Comparison of antioxidant and antibacterial activity of walnut green husk extracts by different solvents
我国核桃种植面积约667万hm2，产量365万t，位居世界第一，其种植面积和产量都占世界份额的40%以上[1]。核桃加工后会产生大量的核桃粕、核桃青皮、核桃壳等副产物[2]，其中仅核桃青皮据相关统计每年约会产生45万t，且只有少部分被农民作为家畜的青储饲料或肥料利用[3]，大部分的青皮资源被当作垃圾处理，着实是严重的资源浪费[4]。研究者发现，核桃青皮中含有多酚类、萘醌苷类、多糖类及色素类化合物等活性成分，这些化学成分具有消除自由基、抗肿瘤、抗癌、镇痛消炎、特别对果蔬采后致病真菌有较好的抑菌和杀菌作用[5-7]。已有不少研究表明，核桃青皮提取物兼具着色剂、抗氧化剂以及抑菌剂的三重作用[8-9]。
对核桃青皮活性物质的提取方法目前主要有超高压提取[10]、亚临界水提取[11]、碱提酸沉淀法提取[12]、有机溶剂萃取法[13]等。超高压与亚临界水提取设备投资成本高，操作工艺复杂，不适宜工业化生产；有机溶剂萃取法提取物中常含有微量的有机溶剂残留，会对人体或环境产生危害。本研究采用相对传统的碱提法与有机溶剂残留极少的醇提法进行方法比较，以体积分数70%的乙醇和0.15 mol/L的NaOH溶液为提取剂对比研究了核桃青皮中抗氧化生物活性物质变化和抑菌能力，以期提高核桃青皮的综合利用率。
7月中旬至8月初的青皮核桃（品种为温-185）：购买于新疆阿克苏红旗坡，50℃烘干（或自然晒干）后进行粉碎，过60目筛，晾干后粉末置于塑料密封袋中低温避光保存。1,1-二苯基-2-三硝基苯肼（1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl，DPPH）、2,2-联氮-二（3-乙基-苯并噻唑-6-磺酸）二铵盐（2,2-azinobis-（3-ethylbenzthiazoline-6-sulphonate），ABTS）：美国Sigma公司；2,6-二叔丁基对甲酚（butylated hydroxytoluene，BHT）：上海源叶生物科技有限公司；福林酚：北京索莱宝科技有限公司；马铃薯葡萄糖琼脂（potato dextrose agar，PDA）培养基：北京奥博星生物技术有限责任公司；其他实验试剂均为国产分析纯。
TU-1810PC紫外分光光度计：北京普析通用仪器有限责任公司；RE-85C旋转蒸发仪：上海青浦沪西仪器厂；TDL-5-A低速台式离心机：上海安亭科学仪器厂；MHP-250智能霉菌培养箱：上海鸿都电子科技有限公司；LDZX-50KBS立式压力蒸汽灭菌器：上海申安医疗器械厂；
1.3.1 核桃青皮色素粗提物的制备
提取方法参考李利华等[14-15]的方法，并做修改。以料液比为1∶40（g∶mL）添加10 g核桃青皮粉末物料分别和体积分数为70%的乙醇、0.15 mol/L浓度的NaOH溶液混合在500 mL三角瓶中，60℃水浴条件浸提1 h。冷却后4 500 r/min离心20 min，50℃旋蒸过滤液，得到核桃青皮提取物浸膏，置于棕色瓶中冰箱（-4℃）保存。
1.3.2 测定方法
DPPH·清除能力：按照参考文献[16]的方法测定；ABTS+·清除能力：按照参考文献[17]的方法测定；·OH清除率：按照参考文献[18]的方法测定；O2-·清除率：采用邻苯三酚自氧化法[19-20]；还原力：按照参考文献[21]的方法测定；总酚含量：核桃青皮提取物中的总酚含量参考文献[22]的Fohn-Ciocalteu法测定。
1.3.3 抑菌实验[23]
采用菌丝生长速率法：在无菌环境中将提前制备好的核桃青皮提取物用体积分数为50%的丙酮-无菌水溶液配制成质量浓度为100 mg/mL的溶液作为实验原液。待盛放培养基的三角瓶冷却至50℃左右，分别精确吸取3 mL、5 mL、10 mL的上述原液于97 mL、95 mL、90 mL PDA培养基中充分摇匀，趁热倒入已灭菌的培养皿中，制成原液浓度为3%、5%、10%的带药平板。用已灭菌的打孔器在链格孢霉的菌落边缘制备直径8 mm、厚度2 mm的菌饼，待平板冷却凝固后，将菌饼接在含不同体积浓度核桃青皮粗提物的培养皿中央，以无菌水为溶剂对照（CK），平行3次。所有平板在28℃恒温培养箱中培养，每隔24 h观察并用十字交叉法测量记录菌落生长情况。按以下公式计算抑菌率。
1.3.4 数据分析
运用Minitab16.0进行处理本次实验的相关数据信息，运用OriginPro 8.5进行本实验样本图表的制作。
图1 不同提取物浓度对DPPH·清除能力的影响
Fig．1 Effect of different extract concentrations on DPPH·scavenging ability
由图1可以看出，核桃青皮提取物的DPPH·清除能力随浓度的升高而呈现出快速升高的趋势，且这种增长趋势差异显著（P＜0.05），醇提法与碱提法均能有效的清除DPPH自由基，质量浓度在400～600μg/mL的范围时碱提法清除能力略弱于BHT，当质量浓度≥600μg/mL时，对DPPH·清除能力醇提＞碱提＞BHT。其清除率分别达到最大值73.13%、50.11%和42.50%。这说明较碱提法而言，醇提法得到的提取物中含有更多高活性的抗氧化成分，进而使机体内抗氧化酶的活性得到提高，阻止并降低自由基链式反应的形成和损害[24]。
图2 不同提取物浓度对ABTS+·清除能力的影响
Fig．2 Effect of different extract concentrations on ABTS+·scavenging ability
抗氧化剂的存在能够提供电子或氢原子使ABTS+·的产生受到抑制，使工作液颜色发生褪色，进而使其在波长734 nm处的吸光度值减小，也表明清除ABTS+·的能力越强[25]。由图2可以看出，在实验浓度范围内ABTS+·清除率随着核桃青皮提取物质量浓度增大呈现明显的量效关系，且这种关系差异显著（P＜0.05）。醇提明显高于碱提清除ABTS+·的能力，但均弱于阳性对照，当核桃青皮提取物质量浓度为500μg/mL时，两种提取方法的自由基清除率分别为65.89%和28.76%，醇提法得到的核桃青皮提取物清除ABTS+·的能力是碱提法的近2.3倍。充分表明核桃青皮醇提提取物具有更好的抗氧化能力。
图3 不同提取物浓度对·OH清除能力的影响
Fig.3 Effect of different extract concentrations on OH·scavenging ability
羟基自由基具有不配对电子而成为众多自由基中最活泼的但也是具有最大毒性的自由基，它可以快速与细胞中的任意生物分子发生化学反应造成一定氧化损伤，对生物体危害最大[26]。由图3可以看出，随着提取物质量浓度的增加，核桃青皮醇提和碱提提取物对·OH清除率均呈现上升趋势，且这种上升趋势差异显著（P＜0.05），醇提法相较于碱提法和BHT，其·OH消除能力较优，相互间差异显著（P＜0.05）。当质量浓度在200～800μg/mL时，BHT对·OH的清除能力的上升趋势略低于碱提提取物。醇提提取物质量浓度为1 mg/mL时，对·OH自由基清除率达到63.5%。表明醇提法得到的核桃青皮提取物具有作为新型抗氧化剂的潜质，且原料来源广泛，既物美价廉。
图4 不同提取物浓度对O2-·清除能力的影响
Fig.4 Effect of different extract concentrations on O 2-·scavenging ability
超氧阴离子自由基可与羟基自由基结合对生物体细胞内蛋白质、DNA等造成损伤，使机体功能下降[27-28]。利用邻苯三酚在弱碱环境发生自氧化生成有色产物和超氧阴离子自由基这一特性，检测物质清除超氧阴离子的能力。由图4可以看出，核桃青皮醇提、碱提提取物以及BHT对超氧阴离子自由基具有一定的清除能力，自由基的清除率随着核桃青皮提取物浓度的增加逐渐增强，且这种增长趋势差异显著（P＜0.05）。当质量浓度在为200～400μg/mL时，醇提与碱提所得到的核桃青皮提取物清除超氧阴离子的能力增长趋势较缓，此时无显著的差异（P＜0.05），当质量浓度在为＞400μg/mL时，醇提清除超氧阴离子的能力比碱提清除超氧阴离子的能力稍高，且上升趋势明显（P＜0.05）。总体上核桃青皮醇提、碱提提取物清除超氧阴离子的能力低于BHT。
图5 不同提取物浓度对还原力的影响
Fig.5 Effect of different extract concentrations on reducing power
物质的还原力是检测物质抗氧化活性的一个重要指标[29]。抗氧化物的存在能够将铁氰化钾还原为亚铁氰化钾，可在波长700 nm处检出体系溶液颜色的吸光度值，反映出体系中氧化还原状态的改变[30]。吸光度值越大，抗氧化效果越佳，还原能力越强。由图5可知，两种提取方式提取的核桃青皮提取物在一定质量浓度范围内其还原力随其质量浓度的增加而增强，其增势虽缓慢但与BHT的还原力相比，差异性显著（P＜0.05）。
如图6所示，以没食子酸作为标准品，测得的吸光度值与没食子酸的质量浓度之间表现出一定的线性关系，其回归方程式为：y=0.010 6x-0.003 8（R2=0.995 9），以Fohn-Ciocalteu为显色剂对醇提法和碱提法得到的核桃青皮提取物中的多酚含量进行测定，实验测定得出：醇提总酚含量36.77 mg/g，碱提总酚含量23.52 mg/g。结合本研究醇提与碱提方法得到的核桃青皮色素清除自由基的能力及还原力发现，醇提的总酚含量高于碱提，且清除自由基的能力以及还原力后者均不及前者。
图6 没食子酸标准曲线
Fig.6 Standard curve of gallic acid
由图7及表1可知，两种提取方式得到的核桃青皮色素对链格孢菌均有明显的抑制作用，菌落生长的直径随着核桃青皮色素体积浓度的减小而增大，当核桃青皮色素浓度在5%以上时，两种方式的提取物对链格孢菌的菌丝生长抑制率均能达到差异显著水平（P＜0.05）。当核桃青皮色素含量为10%时，两种方式提取得到的青皮色素对链格孢菌的抑制率分别为（90.89±1.96）%和（50.71±1.94）%，说明醇提法得到的青皮色素对链格孢菌的抑制效果明显高于碱提法。考虑是醇提法与碱提法得到的提取物因溶剂不同而抑菌成分不同且成分相对复杂，碱提不能很好的将核桃青皮中的抑菌成分浸提出来。
表1 两种方法提取的不同浓度核桃青皮色素对链格孢菌生长的抑制作用
Table 1 Antibacterial effects of different concentrations of walnut green husk pigment extracted by two kinds of methods on the growth of Alternaria
提取溶剂醇提碱提CK菌落直径/mm 抑制率/% 抑制率/%10%提取物菌落直径/mm 抑制率/%77.26 77.26 3%提取物菌落直径/mm 5%提取物菌落直径/mm 35.98 60.66 59.60±1.49 23.97±1.58 26.88 50.23 72.74±1.77 39.03±1.55 14.31 42.14 90.89±1.96 50.71±1.94
图7 两种方法提取的不同浓度核桃青皮色素对链格孢菌的抑制作用
Fig.7 Antibacterial effects of different concentrations of walnut green husk pigment extracted by two kinds of methods on Alternaria
本实验比较了醇提与碱提两种提取溶剂得到的核桃青皮提取物的抗氧化能力和抑菌能力。抗氧化实验以BHT为阳性对照，比较了醇提法和碱提法对DPPH·、ABTS+·、·OH、O2-·的清除能力以及还原能力，证明醇提法得到的核桃青皮色素粗提物清除自由基的能力优于后者，且醇提法测得的总酚含量较高，为36.77 mg/g；碱提法测得的总酚含量约是醇提法的64%。抑菌实验通过菌丝生长速率法证明两种浸提方法得到的核桃青皮色素粗提物对链格孢菌均有较强的抑制效果，醇提法抑菌能力远高于后者。当核桃青皮提取物含量为10%时，两种溶剂提取得到的青皮提取物对链格孢菌的抑制率分别为（90.89±1.96）%和（50.71±1.94）%。
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