中国白酒是世界著名的六大蒸馏酒之一，是一种以谷物为原料、酒曲为糖化发酵剂、采用双边或固态糖化发酵生产的酯香浓郁的蒸馏酒[1]。大曲作为白酒酿造过程中的糖化、发酵和生香剂，具有丰富的微生物和酶系，对白酒的风味和口感起关键性的作用[2]。因此，在我国传统酿酒行业一直流传着“曲乃酒之骨”[3-4]的说法。由于多种微生物富集在大曲里且在制曲过程中自然生长起来，因此整个大曲微生物复杂而多样[5]。
散囊菌属（Eurotium）真菌大量存在于传统发酵食品生产过程中，具有产多种生物酶以及吲哚衍生物、二酮哌嗪等活性次级代谢产物的性能[6-7]，可催化发酵食品中各种相关物质发生氧化、聚合、降解、转化，是一种重要的功能微生物类群。如茯砖茶中的“金花菌”-“冠突散囊菌（Eurotium cristatum）”，可产生多酚氧化酶、阿魏酸酯酶、酯化酶、纤维素酶、蛋白酶等多种生物酶，并具有降脂、降压、调节糖代谢、抗氧化、抑菌等功能[8-9]。目前，在传统白酒生产领域有关散囊菌的研究主要集中在分离鉴定水平，已有文献显示[10-12]，冠突散囊菌（E.cristatum）、谢瓦散囊菌（E.cheva lieri）、阿姆斯特丹散囊菌（E.amstelidami）均可分离自白酒大曲，其中谢瓦散囊菌在清香型、浓香型及浓香型大曲中均可分离到，且为浓香型和酱香型大曲中的优势真菌[12-13]，但对这些菌种在白酒大曲中的相关功能研究较少。
本研究通过多相鉴定和响应面方法[14]对该菌种进行分类学研究及培养条件优化，旨在提高其生物量，后期该菌种将主要以菌粉或菌剂形式强化于白酒大曲生产中，以达到提高大曲阿魏酸酯酶活性及改善大曲风味特征的效果，从而进一步提高酒体品质。
1 材料与方法
1.1 材料与试剂
1.1.1 试验菌株
散囊菌（Eurotium）CICC 41584：分离于山东扳倒井股份有限公司中高温大曲，保藏于中国工业微生物菌种保藏管理中心（China Center of Industrial Culture Collection，CICC）。
1.1.2 化学试剂
蔗糖、葡萄糖、乳糖、麦芽糖、果糖、麦芽糖、纤维二糖、可溶性淀粉：广东汕头西陇化工有限公司；酵母浸粉、牛肉浸粉、蛋白胨、大豆蛋白胨、胰蛋白胨：北京奥博星生物技术有限责任公司；硫酸铵、硝酸铵、MgSO4、FeSO4、CaCl2、KCl、NaCl、K 2HPO4（均为分析纯）：北京化学试剂公司；真菌脱氧核糖核酸（deoxyribonucleic acid，DNA）基因组提取试剂盒：生工生物工程股份有限公司。试验所用试剂均为分析纯或生化试剂。
1.1.3 培养基
察氏琼脂培养基（Czapek dox agar，CDA）、麦芽浸粉肉汤培养基（malt extract broth，MEB）：北京陆桥技术股份有限公司；API20C AUX试剂盒：生物梅里埃（中国）公司。
CDA培养基：蔗糖30 g/L，KCl 0.5 g/L，FeSO4·7H2O 0.01 g/L，K2HPO4 1.0 g/L，NaNO3 3.0 g/L，MgSO4·7H2O 0.5 g/L，琼脂15.0 g/L，自然pH，121℃灭菌15 min。
MEB培养基：麦芽浸粉20g/L，自然pH，121℃灭菌15min。
基础生长培养基：在MEB培养基中添加蔗糖40 g/L，自然pH，121℃灭菌15 min。
1.2 仪器与设备
Olympus BH-2光学显微镜：奥林巴斯有限公司；Hitachi SU8010扫描电镜：日本HITACHI公司；Tprofessional standard 96 Gradient聚合酶链式反应（polymerase chain reaction，PCR）仪：德国Biometra公司；FE20型pH计：梅特勒-托利多仪器（上海）有限公司；BHG-8082型恒温培养箱、THZ-98C恒温振荡培养箱：上海一恒科学仪器有限公司；SHB-III循环水式多用真空泵：郑州长城科工贸有限公司；CS101-3D电热鼓风干燥箱：重庆四达试验设备有限公司。
1.3 试验方法
1.3.1 菌株CICC 41584多相分类学鉴定
采用多相分类学鉴定技术对菌株CICC 41584的形态特征观察、生理生化试验以及分子生物学进行研究。
形态学观察：将菌株CICC 41584接种到察氏琼脂培养基上，25℃恒温培养7 d，观察菌落形态特征，并使用光学显微镜观察菌体特征。收集新鲜菌体，加入质量分数为2.5%的戊二醛，在4℃条件下固定过夜，离心收集菌体，使用pH 7.2、浓度100 mmol/L的磷酸盐缓冲液漂洗3次。分别使用体积分数50%、70%、85%、95%的乙醇溶液梯度脱水，无水乙醇脱水3次后使用临界冷冻干燥仪进行二氧化碳临界点干燥，再通过喷金-离子溅射仪进行喷金后，使用Hitachi SU8010扫描电镜观察菌丝及其孢子的形态特征[15]。
生理生化试验：采用API 20 C AUX试剂盒测定菌株CICC 41584对碳源底物的利用能力[16]。具体操作过程：首先将新鲜菌体加到0.85%NaCl缓冲液中，制备成2 McFarland菌悬液，准确吸取100μL菌悬液加到试剂盒培养基中，混匀后，滴加到API 20 C AUX试剂条中，25℃培养5 d，观察试验结果。
分子生物学鉴定：使用真菌DNA基因组试剂盒提取DNA，具体操作步骤见试剂盒说明书。利用引物Bt2a（5'GGTAACCAAATCGGTGCTGCTTTC3'）和Bt2b（5'ACCCTCAGTGTAGTGACCCTTGGC'）扩增β-tubulin基因[17]。PCR反应体系：10×PCR Buffer 5μL，脱氧核糖核苷三磷酸（deoxyribonucleoside triphosphate，dNTPs）（2.5 mmol/L）4 μL，模板2μL，Taq DNA聚合酶1μL，引物各1μL，补充去离子水至50μL。PCR反应条件：94℃预变性5 min；94℃变性50 s，55℃退火50 s，72 ℃延伸50 s，33个循环；72 ℃再延伸7 min[18]。PCR扩增产物使用1.0%的琼脂糖进行验证后，送于北京诺赛基因组研究中心有限公司进行测序。将测序结果在美国国家生物技术信息中心（national center of biotechnology information，NCBI）数据库中进行相似性比对，采用Blast程序进行同源性序列分析，使用MEGA 5.0构建系统发育树[19]。
1.3.2 种子液制备
菌种活化：将甘油保藏的菌株CICC 41584接种于CYA察式平板培养基中，待培养物产生大量黄色孢子后连续转接3次，备用。
种子液制备：挑取一环活化好的菌株接入装有200 mL液体的MEB培养基中，于28℃、120 r/min条件下恒温振荡培养7 d，制备成种子液。
1.3.3 培养条件优化单因素试验设计
碳源确定：在MEB培养基中分别添加葡萄糖、蔗糖、果糖、麦芽糖、乳糖、纤维二糖、可溶性淀粉（添加量为40 g/L）。接种量2%，装液量50 mL/250 mL，28℃、120 r/min恒温振荡培养7 d，培养结束之后用定性滤纸过滤，在80℃干燥箱中烘干至恒质量，测定菌丝干质量，毎组3个平行试验，考察不同碳源对菌丝干质量的影响。
氮源确定：在碳源优化的培养基基础上，分别添加酵母浸粉、NH4NO3、胰蛋白胨、蛋白胨、大豆蛋白胨、硫酸铵、牛肉浸粉（添加量为10 g/L），其他成分不变。接种量2%，装液量50 mL/250 mL，28℃、120 r/min振荡培养7 d，测定菌丝干质量，考察不同氮源对菌丝干质量的影响。
无机盐确定：在碳源、氮源优化的培养基基础上，分别添加K 2HPO4、MgSO4、FeSO4、CaCl2、KCl、NaCl（添加量为5 g/L），其他成分不变。接种量2%，装液量50 mL/250 mL，28℃、120 r/min培养7 d，测定菌丝干质量，考察不同无机盐对菌丝干质量的影响。
1.3.4 培养条件优化Plackett-Burman试验设计
在确定碳源、氮源以及无机盐种类的基础上，选取影响菌丝干质量的发酵时间、pH值、接种量、装液量、转速及温度共9个因素进行Plackett-Burman试验设计，设计2个空项以估计试验误差，每个因素选高低2个水平，以（-1，+1）编码各值[20]，利用Design Expert 10.0软件对其进行N=12的Plackett-Burman试验设计，以菌丝干质量（Y）作为响应值，每组试验设置3个平行[21]。Plackett-Burman试验设计的因子与水平如表1所示。
表1 Plackett-Burman试验设计因素与水平
Table 1 Factors and levels of Plackett-Burman experimental design
符号 因素 水平低水平（-1） 高水平（+1）A B C D E F G H I J K蔗糖/（g·L-1）酵母浸粉/（g·L-1）MgSO4/（g·L-1）温度/℃pH值培养时间/d装液量/（mL·250 mL-1）转速/（r·min-1）接种量/%空白项1空白项2 40 10 3 25 4 7 5 0 120 2-1-1 60 20 6 35 6 11 100 180 6 1 1
1.3.5 培养条件优化最陡爬坡试验
根据表1试验数据的分析结果，从众多因素中筛选出对菌丝干质量影响较大的3个显著因素，以此来确定各因素的水平，爬坡方向和步长，能快速、经济地逼近最佳值区域，来确定响应面分析的中心点[22-23]，进而对选出的3个显著因素进行Box-Behnken试验设计[24]。
1.3.6 培养条件优化Box-Behnken试验设计
采用Box-Behnken试验设计对酵母浸粉、硫酸镁以及发酵时间进行优化，以菌丝干质量（g/100 mL）为响应值，每个因素的3个水平以（-1，0，+1）编码，每个试验点进行3次平行试验[25]。Box-Behnken试验设计的因子与水平见表2。
表2 Box-Behnken试验设计因素与水平
Table 2 Factors and levels of Box-Behnken experimental design
因素酵母浸粉/（g·L-1）硫酸镁/（g·L-1）发酵时间/d-1水平0 1 20 2.0 9 25 2.5 10 30 3.0 11
2 结果与分析
2.1 菌株CICC 41584多相分类学鉴定
2.1.1 形态学鉴定
菌株CICC 41584在察氏琼脂培养基上25℃培养7 d，菌落形态鉴定及镜检测定结果如图1所示。由图1a可知，菌落直径30～31 mm，中央黄褐色，周围蛋黄色；中心凸起；质地丝绒状；反面浅橙黄色；无渗出液产生，无可溶性色素产生；由图1b和1c可知，菌丝黄色具饰，缠绕、较细；闭囊壳大量，黄褐色，存在于具饰菌丝网中，直径150～200μm，成熟后破裂释放出大量子囊；子囊近球形或椭圆形，长轴直径10～20μm，内含8个子囊孢子；由图1d可知，子囊孢子双凸镜形，中部具鸡冠状凸起，长轴直径为5.0～7.5μm；未见分生孢子结构。
图1 菌株CICC 41584的形态学观察结果
Fig.1 Morphological observation results of strain CICC 41584
2.1.2 生理生化特征分析
表3 菌株CICC 41584的碳源利用结果
Table 3 Carbon source utilization results of strain CICC 41584
注：“+”表示结果呈阳性；“+w”表示呈弱阳性；“-”表示结果呈阴性。
检测项目 结果 检测项目 结果D-葡萄糖甘油2-酮基-葡萄糖酸盐L-阿拉伯糖D-木糖侧金盏花醇木糖醇D-半乳糖肌醇山梨醇+ + - + + + +w + +w +α-甲基-D-葡萄糖N-乙酰葡萄糖胺纤维二糖D-乳糖（牛源）D-麦芽糖D-蔗糖海藻糖D-松三糖D-棉子糖- - - - +w + - - +
由表3可知，菌株CICC 41584能够很好地利用D-葡萄糖、甘油、L-阿拉伯糖、D-木糖、侧金盏花醇、D-半乳糖、山梨醇、D-蔗糖、D-棉子糖；菌株对木糖醇、肌醇、D-麦芽糖表示弱生长；不能利用2-酮基-葡萄糖酸盐、α-甲基-D-葡萄糖、N-乙酰葡萄糖胺、纤维二糖、D-乳糖、海藻糖、D-松叁糖。
2.1.3 分子生物学鉴定
将菌株CICC 41584测序结果在NCBI数据库中进行Nucleotide blast比对，并构建系统发育树。菌株的系统发育树如图2所示。
图2 基于β-tubulin基因菌株CICC 41584的系统发育树
Fig.2 Phylogenetic tree of strain CICC 41584 based onβ-tubulin gene
由图2可知，菌株CICC 41584与谢瓦散囊菌（Eurotium chevalieri）NRRL78 T处于同一系统发育支，序列的相似性为100%，结合形态学特征和生理生化试验结果，鉴定菌株CICC 41584为谢瓦散囊菌（Eurotium chevalieri），其无性型名称为谢瓦曲霉（Aspergillus chevalieri）。
2.2 单因素试验
2.2.1 碳源对菌丝干质量的影响
图3 不同碳源对菌丝干质量的影响
Fig.3 Effect of different carbon sources on dry mass of mycelium
不同碳源对菌丝干质量的影响结果见图3。由图3可知，菌株CICC 41584以蔗糖为碳源时，菌丝干质量最高，能达到0.21 g/100 mL。因此，选择蔗糖为后续试验的碳源。
2.2.2 氮源对菌丝干质量的影响
不同氮源对菌丝干质量的影响结果见图4。由图4可知，不同的氮源对菌丝产生量的影响较大，酵母浸粉作为氮源时菌丝干质量最高，能达到0.97 g/100 mL。因此，选择酵母浸粉为最佳氮源。
图4 不同氮源对菌丝干质量的影响
Fig.4 Effect of different nitrogen sources on dry mass of mycelium
2.2.3 无机盐对菌丝干质量的影响
不同无机盐对菌丝干质量影响结果见图5。由图5可知，不同无机盐对菌丝干质量影响较大，硫酸镁作为无机盐时菌丝干质量最高，能达到1.01 g/100 mL。因此，选择硫酸镁为最佳无机盐。
图5 不同无机盐对菌丝干质量的影响
Fig.5 Effect of different inorganic salts on dry mass of mycelium
2.3 Plackett-Burman试验结果
通过Design Expert10.0软件进行N=12的Plackett-Burman试验设计，每组试验设置3个平行，取平均值，结果见表4，方差分析结果见表5。
由表5可知，9个因素中的对响应值影响的显著顺序为酵母浸粉＞发酵时间＞硫酸镁＞装液量＞蔗糖＞转速＞接种量＞温度＞pH值，其中酵母浸粉的影响最为显著，硫酸镁、发酵时间有显著影响。另外，该试验模型的P=0.038 4＜0.05，表明该模型是显著的。决定系数R2=0.991 3，表明这个方程能解释变量响应值的99.13%。调整决定系数R2Adj=0.952 4，表明该方程的拟合度较好。此外，还可以看出其中酵母浸粉、发酵时间对菌丝量的影响呈正效应，硫酸镁对菌丝量的影响呈负效应。
经分析获得的一次回归方程为：Y=0.66+0.028A+0.14B-0.073C-5.833E-003D+6.667E-003E+0.076F-0.078G-0.017H+1.000E-002I
表4 Plackett-Burman试验设计及结果
Table 4 Design and results of Plackett-Burman experiments
试验号A B C D E F G H I蔗糖/（g·L-1）酵母浸粉/（g·L-1）硫酸镁/（g·L-1）温度/℃pH 培养时间/d 装液量/mL 转速/（r·min-1）接种量/%1 2 3 4 5 6 7 8 9 1 0 1-11-1-1 1-1-1-1 1 1 --1-1-1 1 1 -1 1 1 -1 1 -1 1 -1 1 1 --1-1-1 1 1 1 -1 1 1 -1 1 -1 1 1 1 -1 1 1 --1-1-1-1 1 1 -1 1 1 1 -1 1 1 -1 1 -1 1 1 1 -1 1 -1 1 1 -1 1 -1 1 1 1 -1 1 -1 11 12 1 1 1 -1 1 1 -1-1-1-1 1 1 1 -1 1 1 -1-1-1 1-1 1 1 1 -1-1-1-1 1 1 -1 J空白1-1-1-1 1 1 1 -1 1 1 -1-1 K空白-1 1-1-1-1 1 1 1 -1 1 1 -1菌丝干质量/（g·100 mL-1）1.26 0.94 0.69 0.89 0.78 0.80 0.63 1.21 0.84 0.77 0.61 0.72
表5 Plackett-Burman试验结果方差分析
Table 5 Variance analysis of Plackett-Burman experiments results
注：“*”表示差异显著（P＜0.05）；“**”表示差异极显著（P＜0.01）。下同。
因素 平方和 均方 自由度 F值 P值 显著性模型A蔗糖B酵母浸粉C硫酸镁D培养温度E pH值F培养时间G装液量H转速I接种量残差误差总变异0.47 9.633E-003 0.24 0.065 8.333E-004 5.333E-004 0.12 0.026 3.333E-003 1.200E-003 4.067E-003 0.47 0.052 9.633E-003 0.24 0.065 8.333E-004 5.333E-004 0.12 0.026 3.333E-003 1.200E-003 2.033E-003 9 1 1 1 1 1 1 1 1 1 2 1 1 25.43 4.74 115.67 31.74 0.41 0.26 61.00 12.85 1.64 0.59 0.038 4 0.161 5 0.008 5 0.030 1 0.587 6 0.659 5 0.016 0 0.069 8 0.328 8 0.522 7*****
2.4 最陡爬坡试验
根据Plackett-Burman试验结果选取酵母浸粉、硫酸镁、发酵时间3个显著因素进行最陡爬坡试验。试验设计及结果见表6。由表6可知，随着酵母浸粉、硫酸镁以及发酵时间的变化，菌丝干质量呈现先上升后下降的趋势。当酵母浸粉25 g/L、硫酸镁2.5 g/L、发酵时间10 d时，菌丝干质量最大，能达到1.88 g/100 mL，因此选为中心点，进行Box-Behnken响应面设计。
表6 最陡爬坡试验设计及结果
Table 6 Design and results of the steepest ascent experiments
序号 酵母浸粉/（g·L-1）硫酸镁/（g·L-1）发酵时间/d菌丝干质量/（g·100 mL-1）1 2 3 4 5 6 7 10 15 20 25 30 35 40 4 3.5 3 2.5 2 1.5 1 7 8 9 1 0 11 12 13 0.94 1.28 1.71 1.88 1.68 1.63 1.62
2.5 Box-Behnken试验结果
采用Box-Behnken试验设计，利用Design Expert 10.0软件进行3因素3水平的响应面试验结果分析。以酵母浸粉（A）、硫酸镁（B）、发酵时间（C）为自变量，菌丝干质量（R）为响应值，试验结果见表7，方差分析见表8。
应用Design Expert 10.0软件对表7中的数据进行回归分析，得到的二次回归方程为：
由表7和表8可知，回归模型的决定系数R2=0.954 5，F值=16.63，P值=0.000 7＜0.01，达到极显著水平，失拟项的F值=0.085 1＞0.05，说明失拟项不显著，方程的拟合程度较好。另外，一次项A的P＜0.01，说明酵母浸粉的影响极显著。交互项AC、BC的P＜0.05，说明酵母浸粉和发酵时间及硫酸镁和发酵时间之间的交互作用显著。根据二次回归方程得到的响应面图如图6所示。
表7 Box-Behnken试验设计与结果
Table 7 Design and results of Box-Behnken experiments
序号 A酵母浸粉/（g·L-1）B硫酸镁/（g·L-1）C发酵时间/d R菌丝干质量/（g·100 mL-1）1 2 3 4 5 6 7 8 9 1 0 10 11 10 11 10 9 10 9 10 10 11 12 13 14 15 16 17 30 30 25 20 25 30 20 25 25 25 25 20 25 25 25 30 20 2.0 2.5 2.5 2.5 2.5 2.5 3.0 3.0 2.5 2.5 2.0 2.5 2.5 2.0 3.0 3.0 2.0 9 9 1 0 11 11 10 10 1.87 1.86 1.95 1.80 1.94 1.91 1.85 1.83 1.92 1.93 1.89 1.76 1.94 1.80 1.88 1.90 1.82
表8 回归模型方差分析
Table 8 Variance analysis of regression model
因素 平方和 均方 自由度 F值 P值 显著性模型A B C A B****AC BC A 2 B2 C 2保留值失拟项净误差所有项0.049 0.012 8.000E-004 3.125E-004 6.939E-018 2.025E-003 4.900E-003 9.202E-003 3.602E-003 0.014 2.345E-003 1.825E-003 5.200E-004 0.052 0.054 0.012 8.000E-004 3.125E-004 6.939E-018 2.025E-003 4.900E-003 9.202E-003 3.602E-003 0.014 3.350E-004 6.083E-004 1.300E-004 0.052 9 1 1 1 1 1 1 1 1 1 7 3 4 6 16.33 35.86 2.39 0.93 2.071E-014 6.04 14.63 27.47 10.75 40.48 0.000 7 0.000 5 0.166 2 0.366 3 1.000 0 0.043 6 0.006 5 0.001 2 0.013 5 0.000 4********4.680.085 1
由图6可知，硫酸镁与发酵时间对菌丝干质量的交互作用极显著（P＜0.01），酵母浸粉与发酵时间对菌丝干质量的交互作用显著（P＜0.05），酵母浸粉与硫酸镁对菌丝干质量的交互作用不显著（P＞0.05）。
图6 酵母浸粉、硫酸镁、发酵时间交互作用对菌丝干质量影响的响应面及等高线
Fig.6 Response surface plots and contour line of effects of interaction between yeast powder,MgSO 4,fermentation time on dry mass of mycelium
根据上述模型，通过软件分析得到的最佳培养条件为酵母浸粉27.201 g/L、硫酸镁2.553 g/L、发酵时间10 d，预测得到的菌丝干质量为1.945 g/100 mL。为方便实际操作，修改培养条件为酵母浸粉27.2 g/L、硫酸镁2.6 g/L、发酵时间10 d，在最佳培养条件下进行3次平行试验，获得的菌丝干质量的平均值为1.950 g/100 mL，与理论预测值接近，说明该模型可行。
3 结论
本研究采用多相鉴定方法确定了分离自白酒大曲中菌株CICC 41584的分类学地位，并采用单因素试验及响应面法对其培养条件进行了优化。鉴定结果表明，该菌株为谢瓦散囊菌（Eurotium chevalieri）。采用单因素试验确定了最佳碳源、氮源、无机盐分别为蔗糖、酵母浸粉、硫酸镁；通过Plackett-Burman试验筛选出显著影响菌丝干质量的因素为酵母浸粉、硫酸镁和发酵时间，并通过Box-Behnken试验确定了最优培养条件为蔗糖添加量40 g/L、酵母浸粉添加量27.2 g/L、硫酸镁添加量为2.6 g/L、温度28℃、培养时间10 d、转速120 r/min、接种量2%、装液量50 mL/250 mL。在此优化培养条件下，菌丝干质量能达到1.950 g/100 mL，较优化之前提高了8.29倍，将为该菌株的进一步生物学功能研究、及其白酒大曲中的产业化应用奠定了基础。
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