能使玉米芯中的水不溶性木聚糖产生木二糖、木三糖及木四糖等含量较高的低聚糖，合理利用木聚糖酶，能够提高玉米芯的利用率。
本试验采用微波预处理结合木聚糖酶法制备稻壳中的低聚木糖，在单因素试验的基础上采用Box-Behnken试验设计和响应面分析对制备工艺进行优化，以获得最佳工艺条件，为稻壳的工业化生产提供实践基础，对稻壳的利用与处理具有一定的指导意义。
1 材料与方法
1.1 材料与试剂
稻壳：黑龙江绥化某稻米厂提供，粉碎备用；木聚糖酶（50 000 U/g）：郑州万博食品配料有限公司；低聚木糖（纯度≥98%）：上海展云化工有限公司；3,5-二硝基水杨酸（3,5-dinitrosalicylic acid，DNS）：上海伊卡生物技术有限公司。
1.2 仪器与设备
TU-1901双光束紫外可见分光光度计：北京普析通用仪器有限责任公司；HH-6数显恒温水浴锅：江苏省金坛市荣华仪器制造有限公司；M1-L202B美的微波炉：佛山市顺德区美的微波电器制造有限公司。
1.3 方法
1.3.1 微波-木聚糖酶制备工艺
将剔除杂物的稻壳磨碎，称取3.0 g，置250 mL的锥形瓶中，加入柠檬酸缓冲液（pH 5.0）9 mL搅拌均匀，于一定的微波功率条件下处理一定的时间，取出晾凉后加入一定量的木聚糖酶，再加入柠檬酸缓冲液（pH 5.0）使料液比达到1∶20（g∶mL），在50 ℃水浴锅中酶解一定的时间后，沸水浴灭酶，离心得上清液，定容至50 mL容量瓶中，待测。
1.3.2 单因素试验
按照1.3.1的方法，分别研究微波功率（80 W、240 W、400 W、640 W、800 W），微波时间（2 min、3 min、4 min、5 min、6 min），酶解温度（40℃、50℃、60℃、70℃、80℃），酶解时间（1 h、2 h、3 h、4 h、5 h），料液比为（1∶5、1∶10、1∶15、1∶20、1∶25（g∶mL））对稻壳低聚木糖提取量的影响。
1.3.3 响应面优化试验设计
在单因素试验的基础上，采用Box-Behnken试验设计原理，以对制备低聚木糖含量有显著影响的微波功率（X 1）、酶解温度（X 2）及微波时间（X 3）3个因素进行响应面分析试验，以低聚木糖含量（Y）为响应值，确定稻壳低聚木糖制备的最佳工艺条件，试验设计因素水平编码见表1。
表1 低聚木糖制备条件优化响应面试验因素与水平
Table 1 Factors and levels of response surface experiments for xylooligosaccharide preparation conditions optimization
水平 X 1微波功率/W X2酶解温度/℃ X3微波时间/min-1 0 1 400 640 800 55 60 65 2.5 3.0 3.5
1.3.4 测定方法
低聚木糖含量测定参照参考文献[17]的方法，按下列公式计算：
式中：m′为从标准曲线中查得低聚木糖的质量，mg；V为样品提取液总体积，mL；N为样品提取液稀释倍数；V s为测定时所需样品提取液的体积，mL；m为样品质量，g。
2 结果与分析
2.1 单因素试验结果与分析
2.1.1 微波功率的影响
在不同微波功率条件下微波5 min后取出晾凉，加入4%木聚糖酶，料液比 1∶20（g∶mL），50 ℃水浴酶解2 h，考察不同微波功率对低聚木糖含量的影响，结果见图1。
图1 微波功率对低聚木糖含量的影响
Fig.1 Effect of microwave power on xylooligosaccharide content
由图1可知，微波功率＜640 W之前，低聚木糖含量随微波功率的增大而提高；微波功率为640 W时低聚木糖含量达到最大，为4.24 mg/g；当微波功率＞640 W之后，低聚木糖含量明显下降。原因可能是微波功率太小时，不足以提供足够的热使细胞破壁，更多的木聚糖不易暴露，进而使后续水浴酶解得到的低聚木糖含量相对较低，而较高的微波功率能够增加微波的辐射能量[18]，有利于细胞壁的破坏，进而使更多的木聚糖暴露。但功率过高时，瞬间加热致使过高的温度对木聚糖的结构产生影响，导致后续水浴酶解低聚木糖含量降低。因此，选择微波功率640 W为宜。
2.1.2 微波时间的影响
在微波功率640 W条件下，微波一定时间后取出晾凉，加入4%木聚糖酶，料液比 1∶20（g∶mL），50 ℃水浴酶解 2 h，考察不同微波时间对低聚木糖含量的影响，结果见图2。
图2 微波时间对低聚木糖含量的影响
Fig.2 Effect of microwave time on xylooligosaccharide content
由图2可知，微波时间＜3 min之前，随着时间的延长，低聚木糖含量增大；当微波时间为3 min时，低聚木糖含量达到最大，为4.09 mg/g；微波时间＞3 min之后，低聚木糖含量又迅速下降。这可能是因为微波加热升温非常迅速，处理时间过短，低聚木糖暴露不充分；当处理时间过长时，可能导致部分低聚木糖结构破坏，使后续木聚糖酶水解木聚糖得到的低聚木糖含量降低。因此，微波时间以3 min为宜。
2.1.3 酶解温度的影响
在微波功率640 W条件下微波3 min后取出晾凉，加入4%木聚糖酶，料液比 1∶20（g∶mL），一定温度下水浴酶解 2 h，考察不同酶解温度对低聚木糖含量的影响，结果见图3。
图3 酶解温度对低聚木糖含量的影响
Fig.3 Effect of enzymolysis temperature on xylooligosaccharide content
由图3可知，酶解温度＜60℃之前，随着温度的升高，低聚木糖含量增大；当酶解温度为60℃时，低聚木糖含量达到最大，为4.52 mg/g；酶解温度＞60℃之后，低聚木糖含量开始下降。原因可能是酶解温度过大不仅使酶发生了变性，而且得到的低聚木糖结构被破坏，低聚木糖的提取量降低，而酶解温度太低，木聚糖酶活性较低，不能使木聚糖充分酶解。因此，酶解温度以60℃为宜。张燕青等[15]报道，不同来源的木聚糖酶的最适温度为50～60℃，温度过高，会使酶的活性降低。
2.1.4 酶解时间的影响
在微波功率640 W条件下微波3 min后取出晾凉，加入4%木聚糖酶，料液比 1∶20（g∶mL），60 ℃水浴酶解一定时间，考察不同酶解时间对低聚木糖含量的影响，结果见图4。
图4 酶解时间对低聚木糖含量的影响
Fig.4 Effect of enzymolysis time on xylooligosaccharide content
由图4可知，酶解时间＜3 h之前，随着酶解时间的延长，低聚木糖含量增大；酶解时间为3 h时，低聚木糖含量达到最大，为4.24 mg/g；当酶解时间超过3 h之后，低聚木糖含量增加的幅度减少且趋于平缓。原因可能是酶解时间太短不能使木聚糖充分酶解得到更多的低聚木糖，而当酶解时间达到3 h时，可能木聚糖酶解作用完成，低聚木糖基本完全溶出，也可能是得到的产物对酶的反馈抑制作用增强[19]，酶解时间继续增加对提取量影响较小。因此，后续试验酶解时间以3 h为宜。
2.1.5 料液比的影响
在微波功率640 W条件下微波3 min后取出晾凉，加入4%木聚糖酶，以一定的料液比（g∶mL）在60℃水浴酶解3 h，考察不同料液比对低聚木糖含量的影响，结果见图5。
图5 料液比对低聚木糖含量的影响
Fig.5 Effect of solid-liquid ratio on xylooligosaccharide content
由图5可知，料液比增加的同时，低聚木糖含量呈上升趋势。当料液比1∶5～1∶15（g∶mL）时，低聚木糖含量增加速度较快，当料液比1∶15～1∶25（g∶mL）时，低聚木糖含量增长速度趋于平缓。这可能是当料液比较小时，物料黏度过大，酶解得到的低聚木糖不能充分溶出[20]，当料液比为1∶15（g∶mL）时，低聚木糖基本全部溶出，继续增加料液比，溶出的低聚木糖变化不明显。因此，为了节省能源，提高效率，选择料液比为1∶15（g∶mL）为最佳。
2.2 响应面试验结果与分析
在单因素试验的基础上，选取微波功率（X 1）、酶解温度（X 2）及微波时间（X 3）3个因素，以稻壳低聚木糖含量（Y）为响应值进行Box-Behnken试验设计，确定3因素3水平，共15个试验。其中12个析因点，3个0点，试验结果见表2。
利用Design-Expert 8.0.6软件对表2的数据进行多元回归拟合分析，得到的回归方程为：
回归方程的方差分析结果见表3。
由表3可知，模型P＜0.000 1，说明该模型高度显著，失拟项P=0.107 6＞0.05，说明失拟项不显著，回归方程对数据拟合较好，可以通过此模型来预测稻壳低聚木糖制备的最优条件。回归方程中，微波功率、酶解温度、微波时间的一次项均达到极显著水平（P＜0.01），说明这3个因素对低聚木糖含量的影响线性关系极显著，微波功率与微波时间的交互作用达到显著水平（P＜0.05），其响应面及等高线见图6，其他因素交互作用不显著。
表2 低聚木糖制备条件优化响应面试验设计及结果
Table 2 Design and results of response surface experiments for xylooligosaccharide preparation conditions optimization
试验号X1 X2 X3 Y低聚木糖含量/（mg·g-1）1 2 3 4 5 6 7 8 9 1 0-1-1 1 1 0 0 0 0 --1 1-1 1-1-1 0 0 0 0 -1 1 -1 1 -1-1 11 12 13 14 15 1 1 -1 1 0 0 0 1 1 0 0 0 0 0 0 0 1 1 0 0 0 4.03 3.74 4.59 4.19 4.25 4.74 3.83 4.43 3.45 3.69 3.79 4.29 4.91 4.87 4.89
表3 回归模型方差分析结果
Table 3 Variance analysis results of the regression model
注：“*”表示差异显著（P＜0.05）；“**”表示差异极显著（P＜0.01）。
变异来源 平方和 自由度 均方 F值 P值 显著性模型X1 X2 X3********X1X 2 X1X 3*X2X3 X12 X22 X32 165.85 175.81 110.90 217.27 1.48 8.81 1.38 567.54 25.56 351.95＜0.000 1＜0.000 1 0.000 1＜0.000 1 0.278 0 0.031 2 0.292 8＜0.000 1 0.003 9＜0.000 1******残差失拟项相关系数（R2）3.27 0.39 0.24 0.48 0.0032 41 0.019 0.003 025 1.24 0.056 0.77 0.011 0.010 0.996 7 9 1 1 1 1 1 1 1 1 1 5 3 0.36 0.39 0.24 0.48 0.003 241 0.019 0.003 025 1.24 0.056 0.77 0.002 190 0.003 838.460.107 6
由图6可知，响应曲面图曲线陡峭、等高线形状为椭圆形，说明微波功率与微波时间交互作用显著，这一结果与表3方差分析结果一致。
图6 微波功率与微波时间交互作用对低聚木糖含量影响的响应面（A）和等高线（B）
Fig.6 Response surface plots(A)and contour line(B)of effects of interaction between microwave power and microwave time on xylooligosaccharide content
根据模型预测得到的最优制备条件为微波功率637.04 W，酶解温度58.89℃，微波时间3.19 min，在此条件下理论低聚木糖含量为5.00 mg/g，为检测模型预测的可靠性及实际操作的便利性，制备工艺参数修正为微波功率640 W，酶解温度59℃，微波时间3.2 min，在此优化条件下，低聚木糖实际含量为4.94 mg/g，实际测定结果与理论值的相对误差为1.2%，综上所述，利用响应面法优化制备稻壳低聚木糖合理可行。
3 结论
通过响应面法对微波预处理辅助木聚糖酶制备稻壳低聚木糖的工艺进行了优化研究，结果表明，微波功率（W）、酶解温度（℃）、微波时间（min）对低聚木糖含量的影响线性关系极显著（P＜0.01），微波功率与微波时间的交互作用对低聚木糖含量的影响显著（P＜0.05）。通过响应面分析得到了制备的最优条件：微波功率640 W，微波时间3.2 min，酶解温度59 ℃，酶解时间3 h，料液比1∶15（g∶mL）。在此优化条件下，低聚木糖含量为4.94 mg/g。该研究为稻壳低聚木糖的制备提供了理论基础，同时充分利用稻壳资源，将其变废为宝，不仅能够解决资源浪费问题，也能增加农民的收入。
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