Cross modal perception interaction of flavor substances in soy sauce on umami and salt taste
随着人们对健康的重视，低盐、低糖、零添加、绿色有机等食品的需求与日俱增，营养与美味并重成为食品工业发展的新主题[1]。因此，在低盐、低糖的“健康红线”下实现“减盐不减鲜”成为食品研究的热点[2]。跨模态感知交互作用是指一种刺激（感觉）对另一种感觉起到增强或者补充作用[3]，如气味诱导滋味增强[4]。草莓和柠檬香气可以增强人们对蔗糖溶液的甜度感知[5]，2-糠基硫醇、2,3-二甲基吡嗪可以增强牛骨蛋白的咸味强度[6]，具有青草气味的顺-3-己烯醇可以显著增强初榨橄榄油的苦味强度[7]，3-甲基丁酸、2-丁酮、二乙酰以及2-庚酮等挥发性风味物质均可以明显地提升切达奶酪的鲜味[8]。因此，气味与味觉之间跨模态感知交互作用是提高食品的品质重要手段之一。同时，有研究指出，香草香精可使牛乳甜点产生相同甜味强度的基础上减少30%～40%的蔗糖用量，含有酱油香气化合物的盐在保持油炸花生咸味感知的基础上降低NaCl的用量[9]。因此，利用气味与滋味之间的跨模态感知交互作用是实现淡盐增咸[10]、减糖增甜[11]的有效方法。
酱油是我国传统的增咸提鲜的调味品，香气馥郁、滋味独特，被广泛用于各类卤制品、腌渍食品和食物烹饪中。研究指出，酱油中的3-甲硫基丙醛、1-辛烯-3-醇等挥发性气味化合物可以增强人们对鲜味和咸味的感知。然而，不同种类酱油中挥发性风味物质及其含量差异距大，香气属性复杂，其他气味物质与滋味是否存在跨模态感知交互作用尚不明确[12-14]。因此，该研究利用溶剂辅助风味物质提取法（solvent-assisted flavor evaporation，SAFE）、气相色谱-质谱联用（gas chromatography-mass spectrometer，GC-MS）和气相色谱/嗅闻-与滋味相关（gas chromatography/olfactometryassociated taste，GC/O-AT）技术筛选鉴定与滋味有关的挥发性风味化合物；选择其中与鲜味、咸味相关的挥发性物质，将其加入0.3%NaCl和0.3%谷氨酸钠（monosodium glutamate，MSG）的标准溶液中，探究酱油中挥发性风味物质气味与鲜味、咸味之间的相互作用；利用同源建模，对人体鲜味受体T1R1/T1R3的三维结构进行构建，使用分子对接研究气味分子与鲜味受体蛋白的结合作用，探究气味与滋味跨模态感知交互作用的机制，为利用跨模态感知交互作用实现食品风味和营养的双重调控提供理论基础。
广式酱油（NaCl 16 g/100 mL）、日式酱油（NaCl 16 g/100 mL）、商业轻盐酱油（NaCl 10 g/100 mL）分别编号为SS1、SS2、SS3：市售。
2-甲基吡嗪、二甲基三硫、3-甲硫基丙醛、3-甲硫基丙醇、4-乙基愈创木酚、糠醛、2-乙酰基呋喃、2-甲氧基-4-乙烯苯酚（均为色谱纯）：上海阿拉丁试剂公司；二氯甲烷、乙酸乙酯、2,6-二甲基吡嗪、2-乙基-3,6-二甲基吡嗪、2,3,5-三甲基吡嗪（均为色谱纯）：天津泰艾瑞科技有限公司；2-辛醇、1-辛烯-3-醇、2-乙基-4-羟基-5-甲基-3（2H）-呋喃酮（4-hy droxy-5-methyl-2-propyl-3（2H）-furanone，HEMF）、麦芽酚（均为色谱纯）、氯化钠、无水硫酸钠、谷氨酸钠（均为分析纯）、烷烃标准品（C6～C35，纯度≥99%）：美国Sigma公司。
SAFE蝶形反应器：德国GlasbläsereiBahr公司；EXT75DX复合分子涡轮真空泵：英国Edwards公司；CS501超级恒温水浴：上海博讯实业有限公司医疗设备厂；ME3002E电子分析天平：梅特勒-托利多仪器有限公司；7890 B-5977 A气相色谱质谱联用仪（GC-MS），DB-5毛细管色谱柱（30 m×0.25 mm，0.25 μm）：美国Agilent公司；7890B-ODP3气相色谱嗅闻仪：德国Gerstel公司；DCY-12S水浴式氮吹仪：金坛区华城誉仁实验仪器厂。
1.3.1 挥发性风味物质浓缩液的制备
取80.0 g酱油加入120 mL水中，分别加入1 g亚硫酸钠、0.5 mL乙酸乙酯，100 μL 2-辛醇（内标，200 mg/L），再加入50.0 mL二氯甲烷。在20 ℃、250 r/min恒温摇床上提取60 min，4 ℃、8 000 r/min条件下离心5 min，收集有机相。加入无水硫酸钠放置于-20 ℃过夜。
酱油挥发性风味物质浓缩液使用溶剂辅助风味蒸发法（SAFE）进行提取分离，蒸馏液氮吹浓缩至250 μL，储存于-20 ℃冰箱中，用于分析酱油中挥发性风味物质。
1.3.2 挥发性风味物质分析
GC条件：初始温度40 ℃，保持3 min；以5 ℃/min的速率升温至200 ℃；以10 ℃/min升至230 ℃，保持3 min；以5 ℃/min的速率升温至250 ℃，保持3 min；氩气流量为1.2 mL/min；进样口温度250 ℃。
质谱条件：电子电离（electron ionization，EI）源；电离能量为70 eV；传输温度280 ℃；离子源温度230 ℃；四极杆温度150 ℃；溶剂延迟时间12 min；扫描范围35～500 m/z。
1.3.3 气相色谱嗅闻滋味分析
在配备了嗅觉检测器的GC-MS系统上进行了GC/O-AT分析。气相色谱毛细管柱的末端与分流器相连，经1∶1分流后，分别进入MS检测器和嗅闻端口。嗅闻探测器的接口温度为150 ℃。感官评价小组记录酱油挥发性风味物质味道属性，同时记录香气强度。采用频率修正法对GC-O-AT结果进行分析，修正频率按照式（1）计算。
式中：T为修正频率，%；M为描述某种滋味的人员占比，%；
F为嗅闻强度与最强标准强度的比值。
选择36名（18名男性和18名女性）年龄20～30岁、味觉嗅觉灵敏且无吸烟史的成员，在恒温（25±2）℃的感官实验室中进行感官评价实验。实验前，使用鲜味、咸味标准溶液（MSG和NaCl）进行味觉轮廓和强度训练。
感官评价样本使用3位随机数编码，滋味的评价采用啜食法，整个样品置于舌面上，啜食3～5 s，随后将样液吐出。使用10 cm标度法评估感知的咸味或鲜味强度。每次感官评价实验小组成员需使用去离子水进行3次漱口，两次实验间隔5 min。
1.3.4 嗅觉增强咸味感知
根据GC-O-AT的结果，选取酱油挥发性风味化合物中与鲜味和咸味感知有关的物质，且修正频率＞70%，按照酱油中实际浓度（表1）添加到0.3%MSG和0.3%NaCl溶液中。感官评价结果记录为嗅觉增强咸味感知（odorinduced salt enhancement，OISE）和嗅觉增强鲜味感知（odor induced umami enhancement，OIUE）。OISE是添加挥发性物质后的咸度与相同浓度NaCl咸度的差值；OIUE为添加挥发性物质后的鲜度与相同浓度NaCl鲜度的差值。
表1 气味与滋味跨模态感知交互作用物质的添加量
Table 1 Amount of substances added to the cross-modal perception interaction between odor and taste
序号 化合物 CAS号 质量浓度/（μg·mL-1）1234567891 0 2,6-二甲基吡嗪二甲基三硫3-甲硫基丙醛1-辛烯-3-醇3-甲硫基丙醇HEMF 2-乙酰基呋喃麦芽酚4-乙基愈创木酚糠醛108-50-9 3658-80-8 3268-49-3 3391-86-4 505-10-2 27538-09-6 1192-62-7 118-71-8 2785-89-9 98-01-1 1 424 538 996 447 842 1 340 1 224 2 437 747 1 446
1.3.5 分子对接
将1.3.2中筛选得出气味增强鲜味感知的物质，与鲜味受体蛋白T1R1-T1R3进行分子对接。分子对接模拟使用AutoDock Vina（ADT，version 1.5.6）软件，移除受体文件中的水分子、并且对受体进行质子化、加电荷；对于分子对接，对接盒的大小被定义为60×60×60 Å（x，y，z），默认的网格间隔被设置为0.375 Å，盒子中心x为22.468 920，y为4.735 254，z为28.631 797。
人鲜味受体蛋白T1R1（Q7RTX1）和T1R3（Q7RTX0）分别被选为模板，使用Modeller 10.2软件进行同源建模，利用代谢型谷氨酸受体5（6N52）进行优化。利用全原子对接来寻找最佳对接构象。对接结果通过PyMOL软件可视化，通过Ligplus软件和蛋白质-配体相互作用分析工具。
1.3.6 数据处理
所有实验均进行3次及以上重复，使用SPSS Statistics 19.0 进行统计数据分析，使用Origin 2021进行图形样本可视化。通过样本t检验评估气味增强味觉的显著性，P＜0.05表示效果显著。
由表2可知，从3种酱油中筛选出17种与鲜味和咸味相关的挥发性风味物质，修正频率均＞60%，其中与咸味有关的有13种，大多数是呈现出烘烤香气和坚果香气的含氮、氧、硫等杂环类物质，如具有烧烤香气的2,6-二甲基吡嗪、烤肉气味的3-甲硫基丙醛、可可香气的2-乙酰基呋喃、烤洋葱气味的二甲基三硫等，这些物质的修正频率均＞70%，与咸味的感知表现出强烈的相关性。麦芽酚、1-辛烯-3醇、4-乙基愈创木酚、2-甲氧基-4-乙烯苯酚与鲜味的感知具有同一性。值得关注的是，HEMF具有焦糖香气和甜香，但其可以明显降低甜味的感知[15]，增强0.3%MSG的鲜味感知[16]。
表2 酱油中与滋味有关的挥发性风味物质
Table 2 Volatile flavor compounds related to taste in soy sauce
注：Sta：准品；RI：保留指数；MS：通过质谱信息与标准谱库对比定性，HEMF具有焦糖香气，大多数感官评价成员判定其与甜味的感知具有相关性，T值为92.66%，有部分感官评价员认为其与鲜味相关，因此，作为潜在的与鲜味相关的挥发性风味物质进行后续的研究。
滋味类型 挥发性风味物质 保留指数 类型 修正频率/% 鉴定方式咸味鲜味甜味*2,6-二甲基吡嗪3-甲硫基丙醛2-乙酰基呋喃3-甲硫基丙醇二甲基三硫糠醛2-乙基-3,6-二甲基吡嗪糠醇2-乙酰基-3,5（6）-二甲基吡嗪2,3,5-三甲基吡嗪2-甲基吡嗪2,3-二甲基吡嗪2-乙基-6-甲基吡嗪麦芽酚1-辛烯-3-醇4-乙基愈创木酚2-甲氧基-4-乙烯苯酚HEMF 897 868 910 948 970 808 1 064 829 1 182 1 012 798 898 972 1 072 963 1 260 1 282 1175烤香味烤肉味烤香、可可香烤马铃薯味烤洋葱香气烤面包味烤香味坚果、咖啡调味品味烤香味烤香味烤香味调味品味焦糖香、麦芽香蘑菇味烟熏味香辛料焦糖、甜香87.98 80.25 79.27 78.49 77.82 75.83 69.04 65.83 69.04 68.12 65.52 61.97 59.75 76.20 75.32 73.21 67.08 92.66 Sta、RI、MS Sta、RI、MS Sta、RI、MS Sta、RI、MS Sta、RI、MS Sta、RI、MS RI、MS RI、MS RI、MS Sta、RI、MS Sta、RI、MS RI、MS Sta、RI、MS Sta、RI、MS Sta、RI、MS Sta、RI、MS Sta、RI、MS Sta、RI、MS
为了研究酱油气味物质与滋味之间的跨模态感知交互作用，将酱油中与咸味、鲜味有关且修正频率＞70%的10种挥发性风味物质加入0.3%NaCl和0.3%MSG溶液中，感官评价小组成员记录其香味强度和OIUE、OISE，结果见图1。
图1 添加挥发性风味物质对0.3%氯化钠溶液嗅觉增强咸味感知值（a）和0.3%谷氨酸钠溶液嗅觉增强鲜味感知值（b）的影响
Fig.1 Effect of volatile flavor substances addition on odor induced salt enhancement value of 0.3% NaCl (a) and the odor induced umami enhancement value of 0.3% monosodium glutamate (b)
“***”表示影响非常显著（P＜0.001），“**”表示影响极显著（P＜0.01），“*”表示影响显著（P＜0.05）。
由图1a可知，2,6-二甲基吡嗪、二甲基三硫、3-甲硫基丙醛、3-甲硫基丙醇、4-乙基愈创木酚可以非常显著增强0.3%NaCl的咸度（P＜0.001）；1-辛烯-3-醇、糠醛可以极显著增强0.3%NaCl的咸度（P＜0.01）；HEMF、2-乙酰基呋喃、麦芽酚可以显著增强0.3%NaCl的咸度（P＜0.05）；其中，3-甲硫基丙醛的OISE值最大，增咸效果最为明显。以硫化物、吡嗪、愈创木酚为关键挥发性风味物质的鲣鱼干蒸汽馏出物可以显著性的增强低NaCl溶液的咸味强度和适口感[17]。这可能是酱油挥发性风味物质中的3-甲硫基丙醛等物质与滋味发生跨模态感知交互作用，实现了增咸作用[9]。由图1b可知，二甲基三硫、3-甲硫基丙醛、1-辛烯-3-醇、2-乙酰基呋喃、麦芽酚、4-乙基愈创木酚、糠醛可以非常显著增强0.3%MSG的鲜度（P＜0.001）；2,6-二甲基吡嗪、3-甲硫基丙醇可以极显著增强0.3%MSG的鲜度（P＜0.01）；HEMF可以显著增强0.3%MSG的鲜度（P＜0.05）。在模拟基质中这些物质在一定程度上也可以增强咸味的感知，这表明不同属性的气味分子与滋味的跨模态感知交互作用也可能与滋味[18]一样存在协同作用。
通过同源建模构建的鲜味受体蛋白的三维结构如图2a所示。由图2a可知，该蛋白由N端胞外结构域（extracellulardomain，ECD）和七跨膜螺旋结构域（seven transmembrane domain，7-TM）形成的二聚体，ECD由包含配体结合区域的捕蝇草结构区（venus flytrap domain，VFD）和富含半胱氨酸的结构区（cysteine-rich domain，CRD）组成，VFT通过CRD与7-TM结构域相连。蛋白质三级结构的拉曼分析结果如图2b所示。由图2b可知，氨基酸残基位于可信区的比例为99.9%（87.4%位于最优区、11.9%位于合理区、0.6%位于最大允许区），不合理区域的氨基酸残基占比仅为0.1%，远小于5%[20]，因此，所构建的人体鲜味受体构像是合理的。此外，该蛋白与源模板在保守区域具有较高的相似性，其均方根偏差（root mean square deviation，RMSD）=1.54＜2[19]，可以较为准确的模拟配体和受体的结合作用。从而进一步阐述挥发性风味物质与和味觉的跨模态感知交互作用的机理。
图2 优化后鲜味受体蛋白T1R1/T1R3的三级结构模型及拉曼分析结果
Fig.2 Tertiary structure model and ramachandran plot of the optimized taste receptor protein T1R1/T1R3
食品风味的感知是一个复杂的过程，不仅依赖于大脑高级区域的岛叶皮层[21]（insular cortex，IC）和眼窝前额皮质（orbitofrontal cortex，OFC）[22]自上而下的认知性神经调节，同时也基于呈味物质与味觉和嗅觉受体结合所产生的感觉信号。气味和滋味跨模态感知交互作用是一个复杂的过程，其作用机理尚不明确，因此利用分子对接，对气味分子和鲜味受体进行模拟结合，探究气味和滋味之间跨模态感知交互的机理。由表3可知，从酱油中筛选出的挥发性风味物质均与鲜味受体实现较好的结合，且结合能都大于阳性对照L-谷氨酸[23]，味觉的产生依赖味觉物质与味觉受体的结合[24]，因此，酱油中的挥发性风味可能是通过激活相应的味觉受体，实现某些味觉感知的增强。此外，鲜味受体的VFD区域的Ser40、Lys402、Asp311、Lys334、Asp315、Ser158、Thr181是鲜味受体的关键结合位点。
表3 鲜味增强剂与鲜味受体蛋白作用位点及结合能
Table 3 Interaction sites and binding energies of umami enhancers and umami receptor proteins
鲜味增强剂 氢键数量 相关氨基酸残基 结合能/（kJ·mol-1）2,6-二甲基吡嗪二甲基三硫3-甲硫基丙醛1-辛烯-3-醇3-甲硫基丙醇2-乙酰基呋喃麦芽酚4-乙基愈创木酚糠醛NAG L-谷氨酸1 5 2 2 4 1 2 3 1 3 2 Ser401 Ser 401、Asp 311、Lys 402、Lys 334 Lys 402、Ser 401 Asp 311、Lys 402 Ser 401、Asp 315、Lys 402 Lys 402 311Asp、402Lys Thr 181、Ser 158 Lys 402 Ser 179、Ser 158、Asp 201 Asp 311、Leu335-12.97-43.89-32.60-16.30-37.16-29.68-22.15-18.78-19.65-21.74-12.96
氢键、疏水作用是气味分子与鲜味受体蛋白结合的主要作用力，这与之前的研究表现出高度的一致性[25]。由图3可知，3-甲硫基丙醛通过醛基和硫原子分别与Lys402、Ser401形成氢键，其结合能达到-32.6 kJ/mol。二甲基三硫通过与鲜味受体VFD区域的Ser401、Asp311、Lys402、Lys334结合，具有最小的结合能为-43.89 kJ/mol。有研究表明，3-甲硫基丙醛是鲜味受体蛋白T1R1/T1R3的正变构调节剂[26]，通过与鲜味受体蛋白ECD区域的VFD结合，迫使蛋白二聚体界面相互靠近，使下端富含半胱氨酸的区域接近，富含半胱氨酸的结构域和受体的第二个细胞外环之间的相互作用，使7个跨膜结构域的蛋白亚基重新定位，它们相互接触以启动信号传递[27]，由此产生鲜味信号研究表明，咸味物质可以与鲜味受体结合，从而与鲜味表现出协同作用。由此，气味与鲜味和咸味之间的跨模态感知交互作用可能是基于气味分子与味觉蛋白结合，改变味觉受体蛋白的构象，从而产生味觉信号。
图3 3-甲硫基丙醛与鲜味受体蛋白、关键氨基酸残基结合作用分析
Fig.3 Analysis of binding effect of 3-methylthiopropanal with umami receptor protein and key amino acid residues
研究通过GC-O-AT以及GC-MS对酱油中与滋味有关的挥发性风味物质进行鉴定，共发现17种与咸味和鲜味有关的挥发性风味物质。糠醛、2,6-二甲基吡嗪、二甲基三硫、3-甲硫基丙醛、3-甲硫基丙醇、1-辛烯-3-醇、4-乙基愈创木酚可以显著提高0.3%NaCl溶液咸味感知；2,6-二甲基吡嗪、二甲基三硫、3-甲硫基丙醛、1-辛烯-3-醇、3-甲硫基丙醇、2-乙酰基呋喃、麦芽酚、4-乙基愈创木酚、糠醛可以诱导鲜味增强。酱油中的气味物质通过氢键可以通过疏水作用与鲜味受体结合，引起鲜味受体蛋白的构象发生改变，从而引起鲜味的感知。本研究为利用气味与滋味跨模态感知交互作用实现酱油的鲜味和咸味综合评价和利用酱油实现“减盐不减鲜、减盐不减味”的风味调控提供理论依据。
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