表1 酿酒污水水质参数测定结果
Table 1 Determination results of brewing wastewater quality parameters
NH4+-N/（mg·L-1）酿酒污水低C/N污水污水类型 色度 TN/（mg·L-1）NO3--N/（mg·L-1）COD/（mg·L-1）7 800 7 1 120.1 17.5 680.5 15.9 72 549.7 156.5 395.2 1.2
Application performance and risk analysis of the brewing wastewater recycling technology
氮污染容易导致水体富营养化[1]。而城镇污水处理厂的尾水氮素排放是导致河流等受纳水体氮素积累的主要原因[2]。一些未达标的污水处理厂被要求进行提标改造，以实现尾水中的氮素低于排放标准[3]。然而，我国部分地区的城市生活污水逐渐转变为低碳氮比（C/N）[4]。特别是西南地区（如成都、重庆、泸州等）污水的C/N仅为4左右。碳源不足导致氮素去除过程缺少充足的有机物和电子供体，削弱了微生物活性，从而降低了脱氮性能[5]。因此，污水的低C/N特性给污水处理厂的提标改造带来了更严峻的挑战。为此，污水处理厂采取了外加碳源（如葡萄糖[6]、乙酸钠等[7]）的措施以强化氮素去除性能。尽管这些方法提高了工艺脱氮效果，但是无疑增加了运行成本。
酿酒污水是酿酒过程的主要废弃物，是酿酒过程中产生的冲洗废水、冷却水、窖底水等的总称，富含多糖、有机酸、乙醇、甘油等有机物，具有有机物浓度高、氨氮浓度高、悬浮物浓度高的特点[8]。相对于可以用作饲料的酒糟而言，其目前的利用率还比较低，缺乏有效的利用手段[9]。但若不加以利用或者处理，直接排放将对环境造成严重危害[10]。需要指出是，酿酒污水的高浓度有机物特性可以满足污水处理厂缺少碳源的需求，若将其用作污水处理的碳源，将不仅可以实现酿酒污水的资源化利用，而且可以实现对污水的处理。此外，酿酒污水的定量投加，可以避免外加碳源导致的出水有机物超标的风险。但是酿酒污水用于城镇污水处理厂尾水处理的应用还未得到评估，此外，酿酒污水的资源化微生物机制也需要揭示。
因此，本研究利用酿酒污水作为碳源，评估了其对低碳污水的处理性能；通过参数优化获得了最优运行条件，分析了酿酒污水资源化利用过程的微生物机制，以期为酿酒污水的资源化利用提供理论与应用基础。
移动床生物膜反应器（反应器由内外双层构成，内层为反应区，外层为水浴保温层，通过循环水浴控制反应器温度。反应区有效体积1L，内填充聚氨酯，填充密度为30%）：上海龙菲有机玻璃定制加工制作厂；有机玻璃：北京景天伟艺装饰工程有限公司；聚氨酯（polyurethane，PU）：江西耐可化工设备填料有限公司。
酿酒污水：泸州市某酿酒厂实际酿酒污水；低C/N污水：模拟污水。两种污水水质参数包括总氮（total nitrogen，TN）、铵态氮（NH4+-N）、亚硝酸盐氮（NO3--N）、化学需氧量（chemical oxygen demand，COD），具体质量浓度见表1。为保证微生物正常生长，加入5 mL/L微量元素混合液（3 g/L MnSO4，3 g/L ZnSO4·7H2O，0.3 g/L FeSO4·7H2O，0.6 g/L CaCl2·2H2O，0.5 g/L H3BO3，3 g/L CuSO4·5H2O）[11]。
表1 酿酒污水水质参数测定结果
Table 1 Determination results of brewing wastewater quality parameters
NH4+-N/（mg·L-1）酿酒污水低C/N污水污水类型 色度 TN/（mg·L-1）NO3--N/（mg·L-1）COD/（mg·L-1）7 800 7 1 120.1 17.5 680.5 15.9 72 549.7 156.5 395.2 1.2
LQ-LC电子天平：苏州正峰电子科技有限公司；SH-6600紫外可见分光光度计：江苏盛奥华环境科技有限公司；BT100LY+YZ15蠕动泵：保定融柏恒流泵制造有限公司；ACO-9720曝气泵：广东海利有限公司。
1.3.1 实验方法
实验前，采用总悬浮固体（total suspended solid，TSS）质量浓度为4.4 g/L的活性污泥对PU载体进行挂膜，挂膜结束后进行正式实验。酿酒污水与低C/N污水按照体积比500∶1进行混合[11]。高添加比例会导致低C/N污水中COD大量剩余，低添加比例会导致低C/N污水中有机物浓度无法满足微生物需求，本实验采用适中比例500∶1。运行期间（共65 d），温度控制在30 ℃左右，溶解氧（dissolved oxygen，DO）为4 mg/L，初始水力停留时间（hydraulic retention time，HRT）为36 h，随后依次缩短至24 h、12 h、6 h以进行参数优化。每个HRT优化阶段结束后，取PU附着的生物膜进行微生物学分析，分别命名为HRT 36 h、HRT 24 h、HRT 12 h、HRT 6 h。每天固定时间取水样进行水质分析，检测色度、TN、NH4+-N、NO3--N、COD变化。
1.3.2 测定方法[12]
NH4+-N采用纳氏试剂分光光度法分析；NO3--N采用酚二磺酸光度法分析；TN采用碱性过硫酸钾消解紫外分光光度法分析；色度采用光电比色法分析；COD 采用重铬酸钾快速法分析。
1.3.3 酿酒污水细菌结构分析
高通量测序方法如下[13]：先用试剂盒对获得的生物样品进行脱氧核糖核酸（deoxyribonucleic acid，DNA）提取，随后送至美吉（上海）进行DNA质检、纯化。纯化后，使用TBS-380（Turner Biosystems，美国）对16S rRNA V3-V4区聚合酶链式反应（polymerase chain reaction，PCR）产物进行定量。由Miseq平台对16S rRNA基因高变区序列进行测序，测序区域选择V3-V4区，测序片段为468 bp，测序引物为338F-806R，使用Trimmomatic、FLASH软件对Miseq测序数据进行处理获得干净数据，在Usearch软件平台中使用uparse方法将序列按照彼此相似性为97%分归为许多小组，一个小组为一个操作分类单元（operationaltaxonomicunits，OTU），从而得到OTU的代表序列。然后，使用uchime检测PCR扩增中产生的嵌合体序列并从OTU中去除，再用usearch_global方法将优化序列map比对回OTU代表序列，最终得到OTU各样品序列丰度统计表。BugBase（https：//bugbase.cs.umn.edu/index.html）是一种微生物组分析工具，可以确定微生物组样本中存在的高水平表型，能够进行表型预测。BugBase首先通过预测的16S拷贝数对OTU进行归一化，然后使用提供的预先计算的文件预测微生物表型。
1.3.4 数据处理
水质检测数据由Origin 2017进行处理、绘图。微生物多样性数据由美吉平台（https：//cloud.majorbio.com/）进行处理、绘图。
将酿酒污水与低C/N污水按照500∶1的比例混合后，反应器进水质量浓度为：COD 301.29 mg/L、NH4+-N 1.99 mg/L、NO3--N 17.23 mg/L、TN 19.7 mg/L。色度被稀释后为23。可见，NH4+-N质量浓度是低于污水处理厂的排放标准5 mg/L，因此，重点考察实验装置中的色度、COD、NO3--N、TN的质量浓度变化。结果见图1。
图1 不同水力停留时间酿酒污水的色度（a）、COD（b）、NO3--N（c）、TN质量浓度（d）变化
Fig.1 Chromaticity (a), COD (b), NO3--N mass concentration (c),and TN mass concentration (d) of brewing wastewater with different hydraulic retention time
如图1（a）所示，每个阶段结束后分析了出水色度，HRT由36 h依次降低至24 h、12 h、6 h的过程中，色度值逐渐递增，分别由HRT 36 h的12.8增加为13.5、15.4、19.3。这说明HRT的降低导致了色度去除效果的减弱，这主要是因为实验装置中的微生物的吸附作用时间缩短导致的[14]。由于酿酒污水提供碳源，因此实际配水的COD达到了301.29 mg/L，但是其利用效果还需要评估。图1（b）显示了在不同的HRT参数阶段的COD变化。在HRT为36 h的条件下，初始存在浓度波动，由于微生物未能适应含有酿酒污水的配水。经过一周后，COD逐渐稳定，并在最后5 d实现了稳定出水，其平均COD为33.5 mg/L，低于污水处理厂排放浓度阈值。但是，随着HRT降低，COD呈现上升趋势，在HRT为24 h、12 h、6 h的条件下，稳定后的COD平均值分别为38.8 mg/L、49.12 mg/L、74.72 mg/L，这说明在HRT为6 h的条件下存在COD超标的风险。酿酒污水中的有机物多为小分子有机物，包含被水解后形成的脂肪酸、乙醇等，因而可以直接被微生物利用，不存在难以降解和出水浓度超标的情况[11]，在HRT为36 h、24 h、12 h的条件下均可以实现有效利用。但是过短的HRT会导致更高的水利剪切力和更短的微生物接触时间，这是导致出水COD高的主要原因[15]。此外，NO3--N是污水处理厂尾水的主要污染物，为了评价酿酒污水对低C/N污水处理的强化效果，监测了各个参数条件下的质量浓度变化。如图1（c）所示，NO3--N在初始进水质量浓度为17.23 mg/L、HRT为36 h的条件下，出水稳定后的NO3--N平均质量浓度仅为2.62 mg/L。长的HRT更利于实验装置内形成稳定的厌氧区域，从而保证了反硝化过程的稳定性，去除NO3--N。但是HRT的缩短也导致了更高的出水浓度，在HRT为24 h、12 h、6 h的条件下，稳定后的NO3--N出水质量浓度分别为3.88 mg/L、5.46 mg/L、6.74 mg/L。在HRT缩短至12 h和6 h的时候，出水浓度上升更显著，说明36 h和24 h更适合反硝化过程。为了评价氮素浓度是否超过污水处理厂排放阈值，还连续监测了TN浓度变化。如图1（d）所示，TN的浓度趋势与NO3--N一致，这说明实验过程并未出现更多的NH4+-N。这是由于酿酒污水中的大分子蛋白都几乎被水解，因而实验过程未发生蛋白质水解和释放NH4+-N的过程。在HRT为36 h、24 h、12 h、6 h的条件下，稳定后的出水TN质量浓度分别为4.96 mg/L、6.32 mg/L、8.02 mg/L、9.24 mg/L，均低于污水处理厂排放阈值15 mg/L。
因此，利用酿酒污水作为碳源提高低C/N污水氮素去除性能的方法被证实是可行、有效的。这为酿酒污水的处理处置提供了一种新的思路和方法。此外，通过参数优化发现HRT为36～12 h均可以满足污水处理厂的要求。
氮素去除性能和有机物利用效果受到菌群调控。不同的HRT参数造成菌群差异，从而影响了性能。如图2（a）所示，在4个条件下，HRT 36 h、24 h、12 h、6 h的OTU分别为397个、307个、335个、402个，四个菌群具有177个共有OTU。在HRT为24 h和12 h的条件下，可能富集了高丰度的优势菌属。优势菌属的高丰度富集可以更利于污染物去除[16]，并鉴别主要的功能菌属，从菌群富集角度来说，HRT为24 h和12 h可能更利于氮素去除。除了菌属数量差异，还利用主成分分析评价了HRT变化对菌群结构的影响。如图2（b）所示，HRT为36 h和24 h条件下的样本距离最近，这说明二者菌群结构是相似的。这也说明主要的优势菌属可能是相似的，但是需要进一步分析菌群组成证实。HRT 12 h和HRT 6 h条件下的样本距离最远，持续缩短HRT导致富集的菌群是不同的。因此，HRT的变化会导致菌群差异，推测在HRT为36 h和24 h条件下的优势菌群可能是相似的。
图2 不同水力停留时间酿酒污水的菌群韦恩图（a）和三维主成分分析（b）
Fig.2 Venn diagram (a) and three-dimensional principal component analysis (b) of microbial community of brewing wastewater with different hydraulic retention time
为了确定主要的功能菌属，对菌属组成进行了鉴定。如图3（a）所示，在HRT为36 h的条件下，主要的优势菌属为食酸菌属（Acidovorax）（42.98%）、丝状菌（Meganema）（16.45%）、因赫拉菌属（Inhella）（6.95%）、丛毛单胞菌科unclassified_Comamonadaceae（6.18%）、腐螺旋菌科norank_ Saprospiraceae（2.85%）、假单胞菌属（Pseudomonas）（2.08%）、赫黄嗜盐囊菌属（Haliangium）（1.61%）、根瘤菌目unclassified_Rhizobiales（1.26%）。其中Acidovorax的高丰度富集导致了最高的TN去除性能，这表明具有异养反硝化功能的Acidovorax是关键菌属[17]。图3（b）中显示了被检测菌属的种族关系，与异养反硝化菌属unclassified_Comamonadaceae[18]功能相近的Inhella[19]、噬氢菌属（Hydrogenophaga）[20]等菌属协同进行了氮素去除。HRT为24 h条件下的菌群主要由Acidovorax（36.16%）、unclassified_Comamonadaceae（10.27%）、Meganema（6.85%）、Inhella（6.60%）、Pseudomonas（4.59%）、Haliangium（2.34%）、norank_Saprospiraceae（2.21%）、蛭弧菌属（Bdellovibrio）（1.88%）构成。这与图2的结论一致，即HRT 36 h和HRT 24 h条件下的优势菌属是一致的，均为Acidovorax。但是Acidovorax、Meganema、Inhella的丰度出现了降低，这可能是导致低的反硝化性能和COD去除性能的主要原因。此外，在HRT降至12 h时，菌群组成变化显著。除了Acidovorax（19.75%）、unclassified_Comamonadaceae（9.41%），还新增了陶厄氏菌属（Thauera）（6.97%）、Hydrogenophaga（4.98%）、固氮弧菌（Azovibrio）（4.25%）、苯基杆菌属（Phenylobacterium）（4.02%）。图3（b）显示这些菌属为反硝化菌属。虽然一些反硝化菌属丰度增加，但是与TN的去除性能变化趋势不一致，这进一步证实Acidovorax是主要的反硝化菌属。当HRT持续降低至6 h时，主要的优势菌属由Acidovorax变为丰度为15.75%的Hydrogenophaga，此时Acidovorax丰度仅为9.91%，说明在短的HRT条件是不利于该菌属优势富集的。可以得出，HRT降低导致水力剪切力增加，削弱了Acidovorax丰度，从而导致反硝化性能降低。此阶段，还监测到一些低丰度的反硝化菌属，比如Meganema（11.89%）、Thauera（9.99%）、脱硫球菌属（Desulfobulbus）（2.88%）、unclassified_Comamonadaceae（2.63%）、脱氯菌属（Dechloromonas）（2.17%），这些菌属对污染物去除起到协同作用。
图3 不同水力停留时间酿酒污水的细菌菌属丰度（a）和系统发育树（b）
Fig.3 Bacterial genera abundance (a) and phylogenetic tree (b) of brewing wastewater with different hydraulic retention time
因此，在酿酒污水作为碳源的移动床生物膜反应器中，Acidovorax是主要的异养反硝化菌属，同步去除NO3--N和COD，此外，长的HRT更利于该菌属优势富集。
尽管酿酒污水被证实可以为低C/N污水反硝化过程提供碳源，但是该技术的潜在影响还需要进一步评估。在酿酒污水的资源化过程，微生物起主要作用。根据BugBase进行了表型分析[21]。如图4（a）所示，比较了不同HRT条件下的菌群致病表型的丰度。丰度越高，则污水处理过程中存在的致病风险越高。HRT从36 h依次变为24 h、12 h、6 h时，致病表型丰度由40.36%变为44.65%、8.07%、3.70%，说明虽然长的HRT利于反硝化过程，但是存在更高的致病风险。这主要是由于携带致病表型的细菌[变形菌门（Proteobacteria）]也实现了高丰度富集。Proteobacteria携带氮素去除功能基因，但是也携带了致病基因[22]。致病表型的传播风险一般由移动元件表型决定。移动元件表型的丰度越高，则细菌的传播力越强。图4（b）分析了不同HRT条件下的移动元件表型丰度值和携带细菌。移动元件的携带细菌主要为变形菌门（Proteobacteria）[23]、厚壁菌门（Firmicutes）[24]、放线菌门（Actinobacteria）、装甲菌门（Armatimonadetes）。后三者似乎受到HRT的影响较小，这导致移动元件表型的分布规律与致病表型的不一致，在HRT为36h、24h、12 h、6h的条件下，其丰度分别为40.53%、33.86%、19.95%、58.01%。这说明过长或者过短的HRT都利于移动元件表型富集，其传播风险也更大[25]。一般而言，需要综合考虑二者的富集特点，结果表明，在HRT为12 h时污水处理过程的微生物综合风险因素最低，该条件被视为最佳运行条件。
图4 不同水力停留时间酿酒污水细菌的致病表型丰度（a）和移动元件表型丰度（b）
Fig.4 Pathogenic phenotype abundance (a) and mobile element phenotype abundance (b) of brewing wastewater with different hydraulic retention time
本研究利用酿酒污水作为微生物碳源，实现了酿酒污水的资源化利用，并进行了HRT优化，得出以下结论：
酿酒污水用作碳源可以强化低C/N污水处理性能。经处理后，在HRT为36～12 h的条件下均可以满足城镇污水处理厂尾水排放标准。该技术为酿酒污水资源化提供了新思路，有一定指导意义。在不同的HRT条件下，微生物菌群发生变化，在HRT为24 h和12 h条件下更利于富集高丰度菌属。食酸菌属（Acidovorax）是主要的异养反硝化菌属，实现有机物和NO3--N同步去除。但是其富集受到HRT的调控，越长富集程度越高。在HRT为12 h时更利于酿酒污水的资源化过程，此时微生物致病和传播风险最低。后续还应对酿酒污水资源化应用过程的碳排放、成本等进行综合评价，此外，溶解氧、填料比等参数也需要进行优化。
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