酸菜是在一定浓度的盐溶液中经微生物作用泡制而成的蔬菜食品[1]。东北酸菜的发酵多集中在冬季，以其酸香味醇、热量低、营养丰富、具有保健功效等特点而深受消费者的喜爱，并逐渐发展成为一种独特的饮食文化[2]。东北酸菜因其独特的地理环境及人文历史，在酸菜行业中占有弥足轻重的地位，日益成为人们餐桌上不可或缺的菜品。乳酸菌群在酸菜的发酵体系中发挥主导作用[3-4]，其发酵产生的酸、醇、酯等有机活性物质，结合食盐的渗透压作用，赋予酸菜独特的风味及质地[5]；同时代谢产生的乳酸和细菌素等物质可以抑制发酵体系中腐败微生物的生长[6]。此外，酸菜中乳酸菌更有助于人体消化、降胆固醇，以及调节生理机能等保健功效[7-10]。
目前东北酸菜的生产正处于自然发酵向人工发酵的转型期，发酵周期长、受温度影响大、产品安全性低等一系列问题使酸菜的规模化、标准化生产受到限制。针对这些问题进行的研究发现，乳酸菌的性能与酸菜的品质有着密切的关系，使用性能优良的乳酸菌发酵剂可强有力地推动酸菜发酵工艺的优化[11-13]。近年来，优良发酵性能乳酸菌的筛选已经成为高品质乳酸菌发酵剂开发领域的研究热点，有研究从发酵食品中分离出一些具有不同生理特性的乳酸菌，如高产酸耐酸菌株[14-15]、耐盐菌株[16-17]、低温型菌株等[18]；此外，筛选出降胆固醇菌株[19]、降解亚硝酸盐菌株[20-21]、抑菌菌株[22-23]等具有生理功能的乳酸菌株。但是，具有单一优良性能的乳酸菌很难同时满足实际生产中对于乳酸菌产酸、耐盐、抑菌等方面的需要。因此，以产酸、耐盐及抑菌能力为主要指标，从东北酸菜中筛选兼有多种优良性能的低温型乳酸菌对缩短发酵周期、提升酸菜品质具有重要意义。
本研究从传统东北酸菜中分离筛选高产酸乳酸菌进行分子生物学鉴定，并探究菌株的低温生长性能、耐盐特性及抑菌能力，从中获得优良发酵性能的乳酸菌，并对比分析接种乳酸菌发酵酸菜与自然发酵酸菜过程中的各项指标，旨在为东北酸菜的标准化生产和酸菜发酵剂的制备提供参考依据。
1 材料与方法
1.1 材料与试剂
1.1.1 材料
东北酸菜样品：从东北地区采集的不同家庭自制酸白菜样品11份；新鲜大白菜：东北农家。
1.1.2 菌株
大肠杆菌（Escherichia coli）ATCC 8739、金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）ATCC 6538：美国菌种保藏中心（American type culture collection，ATCC）。
1.1.3 培养基
MRS肉汤（琼脂）培养基、MRS琼脂培养基、营养肉汤（琼脂）培养基：北京奥博星生物技术有限责任公司；LB培养基：上海博微生物科技有限公司；CaCO3-MRS琼脂培养基：在MRS琼脂培养基中加入1.5%的碳酸钙。
1.1.4 试剂
细菌基因组脱氧核糖核酸（deoxyribonucleic acid，DNA）提取试剂盒：上海生物工程有限责任公司；氯化钠、无水乙醇、氢氧化钠（均为分析纯）：天津欧博凯化工有限公司。
1.2 仪器与设备
JTNJB牛津杯（内径为6.0 mm）：北京吉泰远成科技有限公司；T100 Thermal Cycler（polymerase chain reaction，PCR）仪：美国Bio-Rad公司；YXQ-LS-75SLL立式压力蒸汽灭菌器：上海博讯实业有限公司医疗设备厂；SW-SJ-2D型超净工作台：苏州净化设备有限公司；DHP-9012电热恒温培养箱：上海一恒科学仪器有限公司；ZHPW-70台式振荡培养箱：天津市莱玻特瑞仪器设备有限公司；UV1901紫外可见分光光度计：杭州艾普仪器设备有限公司。
1.3 方法
1.3.1 乳酸菌的分离
取酸菜汁样品用无菌生理盐水进行10倍梯度稀释，取适当稀释倍数的菌液1 mL于平皿中，倾注CaCO3-MRS琼脂培养基，待其凝固后，37℃厌氧培养48 h。挑取溶钙圈较大的单菌落转接到MRS平板上划线分离，反复纯化后，进行革兰氏染色、镜检及过氧化氢接触酶试验，判断革兰氏阳性、无芽孢、接触酶阴性的菌株为乳酸菌[24-25]。
1.3.2 高产酸乳酸菌的筛选
初筛：采用溶钙圈法[26]进行初筛。分别将分离的乳酸菌菌株划线于MRS琼脂培养基上，37℃厌氧培养48 h，挑取单菌落接种于MRS液体培养基中，37℃厌氧培养24 h。向培养皿中浇注CaCO3-MRS琼脂培养基，待其凝固后，用镊子将牛津杯垂直培养基表面于中央位置放置。在牛津杯中分别倾注0.5 mL菌液，37℃厌氧培养，待菌液变干后，取下牛津杯，继续培养48～72 h，每组试验重复3次，测量溶钙圈的大小。
复筛：分别将分离的乳酸菌菌株划线于MRS琼脂培养基上，37℃厌氧培养48 h，挑取单菌落接种于MRS液体培养基中，37℃厌氧培养24 h。取发酵液1 mL，加蒸馏水50 mL稀释后，采用NaOH溶液（0.1 mol/L）测定发酵液酸度。每组滴定试验重复3次。采用酸碱滴定法[27]测定酸度。
选取溶钙圈较大且酸度较高的菌株，以2%乳酸标准溶液为对照，采用纸层析法进行乳酸定性[28]。
1.3.3 高产酸乳酸菌的分子生物学鉴定
参照细菌基因组DNA提取试剂盒说明书提取高产酸乳酸菌的基因组DNA，以此为模板，使用16S rDNA通用引物（27F：5′-AACTGAGTTTGATCCTGGCTC-3′；1492R：5′-TACGGTTACCTTGTTACGACTT-3′）进行PCR扩增，PCR反应体系及反应参数均参见文献[29]。将经1%琼脂糖凝胶电泳检测后的PCR产物送至上海生物工程有限责任公司进行测序。利用基本局部比对搜索工具（basic local alignment search tool，BLAST）将测序结果与美国国家生物技术信息中心（national center of biotechnology information，NCBI）数据库中已知序列进行同源性比对，选取同源性较高的菌株使用MEGA7软件中的邻接法（neighbor joining，NJ）构建系统发育树。
1.3.4 高产酸乳酸菌发酵性能的测定
（1）不同温度生长性能的测定：将筛选得到的高产酸菌株在MRS琼脂培养基上划线，37℃厌氧培养48 h，得到的单菌落接种于MRS液体培养基中，37℃厌氧培养12 h，以3%（V/V）的接种量接种于MRS液体培养基，分别置于5℃、15℃、25℃条件下厌氧培养48 h，每组实验重复3次，测定发酵液的酸度和OD600nm值。
（2）耐盐性能的测定[30]：以3%（V/V）的接种量分别接种于NaCl含量为0、4%、6%、8%的MRS液体培养基中，37℃条件下厌氧培养24 h，每组实验重复3次，测定OD600 nm值。
（3）抑菌性能的测定
指示菌悬液的制备[31]：将大肠杆菌、金黄色葡萄球菌分别划线于营养琼脂平板，37℃培养48 h。分别挑取单菌落接种于营养肉汤培养基，28℃、200 r/min条件下培养24 h，调整菌体浓度约107 CFU/mL。
菌株上清液的制备[32]：挑取乳酸菌菌种接种于MRS液体培养基，37℃条件下培养24 h，按2%的接种量转接2次。4 000 r/min离心10 min（4℃），取上清液。
抑菌性能测定：采用牛津杯打孔法[33]进行测定。向培养皿中倾注10 mL灭菌后的0.5%～0.8%琼脂，待其凝固后，用镊子将牛津杯垂直培养基表面于中央位置放置。将2 mL指示菌悬液与200 mL LB琼脂培养基（50℃左右）混匀，吸取20 mL注入平板，待其完全凝固后，取出牛津杯，用移液枪在孔中注入100μL菌株上清液，4℃扩散1 h后，37℃恒温培养12 h，每组重复3次，用游标卡尺，采用十字交叉法测量抑菌圈直径，根据比较抑菌圈直径判断菌株抑菌性能。抑菌圈直径＞7 mm时，判为有抑菌作用。
1.3.5 优良乳酸菌发酵酸菜的制备
按照参考文献[34]制备发酵酸菜，盐水浓度为8%，优良乳酸菌的添加量为0、1%、3%、5%，15℃条件下静置发酵，每隔3 d取样测定pH值并进行感官评价。
1.3.6 分析方法
pH值测定[35]：采用玻璃电极法测定酸菜体系的pH值。
感官评价[36]：采用加权法对酸菜品质进行感官评定。由15名专业人员组成评定小组从视觉、嗅觉、味觉、口感等角度对酸菜的感官质量进行评价，满分为9分。评分标准见表1。
表1 东北酸菜的感官评分标准
Table 1 Sensory evaluation standards of pickle in the northeast of China
项目（加权系数）评分标准/分7～9 4～6 1～3视觉（0.2）嗅觉（0.2）味觉（0.3）口感（0.3）色泽鲜亮、饱满；汁液清澈发酵香味浓郁，无不良气味酸味浓郁脆嫩色泽新鲜汁液略浑浊发酵香味淡，无不良气味酸度适中较脆色泽暗淡、萎蔫汁液浑浊无香味或有不良气味口味寡淡或过分酸涩软绵
1.3.7 数据处理
采用Excel和SPSS 20.0进行数据统计，试验所有不同处理均做3次平行，结果用“平均值±标准差”表示，试验数据采用方差分析（analysis of variance，ANOVA）进行显著性差异分析，P＜0.05表示差异显著；采用GraphPad Prism 6.0软件制图。
2 结果与分析
2.1 乳酸菌的分离
在MRS固体培养基中经多次分离纯化，共筛选获得192株表面湿润、光滑，中间凸起、边缘整齐的细菌，经鉴定均为革兰氏阳性、无芽孢、过氧化氢阴性菌株。其中15株菌株溶钙圈较大，分别为DBC3、DBC9、DBC14、DBC17、DBC30、DBC33、DBC41、DBC49、DBC50、DBC60、DBC73、DBC75、DBC79、DBC84、DBC89。
2.2 高产酸乳酸菌的筛选
2.2.1 初筛结果
15株乳酸菌的溶钙圈直径测定结果见表2。
表2 不同乳酸菌的溶钙圈直径
Table 2 Diameter of dissolved calcium circle of different lactic acid bacteria
注：不同小写字母表示不同乳酸株溶钙圈直径差异显著（P＜0.05）。下同。
菌株编号DBC3 DBC9 DBC14 DBC17 DBC30 DBC33 DBC41 DBC49溶钙圈直径/cm 菌株编号 溶钙圈直径/cm 2.13±0.09cd 1.19±0.04ef 1.55±0.12g 2.31±0.13c 2.73±0.14a 2.71±0.19ab 1.53±0.08g 1.95±0.19de DBC50 DBC60 DBC73 DBC75 DBC79 DBC84 DBC89 1.72±0.08fg 2.53±0.12b 1.96±0.14de 1.56±0.05g 1.63±0.08g 1.59±0.13g 1.53±0.04g
由表2可知，15株乳酸菌均可在CaCO3-MRS琼脂培养基上形成透明的溶钙圈，其中乳酸菌DBC3、DBC17、DBC30、DBC33、DBC60产生的溶钙圈显著大于其他菌株（P＜0.05），因此，初步判断其为高产酸乳酸菌，其中乳酸菌DBC30的溶钙圈直径（2.73±0.14 cm）最大。为进一步确定菌株的产酸能力，对15株乳酸菌进行复筛。
2.2.2 复筛结果
15株乳酸菌发酵液的酸度测定结果见表3。
表3 不同乳酸菌的产酸性能比较
Table 3 Comparison of acid-producing performance of different lactic acid bacteria
菌株编号DBC3 DBC9 DBC14 DBC17 DBC30 DBC33 DBC41 DBC49酸度/（×10-1 mol·L-1）菌株编号酸度/（×10-1 mol·L-1）1.91±0.06c 1.50±0.07d 1.22±0.09ef 2.02±0.06bc 2.29±0.07a 2.25±0.09a 1.17±0.05efg 1.34±0.06e DBC50 DBC60 DBC73 DBC75 DBC79 DBC84 DBC89 1.21±0.05ef 2.15±0.07ab 1.28±0.04e 1.03±0.09gh 0.96±0.16h 1.10±0.07fgh 0.93±0.20h
由表3可知，乳酸菌DBC3、DBC17、DBC30、DBC33、DBC60的发酵液酸度明显高于其他菌株（P＜0.05），与初筛所得结果相一致，酸度均≥（1.91±0.06）×10-1 mol/L。其中乳酸菌DBC30发酵液酸度最高，为（2.29±0.07）×10-1 mol/L。乳酸菌DBC3、DBC17、DBC30、DBC33、DBC60的产酸能力为DBC30＞DBC33＞DBC60＞DBC17＞DBC3。因此，确定以上5株菌为高产酸乳酸菌。
2.2.3 乳酸定性结果
2%乳酸标准液和5株高产酸乳酸菌发酵液的纸层析比移值（Rf值）见表4。
表4 不同乳酸菌发酵液Rf值的测定结果
Table 4 Determination results of Rf values of the fermentation broth of different lactic acid bacteria
注：不同字母表示差异显著（P＜0.05）。下同。
菌株名称/标准液 乳酸 DBC3 DBC17 DBC30 DBC33 DBC60 Rf值 0.719±0.005a 0.721±0.005a 0.716±0.005a 0.725±0.011a 0.722±0.009a 0.724±0.004a
乳酸标准液Rf值与5株高产酸乳酸菌发酵液的Rf值之间均无显著性差异（P＞0.05），表明5株乳酸菌代谢产生乳酸。
2.3 高产酸菌株分子生物学鉴定
5株高产酸乳酸菌DBC3、DBC17、DBC30、DBC33、DBC60的系统发育树见图1。
图1 5株高产酸乳酸菌株的系统发育树
Fig.1 Phylogenetic tree of 5 lactic acid bacteria with high-yield acid
由图1可知，菌株DBC3、DBC17、DBC30、DBC33、DBC60与植物乳杆菌（Lactobacillus plantarum）ST-III聚于一支，同源性分别为100%、99.93%、99.78%、99.78%、99.78%。在16S rRNA基因序列比对中，对属和种的界定为：属于同一个属的最低同源性为95%[37]，当同源性＞97%时，属于同一个种[38]，因此，这5株菌均被鉴定为植物乳杆菌（Lactobacillus plantarum）。
2.4高产酸乳酸菌发酵性能的测定
2.4.1 高产酸乳酸菌不同温度生长性能测定
酸菜的生产过程中，酸菜的品质与发酵温度密切相关。发酵温度过高，发酵体系中同型发酵居于主导，乳酸大量积累，对酸菜的组成、色泽及风味均产生不同程度的破坏。相比于常温发酵，低温发酵酸菜的风味及色泽更佳，主要是由于酸菜发酵产生的二氧化碳和有机酸在低温条件下，更易渗透进入酸菜组织和汁液[39]，并且低温发酵有利于酸菜保存期的延长[40]。此外，大白菜的收获及发酵多在低温时节，因此，用于酸菜实际生产的菌株需具有良好的低温生长能力。5株高产酸乳酸菌在不同温度条件下的生长能力结果见图2。
图2 不同培养温度对5株高产酸乳酸菌酸度（A）及OD600 nm值（B）的影响
Fig.2 Effect of different culture temperature on the acidity(A)and OD600 nm values(B)of 5 lactic acid bacteria with high-yield acid
由图2可知，乳酸菌发酵液的酸度和OD600 nm值的结果一致，不同温度下各乳酸菌的生长能力存在不同程度的差异，5℃条件下乳酸菌生长能力较弱；在5～25℃范围内，随温度的升高，5株高产酸乳酸菌生长能力均有不同程度的提升。其中15℃和25℃条件下，菌株DBC33均可正常生长，表现出较强的生长能力（P＜0.05），在15℃条件下（酸菜的一般发酵温度）培养24 h后，发酵液的酸度和OD600 nm值分别为（2.11±0.09）×10-1 mol/L和1.81±0.05，为筛选得到的低温型乳酸菌，但对该菌株低温下的应激反应及低温耐受机制需做进一步的研究。
2.4.2 高产酸乳酸菌耐盐性能的测定
在酸菜发酵体系中，需要加入一定质量的食盐。食盐利用渗透平衡作用，保持细胞的渗透压，对酸菜脆性和色泽的保护发挥积极的作用。此外，食盐产生的高渗透压作用可抑制有害微生物的生长代谢活动，降低酸菜腐败变质的可能性。然而随着盐含量的增加，不断提高的渗透压对乳酸菌生理代谢的抑制逐渐明显，从而影响其产酸能力，延长酸菜的发酵周期[41-42]。有研究报道[43-44]，当食盐含量达8%时，对乳酸菌的抑制较为明显。5株高产酸乳酸菌对不同NaCl含量的耐受能力结果如图3所示。
图3 5株高产酸乳酸菌在不同NaCl含量下的生长情况
Fig.3 Growth situation of 5 lactic acid bacteria with high-yield acid under different NaCl contents
由图3可知，5株高产酸乳酸菌的OD600 nm值与培养基中NaCl含量呈负相关，该结果与前人的研究结论相一致[43]。其中在不含NaCl的MRS液体培养基中，5株高产酸乳酸菌均可正常生长，OD600 nm值基本一致（P＞0.05）；在NaCl含量为4%的MRS液体培养基中，5株乳酸菌的OD600 nm值有所下降，生长状况受到影响；在NaCl含量为6%的MRS液体培养基中，5株乳酸菌的OD600 nm值差异显著（P＜0.05），乳酸菌的生长能力为DBC33＞DBC60＞DBC30＞DBC17＞DBC3；当NaCl含量达到8%时，乳酸菌DBC33的OD600 nm值为0.64±0.04，显著高于其他菌株（P＜0.05），表明此菌株对高含量的NaCl具有较强的耐受能力，具有较大的应用潜力。
2.4.3 高产酸乳酸菌抑菌能力的测定
在酸菜发酵初期，发酵体系中微生物的种类较为复杂，其中蔬菜表面附生的细菌、真菌等有害微生物对产品的风味及安全性产生不同程度的影响。乳酸菌代谢产生的有机酸及细菌素等抑菌因子，可抑制酸菜中常见病原菌的代谢增殖[45]。CALIX-LARA T F等[46]通过试验表明乳酸菌可显著降低大肠杆菌和沙门氏菌的活性；ELYAS Y Y A等[47]报道从苏丹发酵食品中分离出的40株乳酸菌对金黄色葡萄球菌和大肠杆菌均表现出不同程度的抑制作用。5株高产酸乳酸菌对指示菌大肠杆菌ATCC 8739（G-）和金黄色葡萄球菌ATCC 6538（G+）的抑制作用结果如表5所示。
表5 5株高产酸乳酸菌的抑菌能力
Table 5 Antibacterial ability of 5 lactic acid bacteria with high-yield acid
注：“ND”表示无抑菌能力。
菌株代号DBC3 DBC17 DBC30 DBC33 DBC60抑菌圈直径/mm大肠杆菌（G-）金黄色葡萄球菌（G+）14.41±0.89a 8.42±0.17d 12.86±1.08b 10.86±0.70c 8.46±0.37d 10.62±0.63a ND ND 9.43±0.34a ND
由表5可知，5株高产酸乳酸菌对大肠杆菌ATCC 8739均具有明显的抑菌效果，且乳酸菌DBC3和DBC30的抑制效果最为明显，其抑菌圈分别为（14.41±0.89）mm和（12.86±1.08）mm；而仅有乳酸菌DBC3和DBC33对金黄色葡萄球菌ATCC 6538表现出较强的抑制作用，抑菌圈分别为（10.62±0.63）mm和（9.43±0.34）mm，乳酸菌DBC17、DBC30、DBC60对金黄色葡萄球菌ATCC 6538均无明显的抑菌作用。其中菌株DBC3抑菌作用最强，可能是由于相同生长条件下，菌株DBC3分泌抑菌物质较多，或者对指示菌的细胞破坏能力更强[48]。且菌株DBC3具有较广的抑菌谱，对大肠杆菌ATCC 8739和金黄色葡萄球菌ATCC 6538的抑制作用都显著优于其他菌株（P＜0.05），这可能与菌株自身特性相关。
一直以来，从自然资源中分离筛选微生物被认为是获得工业生产菌株的重要途径，本试验区别于前人着重于乳酸菌的单一特性研究[14，23，49-51]，通过对5株高产酸乳酸菌在不同温度、盐含量下的生长能力及抑菌能力进行对比分析，筛选出兼有多种性能的乳酸菌DBC3和DBC33。
2.5优良乳酸菌发酵酸菜的品质特性
乳酸菌DBC3和DBC33的不同接种量对发酵酸菜pH值的影响结果见图4，对发酵酸菜感官评分的影响见表6。
图4 15℃条件下不同接种量对菌株DBC3（A）及DBC33（B）发酵酸菜pH值的影响
Fig.4 Effect of different inoculum on pH value of fermented pickle by strain DBC 3(A)and DBC33(B)at 15℃
由图4可知，发酵前12 d内各发酵体系的pH值迅速下降，随时间延长下降速度逐渐趋于平缓。相比于自然发酵，接种菌株DBC3和DBC33可明显加快发酵体系pH的降低。总体来看，接种菌株DBC33的发酵体系pH值普遍低于接种菌株DBC3的发酵体系，并且在0～5%的接种范围内，发酵速度与接种量呈正相关，即菌株接种量越大，发酵速度越快。但乳酸菌接种量过高不仅增加生产成本并且不同程度上破坏酸菜的风味及结构，结合表6，接种乳酸菌DBC33且接种量为3%时，酸菜品质综合评分显著高于其他发酵处理（P＜0.05），为（8.10±0.18）分，说明接种3%乳酸菌DBC33可显著提高酸菜发酵品质，且发酵18 d即可达到发酵酸菜所需pH[52]，明显缩短酸菜发酵周期，降低生产成本，保证了菌株用于东北酸菜工业化生产的可行性。
表6 不同接种量发酵酸菜的感官评价结果
Table 6 Sensory evaluation results of fermented pickle with different inoculum
菌株 接种量/% 视觉/分 嗅觉/分 味觉/分 口感/分 总分/分DBC3 DBC33 0 1 3 5 1 3 5 5.95±0.51c 6.15±0.46c 6.77±0.42b 6.28±0.54c 7.00±0.56b 7.56±0.55a 7.09±0.68b 5.82±0.60d 6.26±0.44c 7.05±0.54b 6.43±0.39c 7.26±0.35b 7.87±0.39a 7.45±0.42b 6.25±0.92c 6.45±0.39c 7.60±0.26b 6.40±0.57c 7.39±0.39b 8.55±0.26a 7.29±0.57b 5.72±0.65d 5.46±0.79d 7.23±0.33c 5.75±0.52d 6.38±0.84c 8.11±0.31a 6.59±0.67b 5.99±0.36c 6.05±0.31c 7.21±0.25b 6.19±0.29c 6.98±0.34b 8.10±0.18a 7.07±0.33b
3 结论
本研究从传统东北酸菜中分离得到192株乳酸菌，其中5株为高产酸乳酸菌，经分子生物学鉴定5株高产酸乳酸菌均为植物乳杆菌（Lactobacillus plantarum）。5株高产酸乳酸菌经低温生长性能、耐盐特性及抑菌能力的测定，筛选得到兼有多种优良发酵性能的乳酸菌DBC3和DBC33并应用于发酵酸菜。其中接种3%乳酸菌DBC33可显著提高酸菜发酵品质，发酵18 d即可达到所需pH，感官评分为8.10分，明显缩短酸菜发酵周期，为东北酸菜发酵剂的制备和酸菜的标准化生产提供了参考依据。
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