Optimization of fermentation technology and antioxidant activity of banana carrot compound fruit and vegetable juice
香蕉（Musa nana Lour.）为芭蕉科芭蕉属植物，是热带地区最常见和最受欢迎的水果之一。近年来，我国香蕉产量达1 100 万t，其广泛种植于我国广东、广西、台湾、海南等地区[1-2]。香蕉风味好、口感甜美，富含多种营养物质，因而受到消费者的青睐。胡萝卜（Daucus carrot）又名红萝卜，其原料丰富价格低廉，营养价值高，富含β-胡萝卜素、核黄素、尼克酸、硫胺素等多种维生素，具有抑制衰老、抵抗癌、健胃和降血压等功能[3-4]。胡萝卜汁因其色泽、口感、外观品质良好，而受到人们的喜爱。果蔬类食品在储藏和运输过程中易产生腐败变质，造成浪费[5]。对果蔬进行深加工利用，可以延长其货架期，提高产品的商品价值[6]。
有报道发现，乳酸菌发酵给果蔬汁带来了独特的口感，发酵过程中又产生了多种营养成分和一些乳酸菌的代谢产物。这些产物能调节肠胃菌群，降低胆固醇的活性，对人体有一定的保健效果[7]。因此，近年来利用益生菌发酵果蔬汁类饮品越来越受到人们的关注[8-10]。SEELAM D N S等[11]利用球形芽孢杆菌发酵胡萝卜汁，制备了一款风味好、营养丰富的发酵果蔬汁饮品，并且发现发酵后的胡萝卜汁有更高的氧化活性。李南薇等[12]以香蕉和橙为主要原料，制备了一款营养丰富、酸甜适口，具有浓郁的香蕉、橙香味，稳定性较好的混合果汁酸乳饮料。韦璐等[13]以香蕉、芒果、六堡茶汤为主要原料，佰生优益生菌果蔬酵素发酵菌为菌种，研制了一款发酵型香蕉复合果汁饮料。
本研究以香蕉、胡萝卜为原料，研究利用植物乳杆菌（Lactobacillusplantarum）和发酵乳杆菌（Lactobacillus fermentium）复合菌种发酵香蕉胡萝卜果蔬汁的加工工艺，考察原料配比、接种量、发酵温度、发酵时间等发酵条件对乳酸发酵的影响，通过单因素及响应面试验对发酵条件进行优化，同时分析了其成分指标和抗氧化活性，为香蕉、胡萝卜类果蔬汁饮品开发利用途径提供了参考。
香蕉、胡萝卜、白砂糖：市售；植物乳杆菌（Lactobacillus plantarum）21802、发酵乳杆菌（Lactobacillus fermentum）21800：中国工业微生物菌种保藏管理中心；MRS培养基：广东环凯微生物科技有限公司；果胶酶（1.0×104 U/g）：南宁市东恒华道生物科技有限责任公司；1,1-二苯基-2-三硝基苯肼（1,1-diphenyl-2-trinitrophenylhydrazine，DPPH）、2,2'-联氮-双-3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸（2,2'-diazo-di-3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonic acid，ABTS）：上海源叶生物科技有限公司。其他试剂均为国产分析纯。
SKP-01 电热恒温培养箱：湖北省黄石恒丰医疗器械有限公司；SW-CJ-1F 洁净工作台：苏净集团苏州安泰技术有限公司；TG16-WS 台式高速离心机：上海卢湘仪离心机仪器有限公司；IS-RDV1 恒温振荡箱：上海呈天医流科技股份有限公司；HWS-28电热恒温水浴锅：上海齐欣科学仪器有限公司；T6-新世纪紫外可见分光光度计：北京普析通用仪器有限责任公司；ME204E 电子天平：梅特勒-托利多仪器（上海）有限公司；IMJ-54A 立式压力蒸汽灭菌锅：上海博迅实业有限公司医疗设备厂；TM-767Ⅲ搅拌机：中山市海盘电器有限公司；LB90T 糖度计：广州市速为电子科技有限公司；PHS-3C pH计：上海仪电科学仪器股份有限公司。
1.3.1 香蕉胡萝卜复合果蔬汁的加工工艺流程
1.3.2 操作要点
香蕉胡萝卜汁的制备：将去皮的香蕉和清洗干净的胡萝卜分别切成1 cm左右的片状，并分别放置于搅拌机中不加水打浆至浆状，然后按0.1%的果胶酶分别添加到香蕉浆和胡萝卜浆中，水浴（60 ℃，3 h）下搅拌酶解。将酶解后的香蕉汁和胡萝卜汁分别置于高速离心机（8 000 r/min，20 ℃、10 min）离心，取上清液，得香蕉汁和胡萝卜汁。
均质：将香蕉汁和胡萝卜汁分别按照不同体积比（4∶1、3∶1、2∶1、1∶1、1∶2）混合，并在均质机内均质均匀（230 MPa，55 ℃）。
杀菌、冷却：取均质好的香蕉胡萝卜复合果蔬汁300 mL，置于500 mL广口瓶中，用两层纱布封口，水浴条件下杀菌（90 ℃、15 min），然后冷却至室温备用。
菌株活化[14]：挑取适量的植物乳杆菌冻干粉、发酵乳杆菌冻干粉分别接种至10 mL MRS液体培养基中，于37 ℃条件下培养24 h，按接种量10%（V/V）分别接种至100 mL MRS液体培养基中，于37 ℃条件下培养24 h，待用。
接种：取活化好的植物乳杆菌和发酵乳杆菌按1∶1配比，按照一定接种量接种至杀菌冷却后的复合果蔬汁中。
发酵：将接种后复合果蔬汁置于恒温培养箱中发酵一段时间，当发酵液澄清且无气泡产生时，发酵结束，即得香蕉胡萝卜复合果蔬汁。
1.3.3 发酵工艺优化
（1）单因素试验
设定香蕉汁与胡萝卜汁体积比分别为4∶1、3∶1、2∶1、1∶1、1∶2，接种量分别为1%、3%、5%、7%、9%，发酵温度分别为27 ℃、30 ℃、33 ℃、36 ℃、39 ℃条件下发酵24 h、36 h、48 h、60 h、72 h，分别测定其活菌数并进行感官评分，分别考察香蕉汁与胡萝卜汁体积比、接种量、发酵温度及发酵时间对香蕉胡萝卜复合果蔬汁品质的影响。
（2）响应面试验
在单因素试验基础上，采用Box-Behnken试验设计，设置香蕉汁与胡萝卜汁体积比（A）、乳酸菌菌种接种量（B）、发酵温度（C）和发酵时间（D）4个因素为自变量，以发酵产品感官评分（Y）为响应值，进行发酵工艺优化，Box-Behnken试验设计因素与水平见表1。
表1 Box-Behnken试验设计因素与水平
Table 1 Factors and levels of Box-Behnken experiments design
1.3.4 分析检测
乳酸菌活菌数的测定：采用GB 4789.35—2016《食品安全国家标准食品微生物学检验乳酸菌检验》规定方法；pH值的测定：采用pH计；可溶性固形物含量的测定：采用手持折光仪；总酸（以乳酸计）含量的测定：采用电位滴定法[15]；还原糖含量的测定：按照GB 5009.7—2016《食品安全国家标准食品中还原糖的测定》规定方法；羟自由基清除率的测定：参照文献[16-17]的方法；DPPH自由基清除率的测定：参照文献[18-19]的方法测定；ABTS自由基清除率：参照文献[20]的方法。
1.3.5 感官评定
参考文献[21-22]方法，由10名具有食品专业的老师和同学组成品评小组，分别从色泽、口感、香气、组织状态四个方面来对复合果蔬汁进行感官评定，评分标准见表2。
表2 香蕉胡萝卜复合果蔬汁饮料感官评分标准
Table 2 Sensory evaluation standards of compound fruit and vegetable juice beverage
1.3.6 数据处理
采用Origin 2019软件绘图，采用SPASS 26.0对试验进行方差分析和差异显著性分析，每组试验均做3组平行。
2.1.1 香蕉汁与胡萝卜汁体积比的影响
由图1可知，香蕉汁与胡萝卜汁体积比在4∶1、3∶1、2∶1时，发酵果蔬汁感官评分随着香蕉汁的减少而逐渐提高；并在香蕉汁与胡萝卜汁体积比为2∶1时感官评分最高，为82分；香蕉汁与胡萝卜汁体积比在1∶1、1∶2时感官评分有所下降。而活菌数随着香蕉汁和胡萝卜汁体积比的变化而逐渐缓慢的减少。原因可能是，当香蕉汁含量较高时，复合果蔬汁饮料口感稍甜，色泽稍暗，感官评分较低；当香蕉汁和胡萝卜汁的体积比达到2∶1时，复合果蔬汁饮料的酸甜度较适宜，外观色泽也较好；当香蕉汁和胡萝卜汁的体积比继续变化时，复合果蔬汁饮料的酸度逐渐增加，又由于此时复合果蔬汁饮料酸甜比例不协调，也导致了感官评分开始减小。而随着原料的配比的减小，复合果蔬汁饮料中总糖含量也逐渐减少，乳酸菌生长所需营养减少，导致活菌数逐渐减少[23]。因此，选择最适香蕉汁和胡萝卜汁体积比为2∶1。
图1 不同香蕉汁与胡萝卜汁体积比对复合果蔬汁饮料感官评分和活菌数的影响
Fig.1 Effect of different volume ratio of banana juice and carrot juice on viable count and sensory evaluation of compound fruit and vegetable juice beverage
2.1.2 接种量的影响
由图2可知，当乳酸菌接种量从1%增大到5%时，复合果蔬汁饮料的感官评分和活菌数持续增加；并当接种量为5%时感官评分最高，为82分；而当接种量＞5%之后，感官评分逐渐缓慢的减小。当接种量为1%～7%时，活菌数随接种量增加而迅速增高；当接种量为7%～9%时，活菌数增加的较为缓慢。这可能是因为，当乳酸菌的接种量＜7%时，乳酸菌的初始数量较少，生长和繁殖的速度缓慢，导致其发酵能力有限，影响了果蔬汁的口感，导致感官评分较低；当接种量＞5%时，继续加大乳酸菌的接种量，使得乳酸菌的初始数目增加了，但因其生长繁殖消耗了太多的营养，使得最终活菌数数目增加不明显，同时，由于此时发酵产生的酸度较高，导致复合果蔬汁饮料口感不协调，感官评分降低[24-25]。因此，选择最适乳酸菌接种量为5%。
图2 不同接种量对复合果蔬汁饮料感官评分和活菌数的影响
Fig.2 Effect of different inoculum on viable count and sensory evaluation of compound fruit and vegetable juice beverage
2.1.3 发酵温度的影响
由图3可知，当发酵温度从27 ℃升高到33 ℃时，复合果蔬汁饮料的感官评分和活菌数都随之升高；当发酵温度为33 ℃时，复合果蔬汁饮料的感官评分和活菌数都达到最高，分别为82分；而当发酵温度高于33 ℃之后，复合果蔬汁饮料的感官评分和活菌数都呈现出快速减少的趋势。这是因为乳酸菌生长和发酵有最适宜的温度，当低于该温度时，乳酸菌生长受到抑制，发酵不足产酸量较低，导致感官评分减少。而当高于该温度时，乳酸菌生长缓慢或者不能继续生长，导致了活菌数和感官评分都降低[26-27]。因此，选择最适发酵温度为33 ℃。
图3 不同发酵温度对复合果蔬汁饮料感官评分和活菌数的影响
Fig.3 Effect of different fermentation temperature on viable count and sensory evaluation of compound fruit and vegetable juice beverage
2.1.4 发酵时间的影响
由图4可知，不同发酵时间对复合果蔬汁饮料感官评分的影响存在明显差异，随着发酵时间逐渐延长，复合果蔬汁饮料的感官评分先增加后减小，到48 h时最大。活菌数随着发酵时间的延长，36 h以前增长的很快，从36 h后增长的较为缓慢。复合果蔬汁饮料在发酵的过程中，由于发酵时间不足，造成酸度不够，使得产品风味还不够好；当发酵时间过长，乳酸菌发酵能力有限，不再继续产酸，同时时间延长后又会产生其他代谢产物和产生杂菌污染的问题，导致感官评分降低[28]。因此，选择最适发酵时间为48 h。
图4 不同发酵时间对复合果蔬汁饮料感官评分和活菌数的影响
Fig.4 Effect of different fermentation time on viable count and sensory evaluation of compound fruit and vegetable juice beverage
2.2.1 响应面设计及结果
在单因素试验基础上，采用Box-Behnken试验设计，以香蕉汁与胡萝卜汁体积比（A）、接种量（B）、发酵温度（C）和发酵时间（D）为自变量，感官评分（Y）为因变量进行响应面试验，Box-Behnken试验设计及结果见表3，方差分析结果见表4。
表3 Box-Behnken试验设计及结果
Table 3 Design and results of Box-Behnken experiments design
表4 回归模型的方差分析
Table 4 Variance analysis of regression model
续表
注：“*”表示对结果影响显著（P＜0.05）；“**”表示对结果影响极显著（P＜0.01）。
采用Design Expert 8.0.6软件对各个因素进行二次回归方程拟合，得到感官评分（Y）对试验结果的拟合方程为：
由表4可知，建立的模型是极显著的（P＜0.000 1），说明该模型预测结果有效。其中，一次项A、B、C、D和交互项CD，二次项A2、B2、C2、D2对结果影响是极显著的（P＜0.01），AB、AC、AD、BC和BD对结果影响不显著（P＞0.05）。方差分析结果表明，各因素对结果影响大小依次为：接种量＞香蕉汁与胡萝卜汁体积比＞发酵温度＞发酵时间。
2.2.2 响应面最佳配方的确定及验证试验
采用Design Expert 8.0.6软件对复合果蔬汁的4个影响因素进行交互分析，其响应面及等高线见图5。
由图5可知，各因素交互响应面图均为曲面且开口向下，这表明随着各个因素的增长，感官评分值先增大，增大到最大值后，各因素继续增大，感官评分将逐渐减小。
图5 各因素交互作用对感官评分影响的响应面和等高线
Fig.5 Response surface plots and contour lines of effects of interaction between each factor on sensory score
经Design Expert 8.0.6软件分析得到的复合果蔬汁最佳发酵工艺条件为：香蕉汁与胡萝卜汁体积比1.69∶1.00、菌种接种量4.41%、发酵温度32.10 ℃、发酵时间49.46 h，在此条件下复合果蔬汁的感官评分的预测值为84.64分。为了验证预测值的准确性和实际试验操作的方便，将发酵工艺条件修正为香蕉汁与胡萝卜汁体积比1.7∶1.0、发酵时间50.0 h、菌种添加量4.4%、发酵温度32.0 ℃。在此优化条件下进行3次平行试验，得出复合果蔬汁的感官评分实测值为85分，与预测值比较近，说明该模型可行性较高，可作为实际生产的依据。
利用最优发酵条件发酵的香蕉胡萝卜复合果蔬汁的品质指标见表5，体外抗氧化活性指标见表6。
表5 香蕉胡萝卜复合果蔬汁饮料理化指标测定结果
Table 5 Determination results of physicochemical indexes of banana and carrot compound fruit and vegetable juice beverage
表6 香蕉胡萝卜复合果蔬汁饮料抗氧化活性
Table 6 Antioxidant activity of banana and carrot compound fruit and vegetable juice beverage
由表5和表6的结果可知，优化条件下复合果蔬汁的pH值为3.29，可溶性固形物含量为12.00%，总酸含量为9.66 g/100 mL，还原糖含量为5.65 g/100 mL，香蕉胡萝卜复合果蔬汁饮料对DPPH·、ABTS+·、·OH的清除率分别为53.60%、77.00%、46.97%，结果表明复合果蔬汁饮料具有一定的抗氧化活性。
通过单因素和响应面优化试验分析得到香蕉胡萝卜复合果蔬汁饮料的最佳发酵条件为：香蕉汁与胡萝卜汁体积比1.7∶1.0、发酵时间50.0 h、菌种添加量4.4%、发酵温度32.0 ℃。在此优化工艺条件下，香蕉胡萝卜果蔬汁的感官评分为85分，活菌数为5.8×106 CFU/mL，发酵果蔬汁的pH值为3.29，可溶性固形物为12.00%，总酸为9.66 g/100 mL，还原糖为5.65 g/100 mL，复合果蔬汁饮料对DPPH·、ABTS+·、·OH的清除率分别为53.60%、77.00%、46.97%。该复合果蔬汁饮料色泽鲜艳、风味良好、澄清透明、口感协调，并且具有一定的抗氧化活性，试验结果为香蕉、胡萝卜的开发利用途径提供了参考依据。
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