Fermentation conditions optimization and quality analysis of mulberry anthocyanins yogurt
桑葚（Fructus mori）又称桑椹、桑葚子、桑枣、桑果、桑泡儿、桑子、乌葚、桑实等，是桑科桑属多年生木本植物桑树的果实[1]。桑葚中含有丰富的花色苷，桑葚花色苷是一类具有苯并吡喃结构的类黄酮化合物，其中，矢车菊素-3-葡萄糖苷、矢车菊素-3-芸香糖苷两种含量最高[2]。花色苷广泛存在于浆果、葡萄、薯类等水果和蔬菜中，作为一种广泛分布于植物界的水溶性多酚类色素，具有较强的抗氧化能力、抗炎、预防癌症、抑制肿瘤以及保护心血管、减肥等作用，在保护人体健康上有很大的优势[4]，也是其促进人体健康的主要成分[5]。
目前，学者们对桑葚研究的领域更多的是桑葚花色苷如何提取、提取工艺的优化以及它的功效研究[6]。桑葚花色苷在食品上的应用主要是作为天然色素，其颜色鲜美，常用于酒、饮料、果汁等饮品来改善风味、美化外观、增强其饮用的食欲[7]。
酸奶是一款老少皆宜的健康饮品。酸奶中含有丰富的乳酸杆菌、双歧杆菌、保加利亚乳杆菌等益生菌，适合乳糖不耐受的人群，易于人体肠道的吸收，能更好地促进润肠通便，其营养、保健功能丰富，是受人们喜爱的一款乳制品[8]。常见的酸奶于2～4 ℃条件下保存，偏酸性，酸甜可口。根据热对花色苷降解影响的定量研究，花色苷水溶液在低温下分解缓慢，高温下分解得快，特别是pH升高的条件下分解得则更快[10]，因此低温以及高的酸性条件下贮藏对花色苷的保存更有利[4]。功能型酸奶比一般酸奶有更丰富的品种和保健功效，按添加成分不同主要分为五大类，包括谷物型、果蔬型、中药型、益生菌型和营养强化型[11]。酸奶中添加花色苷具有较强的抗氧化能力，属于营养强化型酸奶。紫番薯花色苷酸奶中添加紫番薯花色苷对超氧阴离子和羟自由基均有较好的清除效果，且与浓度正相关[12]。郭红辉等[13]研制了黑米花色苷酸奶，添加黑米花色苷产品为粉紫色，并提高了附加值。此外，日本开发了具有预防婴儿流行性感冒和调节尿酸的酸奶[14]。
本研究利用桑葚花色苷在低温、低pH下保存较好的条件将其应用在酸奶中，以感官评价为主要指标，通过单因素、正交试验对桑葚花色苷酸奶发酵条件进行优化，并对其理化指标及抗氧化活性进行检测，以期制作一款有抗氧化功效且具桑葚花色苷独特风味的酸奶。
桑葚花色苷提取物：西安立森生物科技有限公司；纯牛奶、白砂糖：市售；乳酸菌酸奶发酵粉：北京川秀科技有限公司。
无水乙醇：成都市科隆化学品有限公司；1,1二苯基-2-三硝基苯肼（1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl，DPPH）：梯希爱（上海）化成工业发展有限公司；氢氧化钠、邻苯对二甲酸氢钾（均为分析纯）：国药集团化学试剂有限公司；酚酞（分析纯）：成都市科龙化工试剂厂；考马斯亮蓝G-250染色液、牛血清蛋白（均为生化试剂）：福州文莱生物科技有限公司；MRS固体培养基：广州环凯微生物科技有限公司。
EL204分析天平：梅特勒-托利多仪器（上海）有限公司；HH-4数显恒温水浴锅：国华电器有限公司；TDZ5-WS大容量离心机：湖南湘仪试验仪器开发有限公司；PHS-3E型pH计：上海雷磁仪器有限公司；759S紫外可见光分光光度计：上海仪电分析仪器有限公司；SPX150生化培养箱：上海精宏试验设备有限公司；YXQ-LS-50S11立式压力蒸汽灭菌锅：上海博讯实业有限公司医疗设备厂；VS-1300L-U洁净工作台：苏州安泰空气技术有限公司；LRH-250A生化培养箱：韶关市泰宏医疗器械有限公司；DHG-9146A电热鼓风干燥机：上海精宏试验设备有限公司；CT3-10K质构仪：广州市博勒飞粘度计质构仪技术服务有限公司；3nh色差仪：深圳市三恩驰科技有限公司；SHZ-D（III）型循环水真空泵：邦西仪器科技（上海）有限公司。
1.3.1 桑葚花色苷酸奶制备工艺流程及操作要点
操作要点：
用量杯准确量取50 mL纯牛奶，将其置于外温100 ℃的水浴锅上加热10 min灭菌，加热时不定时搅拌，保持纯牛奶受热均匀。灭菌结束后，将定量的桑葚花色苷提取物加入已灭菌的纯牛奶中，于100 ℃条件下加热，结束后冷却至35 ℃，放入定量菌种搅匀，在恒温培养箱中发酵一定时间，结束立即置于4 ℃的冰箱后熟12 h，得成品。
1.3.2 桑葚花色苷酸奶发酵条件优化单因素试验
将前期预试验的结果分析后，以桑葚花色苷加热时间1 min、桑葚花色苷添加量4%、白砂糖添加量10%、菌种添加量0.1%、发酵温度42 ℃、发酵时间8 h为基础，以感官评分及酸度为考察指标，分别考察桑葚花色苷加热时间（1 min、2 min、3 min、4 min、5 min）；桑葚花色苷添加量（2%、3%、4%、5%、6%）；白砂糖添加量（6%、8%、10%、12%、14%）；菌种添加量（0.05%、0.10%、0.15%、0.20%、0.25%）；发酵时间（7.0 h、7.5h、8.0 h、8.5 h、9.0 h）；发酵温度（38 ℃、40 ℃、42 ℃、44 ℃、46 ℃）对桑葚花色苷酸奶品质的影响。
1.3.3 桑葚花色苷酸奶发酵条件优化正交试验
在单因素试验结果的基础上，设计L9（34）正交试验，以感官评分为指标，优化桑葚花色苷酸奶的发酵条件，正交试验因素与水平见表1。
表1 桑葚花色苷酸奶发酵条件优化正交试验因素与水平
Table 1 Factors and levels of orthogonal experiments for fermentation conditions optimization of mulberry anthocyanins yogurt
水平 A 桑葚花色苷加热时间/min B 桑葚花色苷添加量/%C 白砂糖添加量/%D 菌种添加量/%1 2 3 1 2 3 3 4 5 8 10 12 0.05 0.10 0.15
1.3.4 测定方法
桑葚花色苷酸奶感官评价评定：选取经过培训的专业人员从色泽、香气、口感、组织状态4个方面对其进行感官评价，满分为100分，取每组平均值为最终值。感官评价标准见表2。
表2 桑葚花色苷酸奶感官评价标准
Table 2 Sensory evaluation standards of mulberry anthocyanins yogurt
评分项目 评分标准 评分/分色泽（20分）16～20 10～15＜10 16～20香气（20分）颜色均匀，是令人愉悦的紫红色颜色较均匀，但色泽偏深紫或浅红颜色不均匀，色泽差，令人无食欲具有浓郁桑葚花色苷和乳品的气味，带浓郁的发酵风味，无酒精味、异味具有桑葚花色苷和乳品的气味，有发酵风味，轻微酒精味、异味无桑葚花色苷和乳品的气味，无发酵风味，较重酒精味、异味10～15＜10
续表
评分项目 评分标准 评分/分口感（30分）组织状态（30分）酸甜可口，口感、质地细腻，食用有愉悦感过酸或过甜，口感较细腻，食用愉悦感较不佳酸甜度不够，砂质感明显，令人无食欲均匀，无杂质、气泡、乳清析出较均匀，有少量杂质、气泡、乳清析出不均匀，有较多杂质，有大量气泡，乳清析出多21～30 10～20＜10 21～30 10～20＜10
酸度：参照GB 5009.239—2016《食品安全国家标准食品的酸度测定》中第一法酚酞指示剂法测定。
pH值：参照杨扬[15]的方法，并进行改良，酸度计预热30 min，校准后，称取10 g酸奶样品在pH计下测量酸奶pH值，平行测定3次，取平均值。
DPPH自由基清除率测定：参考文献[16-17]方法测定。
色差：参照冯子健等[18]的方法，采用色差仪直接测定。以L*、a*、b*值来反映桑葚花色苷酸奶的颜色的变化，每组样品平行测定3 次，其中L*表示亮度值，a*表示红绿值，b*表示黄蓝值。以白色作为标样，测量并计算桑葚花色苷酸奶及空白对照组酸奶的ΔL、Δa、Δb和ΔE。ΔE 的计算公式如下：
式中：ΔE、ΔL、Δa、Δb 表示与标样相比相关数值的变化。
持水力：参照康林芝等[19]的方法。取50 mL离心管称质量记为m，向50 mL离心管中加入10 g酸奶样品并称量酸奶和离心管的总质量记为m1，随后在室温下，离心条件为3 000 r/min离心10 min，静置10 min后，弃去上清液，称量弃去上清液后离心管与剩余沉淀物的总质量记为m2。酸奶样品的持水力计算公式如下：
式中：m为空离心管的质量，g；m1为装有酸乳样品离心管的质量，g；m2为弃去上清液后离心管与剩余沉淀物的总质量，g。
乳清析出量：参照康林芝等[19]的方法，将桑葚花色苷酸奶成品和空白对照组酸奶在4 ℃条件下放置1 d，测量酸奶总高度记做H，再测量酸奶乳清析出层高度记为h，平行测定3次，代入乳清析出量的计算公式，取平均值，即得酸奶乳清析出量。乳清析出量计算公式如下：
式中：h为酸奶乳清析出层的高度，cm；H为酸奶总的高度，cm。
糖度：参照赖盈盈等[20]的方法，室温条件下准确称量10 g酸奶，离心机中5 000 r/min离心10 min，取2滴上清液，用糖度计测量桑葚花色苷酸奶的糖度，同时测量空白对照组酸奶，平行测定3次。
酸奶质构分析：参考胡锦涛等[17，21-22]的方法，用CT3-10K质构仪，选用TA4/1 000探头，设置条件为触发点负载5 g，测试、返回的速度为2 mm/s，刺入的深度为20 mm，循环2次。同等条件下，每组样品平行测定3次以上。
蛋白质：采用考马斯亮蓝G-250法测定酸奶中的蛋白质[23-24]。
活菌数：参照GB 4789.35—2023《食品安全国家标准食品微生物学检验乳酸菌检验》中的方法测定。
1.3.5 数据处理
采用Excel 2019分析单因素试验的数据，用正交设计助手设计、分析正交试验数据，用Origin 2021软件作图。
2.1.1 桑葚花色苷加热时间对桑葚花色苷酸奶品质的影响
由图1可知，桑葚花色苷加热时间为1～5 min时，桑葚花色苷酸奶的感官评分呈先上升后下降的趋势，其中加热2 min时酸奶的感官评分最高。桑葚花色苷为水溶性色素，因此不完全与牛奶分子紧密结合，使酸奶有少许沉淀，沉淀的多少是影响感官评分的主要因素。桑葚花色苷加热时间为1～5 min时，桑葚花色苷酸奶酸度呈先上升后趋于平缓的趋势，其中加热3 min后无明显差别。因此综合考虑，选择桑葚花色苷加热时间为2 min进行后续试验。
图1 桑葚花色苷加热时间对桑葚花色苷酸奶品质的影响
Fig.1 Effect of heating time of mulberry anthocyanins on quality of mulberry anthocyanins yogurt
2.1.2 桑葚花色苷提取物添加量对桑葚花色苷酸奶品质的影响
由图2可知，当桑葚花色苷提取物的添加量为2%～6%时，桑葚花色苷酸奶的感官评分呈先上升后下降的趋势。当桑葚花色苷提取物添加量为2%时，由于添加量较少，嗜热链球菌和保加利亚乳杆菌能利用好其营养物质，所以酸奶中乳酸菌的发酵得较好，酸奶酸度较高，pH值偏低，酸奶口味偏酸，感官评分偏低；当桑葚花色苷添加量为6%时，由于添加物过多，抑制乳酸菌的生长，因此发酵得较差，酸度较低，甜酸比较差，导致酸奶口感偏差。当桑葚花色苷提取物添加量为4%时，由于桑葚花色苷添加量适当，酸奶的酸度和甜度恰好发挥相当，因此使桑葚花色苷酸奶感官评分最高。孙百虎[25]研究发现，桑葚汁是乳酸菌优良的生长基质，但在相同的桑葚汁中发酵，其接种菌株中嗜热链球菌、保加利亚乳杆菌的活菌数最低，植物乳杆菌的活菌数量最高因其能够更好地利用桑葚汁中的营养物质，这与本试验的研究结果相一致。因此综合考虑，选择桑葚花色苷提取物添加量为4%进行后续试验。
图2 桑葚花色苷提取物添加量对桑葚花色苷酸奶品质的影响
Fig.2 Effect of mulberry anthocyanins addition on quality of mulberry anthocyanins yogurt
2.1.3 白砂糖添加量对桑葚花色苷酸奶品质的影响
由图3可知，白砂糖添加量为6%～14%时，桑葚花色苷酸奶的感官评分呈先上升后下降的趋势，酸度呈逐渐降低的趋势。在白糖添加量为6%时，白糖添加量较少，导致桑葚花色苷酸奶甜味较淡，而乳酸菌不能得到充分的发酵能量，使感官评分较低；白糖添加量为14%时，白糖添加量较多，使得桑葚花色苷酸奶偏甜，酸甜比重失调，导致酸奶的感官品质偏低；白糖添加量为10%时，乳酸菌恰好能利用适宜的碳源量来进行充分发酵，使得桑葚花色苷酸奶酸甜比例恰当，感官评分最高。因此综合考虑，选择白砂糖添加量为10%进行后续试验。
图3 白砂糖添加量对桑葚花色苷酸奶品质的影响
Fig.3 Effect of sugar addition on quality of mulberry anthocyanins yogurt
2.1.4 菌种添加量对桑葚花色苷酸奶品质的影响
由图4可知，菌种添加量为0.05%～0.25%时，桑葚花色苷酸奶的感官评分呈先上升后下降的趋势，酸度呈上升趋势。菌种添加量为0.05%时，乳酸菌过少，产酸过少，不能充分利用糖所提供的能量，使酸奶较稀、偏甜，导致感官评分较低；菌种添加量为0.25%时，乳酸菌的量过多，能充分利用糖所提供的的能量进行发酵，但产酸强，使得酸奶酸度偏高，甜味较淡，从而使其感官评分偏低；菌种添加量为0.10%时，此时菌种所需的能量恰好与糖能提供的能量相当，使得乳酸菌利用适量的糖充分发酵，酸奶的酸甜比适度，从而使得感官评价得分较高。余森艳等[26]研究发现，酸奶中乳酸菌添加量过少，则不利于产酸，酸奶易不成型；乳酸菌添加量过多，产酸过强，导致乳清易析出，口感较涩，这与本试验的研究结果相一致。因此综合考虑，选择菌种添加量为0.10%进行后续试验。
图4 菌种添加量对桑葚花色苷酸奶品质的影响
Fig.4 Effect of strain addition on quality of mulberry anthocyanins yogurt
2.1.5 发酵时间对桑葚花色苷酸奶品质的影响
由图5可知，发酵时间为7～9 h时，桑葚花色苷酸奶感官评分呈先上升后下降的趋势。发酵时间为7 h时，发酵时间较短，导致桑葚花色苷酸奶的质地较稀，同时有少量乳清析出，食用起来产生不佳的愉悦感；酸奶发酵时间为9 h时，此时桑葚花色苷酸奶质地稠，由于发酵时间偏长，酸度偏高，使人食用起来有点偏苦。发酵时间为8 h时，桑葚花色苷酸奶的发酵程度适中，此时酸奶酸甜可口，质地细腻，感官评分最高。张永清[27]发现，酸奶发酵时间短，会使其凝固效果差，发酵时间过长，则酸度越高，乳酸菌活性逐渐下降，使口味发生变化，这与本试验的研究结果相一致。因此综合考虑，选择发酵时间为8 h进行后续试验。
图5 发酵时间对桑葚花色苷酸奶品质的影响
Fig.5 Effect of fermentation time on quality of mulberry anthocyanins yogurt
2.1.6 发酵温度对桑葚花色苷酸奶品质的影响
由图6可知，发酵温度为38～46 ℃时，桑葚花色苷酸奶的感官评分呈先上升后下降的趋势，酸度逐渐上升。发酵温度为38 ℃时，由于发酵温度整体偏低，乳酸菌发酵缓慢，桑葚花色苷酸奶质地较稀，风味较差，此时桑葚花色苷酸奶的酸度偏低，没有达到国标规定的酸度（≥70°T），感官评分较低；发酵温度为42 ℃时，乳酸菌发酵充分，酸甜适中，质地细腻，符合大众的口味；发酵温度为44～46 ℃时，发酵体系的温度较高，导致桑葚花色苷酸奶酸化过快，酸度较高，组织状态不好，酸奶风味不佳。李思宁等[28]发现，在38 ℃及以下发酵的酸奶，乳酸菌发酵慢，且凝乳效果差；在42 ℃以上温度发酵的酸奶，发酵速度会加快，但温度越高，则产酸过快，使酸奶组织状态粗糙，这与本试验研究结果相一致。因此综合考虑，选择发酵温度为42 ℃进行后续试验。
图6 发酵温度对桑葚花色苷酸奶品质的影响
Fig.6 Effect of fermentation temperature on quality of mulberry anthocyanins yogurt
以桑葚花色苷加热时间（A）、桑葚花色苷提取物添加量（B）、白砂糖添加量（C）、菌种添加量（D）为评价因素，以感官评分为评价指标进行正交试验，结果见表3。
表3 桑葚花色苷酸奶发酵条件优化正交试验结果与分析
Table 3 Results and analysis of orthogonal experiments for fermentation conditions optimization of mulberry anthocyanins yogurt
试验号 A B C D 感官评分/分1 2 3 1 1 1 1 2 3 1 2 3 1 2 3 70.7 94.0 85.0
续表
试验号 A B C D 感官评分/分4 5 6 7 8 9 K1K2K3K1K2K3R 2 2 2 3 3 3 2 3 1 3 1 2 3 1 2 2 3 1 90.0 85.0 72.0 74.0 73.0 92.0 249.70 247.00 239.00 83.33 82.33 79.67 3.57 234.70 252.00 219.00 78.23 84.00 83.00 5.77 215.70 276.00 244.00 71.90 92.00 81.33 20.10 247.70 240.00 248.00 82.57 80.00 82.67 2.67因素主次最优方案A1B2C2D3 1 2 3 1 2 3 C＞B＞A＞D
表4 正交试验结果方差分析
Table 4 Variance analysis of orthogonal experiments results
注：“*”表示对结果影响显著（P＜0.05）。
因素 偏差平方和 自由度 F 比 P 临界值 显著性ABCD误差20.642 56.976 606.776 12.709 698.100 2 2 2 2 8 0.118 0.326 3.477 0.079 3.110 3.110 3.110 3.110*
由表3可知，对桑葚花色苷酸奶品质的影响中主次因素排序为C＞B＞A＞D，由此可得，白砂糖添加量是影响桑葚花色苷酸奶配方工艺的主要因素，其次是桑葚花色苷添加量、桑葚花色苷加热时间、菌种添加量；由极差分析得出桑葚花色苷酸奶的最佳工艺为A1B2C2D3，即桑葚花色苷提取物加热时间1 min、桑葚花色苷添加量4%、白砂糖添加量10%、菌种添加量0.15%。在正交试验确定的最佳发酵条件下进行验证试验，桑葚花色苷酸奶感官评分为92分。
按照正交试验确定的最佳发酵条件制作桑葚花色苷酸奶，以相同工艺下不添加桑葚花色苷的酸奶为空白对照，酸奶后熟后对其酸度、pH值、DPPH自由基清除率、色差、持水力、乳清析出量、糖度、质构进行测定，对比桑葚花色苷酸奶和空白对照酸奶的品质，结果见表5、表6。
表5 桑葚花色苷酸奶与空白对照酸奶品质分析比较
Table 5 Analysis andcomparison of mulberry anthocyanins yogurt and blank control yogurtquality
乳酸菌活菌数/（CFU·mL-1）桑葚花色苷酸奶空白对照酸奶样品 酸度/T° pH值 色差（ΔE）DPPH自由基清除率/%持水力/%乳清析出量/%糖度/°Bx蛋白质/（μg·g-1）77.79 79.22 4.47 4.38 52.25 11.90 68.6 5.00 93.33 92.09 0.94 0.37 19.47 16.60 41.98 43.64 1.24×108 3.95×109
表6 桑葚花色苷酸奶与空白对照酸奶质构分析比较
Table 6 Analysis and comparison of mulberry anthocyanins yogurt and blank control yogurt texture
样品 硬度/g 粘性/（g·s-1） 内聚性 弹性/mm桑葚花色苷酸奶空白对照酸奶47.33 97.67 0.47 3.30 0.87 0.89 19.25 18.48
由表5可知，桑葚花色苷酸奶的酸度比空白对照酸奶的酸度略低，两者的酸度均符合国家标准中规定的发酵乳的酸度（≥70°T），pH值比空白对照酸奶pH值高，与所测定的酸度相对应，趋势正常。两者酸度、pH比较相近，口感之差主要体现在添加物上。酸奶的色泽是感官评价的主要因素之一。以白色为标样，ΔE越大，则表示酸奶的颜色变化越大[29]。桑葚花色苷酸奶ΔE变化最大，桑葚花色苷酸奶色泽偏紫红色，是令人愉悦的颜色，同时桑葚花色苷在合适的酸度内比空白对照的酸奶的甜度稍高，使其感官评分提高。桑葚花色苷酸奶DPPH自由基清除率高达68.6%，而空白对照酸奶DPPH自由基清除率为5%，可见添加桑葚花色苷到酸奶中达到预期的效果，提高了酸奶的抗氧化能力，具有一定的保健价值。持水力是衡量酸奶保持水分强弱的重要依据[30]，持水力的高低，反映了凝固型酸奶的凝乳效果，持水力低，会导致凝乳效果差，乳清容易析出，降低凝固型酸奶的品质。桑葚花色苷酸奶和空白对照酸奶的持水力相当，高达90%以上。其乳清析出量桑葚花色苷酸奶的比空白对照酸奶的要多出0.57%，因其桑葚花色苷为水溶性，在牛奶中有少量沉淀，其乳清较普通酸奶较容易析出。桑葚花色苷酸奶和空白对照酸奶的蛋白质含量相差不大。桑葚花色苷酸奶和空白对照组酸奶的乳酸菌活菌数均符合国家标准（≥1×106 CFU/mL）。
质构是评价酸奶的物理性质和感官的重要指标[31]。由表6可知，桑葚花色苷酸奶的硬度、粘性比空白对照酸奶低，因此在口感上空白对照酸奶较桑葚花色苷酸奶黏稠，说明空白对照酸奶较桑葚花色苷酸奶凝胶情况较好，主要原因可能与桑葚花色苷为水溶性色素有关，但其内聚性、弹性两者相比没有明显的差别。
由于桑葚花色苷酸奶贮藏14 d后感官上已逐渐趋于较酸，整体口感体验变差，故本试验研究桑葚花色苷酸奶在较优的贮藏期（13 d）内DPPH自由基清除率的变化。
由图7可知，桑葚花色苷酸奶DPPH自由基清除率随贮藏时间的延长而减小，第1天时DPPH自由基清除率为68.6%，第13天降至55.6%，验证了桑葚花色苷在低pH条件下有较好的保存效果[4]。
图7 桑葚花色苷酸奶及空白对照酸奶贮藏期DPPH自由基清除率的变化
Fig.7 Changes of DPPH radical scavenging rates of mulberry anthocyanins yogurt and blank control yogurt during storage
通过单因素和正交试验，本试验确定了桑葚花色苷酸奶的最佳发酵条件为桑葚花色苷加热时间1 min、桑葚花色苷提取物添加量4%、白砂糖添加量10%、菌种添加量0.15%、发酵时间8 h、发酵温度42 ℃。在此条件下制得的桑葚花色苷酸奶感官评分为92分，酸度为77.79 T°，pH值为4.47，持水力为93.33%，乳清析出量为0.94%，糖度为19.47°Bx，蛋白质含量为41.98 μg/g，乳酸菌活菌数为1.24×108 CFU/mL，DPPH自由基清除率为68.6%，贮藏第13天仍可达到55.6%，说明桑葚花色苷能在酸奶中较好地保存。
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