Preparation and volatile flavor components of clear juice type rice wine
紫薯是甘薯中新型特有的品种，我国紫薯资源丰富，其富含花青素、多糖、黄酮类、绿原酸等功能性成分[1]。作为粮食及经济作物，紫薯及其加工制品在国内外市场的需求量逐年上涨，研究表明长期食用紫薯或其加工产品，可延缓衰老，抑制血糖血脂水平，改善肝功能等[2]。紫薯是集食用、药用及保健功效于一体的纯天然食品原材料，开拓前景广阔。以紫薯为原料酿造米酒，不仅利用了紫薯的特殊营养组成，还能同时赋予酒体鲜亮独特的色泽，可作为酿酒原料的最佳来源之一。玫瑰作为药食同源的植物，其中平阴重瓣玫瑰有着极高的经济价值，是中国传统玫瑰的代表，也是生产栽培面积最广的优良品种[3]。其花瓣可用作酿酒、制酱、乳制品、日化的良好原料[4]。玫瑰富含多糖、黄酮类、多酚、花青素等活性成分[5]，具有抗氧化、抗癌、调节免疫功能等药理作用[6]。以玫瑰为原料的食药及化工用品已形成系列化产业链，既能提高其资源利用率，也可满足消费者的多样化需求。
米酒作为中国传统且极具特色的低度发酵型酒精饮料[7-8]，是以水、粮食米为原料，依据传统发酵工艺制成发酵酒，再辅以果粒、粮谷、薯类、食用菌等和（或不添加）食品添加剂加工而成的酿造酒[9]。依据其酒糟的形态，可分为清汁型、均质型和糟米型，经过滤去除酒糟后的米酒称之为清汁型米酒。米酒富含多酚、有机酸、无机盐、维生素及微量元素、生物活性肽等多种功能性成分[10-13]，研究报道适量饮用米酒，可增强机体免疫力和抗氧化能力，延缓衰老，预防骨质疏松以及冠心病等[14-15]。近年来，随着我国酿酒行业政策的转变和酿造技术的不断发展，米酒、果酒等低酒精度复合型发酵酒的开发是当下研究的热点。吴海霞等[16]以紫薯和糯米为主要原料，经糖化、发酵工艺制备的酒酿酒体柔和、颜色鲜亮，具有紫薯的特有香味。彭春芳等[17]以糯米、玫瑰花及红豆为原料酿制的复合米酒呈玫红色，酒质清澈，清甜爽口。张阳阳等[18]以桑葚和糯米为主要原料制备的米酒呈紫红色，口感醇香。
目前米酒的研究主要集中在对米酒工艺[19]、酒曲[20-21]的考察，或对一些特定原料/地方性米酒[22-23]的对比分析，而对于紫薯及玫瑰复合型清汁型米酒的研究尚鲜见报道。本研究在传统发酵工艺的基础上，以药食同源理论为指导，选用糯米、紫薯和玫瑰为主要原料，研制清汁型米酒。通过单因素和正交试验对其发酵工艺进行优化，采用顶空固相微萃取-气质联用（head space-solid phase microextractiongas chromatography-mass spectrometry，HS-SPME-GC-MS）技术检测清汁型米酒的挥发性风味物质；参考相关食品安全国家标准检测清汁型米酒的理化及微生物指标。本研究旨在开发出风味独特、品质优异的米酒，从而为丰富米酒种类和保健功效，提升紫薯和玫瑰的附加值提供理论基础和技术参考。
圆糯米：沈阳粮油集团有限公司；紫薯：市售；山东济南平阴重瓣玫瑰（干品）：江西花普堂健康产业发展有限公司；纯净水：农夫山泉股份有限公司；甜酒曲：安琪酵母股份有限公司。
磷酸氢二钾（K2HPO4）、磷酸二氢钾（KH2PO4）、苯酚（C6H5OH）、浓硫酸（H2SO4）、无水乙醇（CH3CH2OH）、乙醚（C4H10O）、甲醇标准品（CH3OH）：成都市科隆化学品有限公司；氢氧化钠（NaOH）：成都市科龙化工试剂厂；葡萄糖（C6H12O6）标准品（纯度＞98%）：上海阿拉丁试剂有限公司。本试验所用化学试剂均为分析纯。
BSA224S-CW分析天平：赛多利斯科学仪器有限公司；SHZF-428恒温振荡器：成都瑞昌仪器制造有限公司；UPH-I-20T超纯水仪：四川优普超纯科技有限公司；7890B-5977B气相色谱-质谱联用（GC-MS）仪：美国安捷伦科技公司；PHS-3C酸度计：成都世纪方舟科技有限公司；SB-5200DTDN超声清洗机：宁波新芝生物科技股份有限公司；L2S可见分光光度计：上海精密仪器仪表有限公司；JX22365全玻璃蒸馏器：扬州南美鹰教学仪器有限公司。
1.3.1 清汁型米酒制备工艺流程及操作要点
操作要点：
原料预处理：选用无异味、无霉变（粗细均匀）的精品糯米，用水洗净后浸泡一夜（9～10 h），至轻碾即碎的程度；选用新鲜、优质的紫薯，洗净后去皮，切成大小均一的小块；选用优质的平阴重瓣玫瑰，去叶、去芯后洗净备用。
蒸煮、冷却：沥干后的糯米用纱布包好，紫薯块铺在上层，用筷子稍微拨几个小孔，蒸煮40 min后，在其表层撒上玫瑰花瓣，一起蒸熟至1 h；蒸熟后倒入干净并灭菌的容器中，拨散摊凉，冷却至30 ℃左右。
酒曲活化：按一定比例称量甜酒曲（精确至0.000 1 g），加入适量煮沸后冷却的温开水，均匀地化开甜酒曲。
拌曲、罐装：将物料与甜酒曲混合搅拌均匀；混匀后全部置于玻璃密封罐中，轻轻压平物料表面，并在中间挖一个洞，撒上些许甜酒曲，覆盖1～2层保鲜膜后再加盖密封。
糖化发酵、产醇发酵：罐装后置于恒温振荡器中发酵，期间观察酒坑里面是否充满酒以说明发酵程度；30 ℃下发酵48 h后，取出玻璃密封罐，加入100 mL纯净水后再次密封严实，转置于4 ℃冰箱中冷藏24 h。
过滤：用300目滤网过滤已发酵充分的物料，置于4 ℃冰箱中冷藏静置24 h后取上层澄清液装罐。
灭菌：采用75 ℃水浴中灭菌20 min[24]，冷却后即得清汁型米酒成品。
1.3.2 清汁型米酒制备工艺优化
（1）单因素试验
通过预试验选定100.0 g糯米、100 mL纯净水为基准进行后续试验研究。设置不同的紫薯添加量（50.0 g、55.0 g、60.0 g、65.0 g、70.0 g）、平阴重瓣玫瑰添加量（0.3 g、0.6 g、0.9 g、1.2 g、1.5 g）、甜酒曲添加量（0.4 g、0.6 g、0.8 g、1.0 g、1.2 g）、发酵温度（26 ℃、28 ℃、30 ℃、32 ℃、34 ℃）、发酵时间（36 h、42 h、48 h、54 h、60 h）为单因素试验变量进行考察，研究各因素对清汁型米酒感官评分及酒精度的影响。
（2）正交试验
在单因素试验的基础上，以酒精度为评价指标，选定甜酒曲添加量（A）、发酵温度（B）以及发酵时间（C）为影响因素，采用3因素3水平L（934）正交试验设计，优化清汁型米酒制备工艺参数，正交试验因素与水平见表1。
表1 清汁型米酒制备工艺优化正交试验因素与水平
Table 1 Factors and levels of orthogonal experiments for preparation process optimization of clear juice type rice wine
水平 A 甜酒曲添加量/g B 发酵温度/℃ C 发酵时间/h 123 0.6 0.8 1.0 26 28 30 48 54 60
1.3.3 挥发性风味成分分析
采用顶空固相微萃取（HS-SPME）和气相色谱-质谱（GC-MS）联用法[25]测定清汁型米酒样品中挥发性风味成分。
萃取条件：称取2 g样品置于20 mL顶空瓶中，密封，在80 ℃水浴条件下用50/30 μm DVB/CAR/PDMS 萃取头顶空静态吸附2 h，解吸后进行GC-MS分析。
GC条件：DB-5MS石英色谱柱（30m×250mm×0.25μm）；进样温度260 ℃，载气为高纯氦气（He），流速1.0 mL/min，不分流。升温程序为初始45 ℃，保持3 min，以5 ℃/min升温到260 ℃，保持3 min，运行53 min。
MS条件：离子源温度250 ℃，电子电离（electronic ionization，EI）源，电子能量70 eV，传输温度280 ℃，激活电压1.5 V，质量扫描范围30～600 amu。扫描方式：Scan扫描。
定性定量方法：利用美国国家标准技术研究所（national institute of standards and technology，NIST）17.L谱库检索比对，结合相关文献对清汁型米酒的挥发性风味成分进行定性，按峰面积归一化法计算各挥发性风味组分的百分含量[26]。
1.3.4 理化指标及微生物指标测定
总酸（以乳酸计）含量测定：参考GB 12456—2021《食品安全国家标准食品中总酸的测定》中的电位滴定法[27]；还原糖（以葡萄糖计）含量测定：参考GB 5009.7—2016《食品安全国家标准食品中还原糖的测定》中的直接滴定法[28]；蛋白质含量：参考GB 5009.5—2016《食品安全国家标准食品中蛋白质的测定》中的凯氏定氮法[29]；酒精度测定：参考GB 5009.225—2023《食品安全国家标准酒和食用酒精中乙醇浓度的测定》中的密度瓶法[30]。
菌落总数测定：参考GB 4789.2—2022《食品安全国家标准食品微生物学检验菌落总数测定》中的平板计数法[31]；大肠菌群测定：参考GB 4789.3—2016《食品安全国家标准食品微生物学检验大肠菌群计数》中的最大可能数（most probable number，MPN）法[32]。
1.3.5 感官评价
将样品置于通风良好，无异味的环境下，由10名专业评判员构成感官评定小组，分别对产品的色泽、组织形态、香味、滋味四项指标进行感官评定。采用100分制评分法，对各指标进行评分，并取其平均值作为单个项目的评分结果，四项总分作为产品的综合分数。参考NY/T 1885—2017《绿色食品米酒》[33]，建立清汁型米酒的感官评分标准见表2。
表2 清汁型米酒感官评价标准
Table 2 Sensory evaluation standards of clear juice type rice wine
感官指标 等级优良中差色泽（30分）组织形态（20分）香味（20分）滋味（30分）呈均匀一致的紫红色，有光泽（26～30分）清澈透明，无沉淀（18～20分）自然的甜香，酒香纯正，有玫瑰花香，无异味（18～20分）酸甜适口，醇香可口，回甜，无不良滋味（26～30分）呈较均匀的紫红色，微有光泽（21～25分）清澈透明，微有沉淀（13～17分）自然的甜香，酒香纯正，有玫瑰花香，有轻微异味（13～17分）酸甜比例适当，醇香可口，无不良滋味（21～25分）呈紫色，色泽不均匀，微有光泽（16～20分）清澈透明，稍有沉淀（9～12分）无甜香，酒香较为纯正，有异味（9～12分）偏酸或偏甜，口感偏淡或平淡，稍有不良滋味（16～20分）呈较深或深紫色，色泽不均匀，无光泽（0～15分）清澈透明，有大量沉淀或杂质（0～8分）无甜香，酒香不纯正，有浓重的异味（0～8分）无甜味，有黏腻感，带有不良滋味（0～15分）
1.3.6 数据统计分析
采用Excel 2019、GraphPad Prism 7.0和SPSS 22.0软件进行数据作图与分析，多组数据比较采用方差分析，P＜0.05表示有显著性差异。
2.1.1 紫薯添加量对清汁型米酒品质的影响
紫薯具有特殊的营养成分，能赋予酒体鲜亮且独特的色泽[34]。如图1所示，随着紫薯添加量在50.0～60.0 g范围内的增加，清汁型米酒的感官评分和酒精度随之逐渐增加；当紫薯添加量为60.0 g时，感官评分和酒精度达到最高，分别为75.30分、7.18%vol，此时酒酿呈均匀一致的紫红色，甜度适中，酒香协调均衡，口感醇和；当紫薯添加量＞60.0 g之后，感官评分和酒精度逐渐下降。紫薯添加量过少，酒酿色泽平淡，口感远不及理想效果；添加量过多则会掩盖米酒原本的风味，口感欠缺，风味失调。综合考虑，选取最适紫薯添加量为60.0 g。
图1 紫薯添加量对清汁型米酒品质的影响
Fig.1 Effect of purple potato addition on the quality of clear juice type rice wine
2.1.2 玫瑰添加量对清汁型米酒品质的影响
平阴重瓣玫瑰作为主要原料，为米酒提供了特殊的香味成分和风味物质。如图2所示，随着玫瑰添加量在0.3～1.2 g范围内的增加，清汁型米酒的感官评分和酒精度随之增加；当玫瑰添加量为1.2 g时，感官评分和酒精度达到最高，分别为74.60分、7.21%vol，此时酒酿呈均匀一致的紫红色，带有自然的玫瑰花香，酸甜适口；当玫瑰添加量＞1.2 g之后，感官评分和酒精度有所下降。玫瑰添加量过少时难以体现出玫瑰自然的香气，酒体色泽清淡，口感不佳；添加量过多则会造成酒味与花香味不协调，酸甜比例失调。
图2 玫瑰添加量对清汁型米酒品质的影响
Fig.2 Effect of rose addition on the quality of clear juice type rice wine
综合考虑，选取最适平阴重瓣玫瑰添加量为1.2 g。
2.1.3 甜酒曲添加量对清汁型米酒品质的影响
在米酒的发酵过程中，微生物扮演着重要的角色，甜酒曲添加量对米酒的品质产生显著的影响。如图3所示，随着甜酒曲添加量在0.4～0.8 g范围内的增加，清汁型米酒的感官评分和酒精度随之增加；当甜酒曲添加量为0.8 g时，感官评分和酒精度达到最高，分别为77.20分、7.23%vol，此时酒酿的香气浓郁，甜度适中，口感醇和；当甜酒曲添加量＞0.8 g之后，感官评分和酒精度有所下降。甜酒曲添加量过少时，酒曲中的根霉或酵母菌生长及糖化作用过低，导致米酒的整体协调度较差，口感欠佳；添加量过多则会导致营养物质供给量不足，一定程度地抑制酵母菌的无氧呼吸，导致乙醇和其他化合物的合成减少，从而使米酒的口感略微苦涩。综合考虑，选取最适甜酒曲添加量为0.8 g。
图3 甜酒曲添加量对清汁型米酒品质的影响
Fig.3 Effect of sweet Jiuqu addition on the quality of clear juice type rice wine
2.1.4 发酵温度对清汁型米酒品质的影响
如图4所示，随着发酵温度在26～28 ℃范围内的升高，清汁型米酒的感官评分和酒精度随之增加；当发酵温度为28 ℃时，感官评分达到最高，为76.63分；当发酵温度为30 ℃时酒精度达到最高，为7.24%vol，酒体呈紫红色，色泽清亮，杂质含量较少，具有独特的风味；当发酵温度＞28 ℃之后，感官评分有所下降；当发酵温度＞30 ℃之后，酒精度有所下降。发酵温度过低不利于酒曲中酵母菌或根霉的生长繁殖，同时糖化酶的活力较低，不完全发酵，导致酒酿的风味欠佳，口感远不及理想效果；发酵温度过高则会导致根霉的生长过于旺盛，抑制酵母菌的生长，同时影响糖酵解代谢，使得米酒糖化发酵或产有机酸不完全，从而影响酒酿的酸甜比例。综合考虑，选取最适发酵温度为28 ℃。
图4 发酵温度对清汁型米酒品质的影响
Fig.4 Effect of fermentation temperature on the quality of clear juice type rice wine
2.1.5 发酵时间对清汁型米酒品质的影响
发酵时间对米酒的口感影响显著，伴随发酵时间的延长，米酒中风味物质的含量也会随之变化[35]。如图5所示，随着发酵时间在36～54 h范围内的增加，清汁型米酒的感官评分和酒精度随之增加；当发酵时间为54 h时，感官评分和酒精度均达到最高，分别为79.55分、5.83%vol，酒酿有光泽呈紫红色，酒体清澈，风味协调且无异味；发酵时间＞54 h之后，感官评分和酒精度有所下降。发酵时间太短，糖化不完全而使酒酿整体的风味欠佳，酒味清淡，口感较差；发酵时间过长则会导致酵母菌发酵过度，酒精蒸发且部分酒精转化为酸，从而使酒酿色泽浑浊，产生“过熟味”，酸甜比例失调。综合考虑，选取最适发酵时间为54 h。
图5 发酵时间对清汁型米酒品质的影响
Fig.5 Effect of fermentation time on the quality of clear juice type rice wine
基于单因素试验结果，以甜酒曲添加量（A）、发酵温度（B）和发酵时间（C）作为影响因素，以酒精度作为考察指标，采用正交试验对清汁型米酒制备工艺进行优化，结果与分析见表3，正交试验结果方差分析见表4。
表3 清汁型米酒制备工艺优化正交试验结果与分析
Table 3 Results and analysis of orthogonal experiments for preparation process optimization of clear juice type rice wine
试验号 A B C 酒精度/%vol 1 2 3 4 5 6 7 8 9 k1 1 1 1 2 2 2 3 3 3 1 2 3 1 2 3 1 2 3 1 2 3 2 3 1 3 1 2 6.07 4.37 6.90 5.74 5.49 7.04 4.97 5.84 5.30 k2 k3R 5.78 6.09 5.37 0.72 5.59 5.23 6.41 1.18 6.32 5.14 5.78 1.18
表4 正交试验结果方差分析
Table 4 Variance analysis of orthogonal experiments results
注：“**”表示对结果影响极显著（P＜0.01）；“*”表示对结果影响显著（P＜0.05）。
因素 平方和 自由度 均方 F0.05值 P 值 显著性ABC误差1.557 4.389 4.179 1.097 2 2 2 2 0.779 2.194 2.089 0.122 6.385 17.998 17.136 0.019 0.001 0.001*****
根据极差R值的大小，分析判断各因素对试验结果的影响程度。由表3可知，影响米酒品质的因素主次关系为发酵温度（B）＞发酵时间（C）＞甜酒曲添加量（A），最佳制备工艺组合为A2B3C1，即100.0 g糯米、100 mL纯净水为基础条件下，甜酒曲添加量为0.8 g，发酵温度为30 ℃，发酵时间为48 h。在此优化条件下，进行3次平行验证试验，清汁型米酒感官评分为83分，酒体清亮，呈紫红色且有光泽，米香、醇香以及玫瑰花香交融，口感细腻柔和，酸甜适口。
由表4可知，发酵温度及发酵时间对结果有极显著影响（P＜0.01），甜酒曲添加量对清汁型米酒品质有显著影响（P＜0.05）。
经过HS-SPME-GC-MS分析，清汁型米酒的挥发性风味成分及含量结果见表5。由表5可知，清汁型米酒共检测出挥发性风味物质23种，其中醇类5种、酯类8种、烯烃类1种、羧酸类2种、酮类2种、其他类5种。相对含量排名前三的物质及其含量分别为乙醇34.48%、苯乙醇3.74%、乙酸丁酯2.29%。
表5 清汁型米酒挥发性风味成分GC-MS分析结果
Table 5 Results of volatile flavor components in clear juice type rice wine analyzed by GC-MS
类别保留时间/min 化合物 分子式 相对含量/%2.086 9.726 14.234 15.806 27.896总计5.256 6.944 10.761 16.861 19.273 22.223 22.340 27.275总计24.946总计14.545 30.445总计7.481 30.445总计乙醇三甲基硅基甲醇芳樟醇苯乙醇柏木脑/雪松醇C2H6O醇类C4H12OSi C10H18O C8H10O C15H26O酯类 烯烃类 羧酸类 酮类乙酸丁酯乙酸异戊酯己酸乙酯辛酸乙酯甲酸-2-苯乙酯乙基9-癸烯酸酯癸酸乙酯月桂酸乙酯C6H12O2 C7H14O2 C8H16O2 C10H20O2 C9H10O2 C12H22O2 C12H24O2 C14H28O2异胡萝卜烯C15H24 3-羟基丙酸肉豆蔻油酸C3H6O3 C14H26O2 4-乙氧基-2-丁酮1-氧杂环十五烷-2-酮C6H12O2 C14H26O2 34.48 0.07 0.33 3.74 0.03 38.65 2.29 1.00 0.59 2.11 0.02 0.02 0.46 0.06 6.55 0.03 0.03 0.01 0.08 0.09 0.01 0.08 0.09
续表
类别保留时间/min 化合物 分子式 相对含量/%其他9.726 14.545 19.442 23.743 27.599总计1-（1-乙氧基乙氧基）戊烷甜菊苷十二甲基环六硅氧烷十四甲基环七硅氧烷十六甲基环辛硅氧烷C9H20O2 C38H60O18 C12H36O6Si6 C14H42O7Si7 C16H48O8Si8 0.07 0.01 0.05 0.05 0.03 0.21
清汁型米酒理化及微生物指标的测定结果见表6。由表6可知，清汁型米酒的总酸含量为0.25 g/100 g，还原糖含量为2.51 g/100 g，蛋白质含量为3.26 g/100 g，酒精度为7.18%vol；菌落总数为9 CFU/mL，大肠菌群未检出。其理化和微生物指标均符合NY/T 1885—2017《绿色食品米酒》[33]的标准要求。
表6 清汁型米酒的理化及微生物指标测定结果
Table 6 Determination results of physicochemical and microbial indexes of clear juice type rice wine
理化指标 测定结果 标准要求总酸（以乳酸计）/（g·100 g-1）还原糖（以葡萄糖计）/（g·100 g-1）蛋白质/（g·100 g-1）酒精度/%vol菌落总数/（CFU·mL-1）大肠菌群/（MPN·100 mL-1）0.25 2.51 3.26 7.18 9未检出0.05～1.00≥0.8≥0.06＞0.5≤50＜3.0
采用糯米、紫薯和平阴重瓣玫瑰为主要原料，制备一种复合清汁型米酒。以感官评分和酒精度为评价指标，通过单因素和正交试验对清汁型米酒的发酵工艺进行优化。结果表明，最佳工艺条件为在以100.0 g糯米、100 mL纯净水为基准的条件下，紫薯、玫瑰和甜酒曲分别添加60.0 g、1.2 g、0.8 g，发酵温度为30 ℃，发酵时间为48 h。在此优化条件下，清汁型米酒的总酸含量为0.25 g/100 g，还原糖含量为2.51 g/100 g，蛋白质含量为3.26 g/100 g，酒精度为7.18%vol，菌落总数为9 CFU/mL，大肠菌群未检出。清汁型米酒的感官评分83分，酒酿呈紫红色，具有清澈的酒体，集米香、醇香与玫瑰花香于一体，口感细腻柔和、酸甜适口。在清汁型米酒中共检测出23种挥发性风味成分，包括醇类5种、酯类8种、烯烃类1种、羧酸类2种、酮类2种、其他类5种。清汁型米酒符合当下消费者对酒类饮品营养、风味和保健的要求，市场开发前景广阔。
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