表1 试验样品及其主要理化指标
Table1 Test samples and main physicochemical indexes
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Microbial diversity in Douchiba from Guizhou
豆豉属于中国传统发酵食品[1]，它是利用所含微生物（细菌和真菌）对豆类物质进行自然发酵而形成[2]。豆豉具有独特的风味和丰富的营养，深受中国和日本等亚洲国家广大的消费者喜爱[3]。中国古代药科全书记载豆豉还具有减缓疲劳、改善失眠和调节食欲等功效。近些年相关研究进展表明，豆豉中富含抗氧化性成分，比如包括血管紧缩素I转换酶抑制剂、α-葡萄糖酶抑制剂和溶栓酶等[4-5]。
目前，中国豆豉被分为3种主要类型，即毛霉型豆豉（永川豆豉）、细菌型豆豉（贵州黔西豆豉和八宝豆豉）和曲霉型豆豉（浏阳豆豉）[6]。豆豉的生产流程主要包括：①前处理；②前发酵（通过微生物固态发酵作用准备豆豉曲）；③后发酵（添加盐类物质及调味品混合成熟）[7]。贵州豆豉粑以毕节地区所产的豆豉粑为代表，在制作工艺和风味上具有地方特色。它的制作环节首先以大豆为原料，经过浸泡、蒸煮、自然接种制曲、培养、洗曲、混合辅料拌曲、装坛自然发酵和后熟等步骤形成出坛的制品即为豆豉，其次豆豉再经过日晒、捣碎、整型和卤水经日晒蒸发而成为最终的豆豉粑[8]，能够在常温条件下存放较长时间而且风味甚佳。
对于豆豉发酵的研究主要是利用传统可培养的方法分离和分析其中所含微生物的数量及种类。秦礼康等[9]应用传统培养方法研究陈窖豆豉粑中优势微生物菌群，结果表明，各个地方所含细菌和真菌菌群有所区别。目前，16SrDNA的聚合酶链反应（polymerasechainreaction，PCR）技术已经广泛应用于评估复杂环境中微生物多样性和动态变化规律[10-11]，PCR-变性梯度凝胶电泳（denaturing gradient gel electrophoresis，DGGE）分子指纹技术应用于评价发酵食品中微生物多样性和群落结构具有快速准确和灵敏度高等优势，包括被应用于发酵豆制品和发酵面团中微生物多样性研究[12-13]。
本研究应用PCR-DGGE技术对贵州不同产地生产的4种豆豉粑中细菌和真菌种群结构进行分析研究，明确其中优势菌群和共有的微生物种群。研究结果对规模化加工豆豉粑和传统作坊产品中的发酵微生物给予系统全面的对比认识，为特色豆豉粑的标准化加工提供科学的指导，有助于建立相关质量管理措施与安全控制标准。
1.1.1 试验样品来源及主要理化指标
样品：采集自贵州省大方县、黔西县和织金县传统工艺制作的豆豉粑成品，共4种样品（见表1），每100 g样品置于采样袋中，于-20℃条件下存放备用。
表1 试验样品及其主要理化指标
Table1 Test samples and main physicochemical indexes
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1.1.2 主要试剂
溶菌酶、丙烯酰胺、去离子甲酰胺、甲叉双丙烯酰胺、Tris-平衡酚、Tris-乙二胺四乙酸（Tris-ethylene diamine tetraacetic acid，TE）缓冲液（pH=8.0）：北京Solarbio公司；溴化乙锭（ethidium bromide，EB）：美国Sigma公司；PCR引物：上海捷瑞生物技术有限公司；GoTaqGreen Master Mix：美国Promega公司；2 000 bp DNA Marker与6×loading buffer：大连Takara有限公司；实验所用其他无机试剂、有机试剂（均为分析纯）：市售。
P型移液枪：法国Gilson公司；S1000TMThermalCycler PCR仪：美国Bio-Rad公司；DK-98-Ⅱ电热恒温水浴锅：天津市泰斯特仪器有限公司；Gel DocXR凝胶成像系统、Dcode TMuniversalMutationDetectionSystem电泳仪：美国Bio-Rad公司。
1.3.1 样品中总DNA的提取方法
样品中细菌总脱氧核糖核酸（deoxyribonucleic acid，DNA）提取方法参照文献[14-15]有所改动：取豆豉粑样品10 g置于250 mL三角瓶中，加入磷酸盐缓冲液（137 mmol/L NaCl，4.3 mmol/L NaH2PO4·7H2O，1.4 mmol/L KH2PO4，2.7 mmol/LKCl），然后用4层无菌纱布过滤收集滤液，置于2 mL离心管，10000×g离心6 min，收集沉淀，取上述沉淀加入300 μL溶菌酶（质量浓度50 mg/mL），置于37℃水浴1 h；后加入10%十二烷基硫酸钠（sodium dodecyl sulfate，SDS）200μL，置于60℃水浴20min；再加入5mol/LNaCl100 μL，同时加入十六烷基三甲基溴化铵（hexadecyl trimethyl ammonium bromide，CTAB）溶液600μL，置于65℃水浴15min（上下颠倒混匀10min）；将上述混合溶液12000×g离心6min，吸取上清液加入等体积的Tris-饱和酚∶氯仿∶异戊醇=25∶24∶1（V/V），12 000×g离心5 min；收集上清液转入新的离心管，加入等体积的氯仿∶异戊醇=24∶1（V/V），12000×g离心5min；收集上清液转入新的离心管，加入2倍体积分数为30%聚乙二醇和3mol/L1/10体积NaCl于4℃条件下沉淀3h；取出离心管于12000×g离心10min，倒掉上清液，用冰乙醇洗涤DNA两次，置于超净台无菌风干后转入聚合酶链式反应（PCR）管，加50 μL TE缓冲液于-20℃保存。
1.3.2 细菌PCR扩增
PCR扩增：用引物GC-338F和518R[16]PCR扩增细菌16S rDNA V3 区。PCR扩增体系[17]有所改动：2 μL DNA，引物（1μmol/L）各自2.5μL，GoTaqGreenMasterMix12.5μL，无菌去离子水5.5 μL，同时添加阴性对照（DNA模板换成dd H2O，其余成分不变）。PCR扩增程序：94℃预变性5min；94℃变性1 min，退火温度从68.5℃降至58.5℃，每个循环降低0.5℃，退火时间为3 s，72℃延伸1 min，20个循环；恒定退火温度下进行94℃变性1 min，58.5℃退火30 s，72℃延伸1 min，10个循环。PCR产物用1.5%琼脂糖凝胶电泳检测。
1.3.3 真菌PCR扩增
PCR扩增[18]：用引物GC-NS3和YM951r PCR扩增真菌18S rDNA。PCR扩增体系有所改动：2 μL DNA，引物（1 μmol/L）各自2.5 μL，GoTaqGreen Master Mix12.5 μL，无菌去离子水5.5 μL，同时添加阴性对照（DNA模板换成ddH2O，其余成分不变）。PCR扩增程序：95℃预变性5min；94℃变性1 min，退火温度从67℃降至57℃，每个循环降低0.5℃，退火时间为3 s，72℃延伸1 min，20个循环；恒定退火温度下进行94℃变性1 min，57℃退火30 s，72℃延伸1 min，10个循环。PCR产物用1.5%琼脂糖凝胶电泳检测。
1.3.4 DGGE凝胶电泳
采用电泳仪对样品中细菌16S rDNA V3区和真菌18S rDNA的扩增产物进行电泳。电泳条件为[19]：细菌按照8%聚丙烯酰胺凝胶，变性剂梯度为35%～65%（其中100%变性剂含有7 mol/L尿素和40%的甲酰胺）；真菌按照8%聚丙烯酰胺凝胶，变性剂梯度为25%～55%（其中100%变性剂含有7 mol/L尿素和40%的甲酰胺）；两者先在0.5×TAE缓冲液（TAE缓冲液是由三羟甲基氨基甲烷（Tris base）、乙酸（acetic acid）和乙二胺四乙酸（elhylene diamine tetraacetic acid，EDTA）组成）中200 V预电泳10 min，然后85 V恒电压16 h，EB染色后放入凝胶成像仪内拍照。
1.3.5 切胶验证与回收
（1）在无菌条件下，用干净的无菌手术刀切下DGGE胶上不同位置的主要条带，分别放入已标注好号的无菌离心管中，凝胶条带捣碎，加入20 μL无菌去离子水，4℃放置过夜。
（2）取2μL离心管中的上清液为模板DNA进行16SrDNA V3区和18S rDNA扩增（反应条件同1.3.2和1.3.3）。
（3）PCR产物经DGGE后证明与所切割条带位于相同迁移位置，再切胶回收，用不含GC夹的引物338F、518R和NS3、YM951r进行16S rDNA V3区和18S rDNA的扩增。
（4）将回收的PCR产物送至上海生物工程公司纯化并进行双向测序。
1.3.6 测序
通过DGGE图谱将归类的PCR产物送往上海生工进行测序，测序结果登录美国国家生物技术信息中心（national center of biotechnology information，NCBI），将所得序列与Genbank数据库的已知序列进行相似度比对，获取Genbank中的参考菌株序列号。
1.3.7 数据处理
通过Quantity one软件对DGGE图谱进行分析。群落多样性主要采用丰度（S）、Shannon-Wiener指数（H）和均匀度（Evenness e^H/S）来表示[20]。
（1）丰度（S）：用Quantity one软件中DGGE图谱中条带的个数来表示。
（2）Shannon-Wiene（rH）多样性指数：反映群落种类与均匀度的混合参数，即种类数目多，可增加多样性；同样，种类之间个体分配的均匀性增加也会使多样性提高，此数值计算应用Quantity one和Excel软件进行处理。
（3）均匀度（Evenness e^H/S）：首先取丰度的自然对数值，再用多样性指数除以该对数值即可。
同时通过非加权组平均法（unweightedpair-groupmethod witharithmetic means，UPGMA）聚类分析图（cluster analysis）分析所含微生物种类展示出样品之间的关系（DGGE图谱中各条带的位置和相对亮度等），主要使用Quantity one和MEGA5.0进行数据分析。
以总DNA产物为模板，采用降落式PCR程序进行细菌16S rDNA V3可变区的PCR扩增，经过1.5%琼脂糖电泳检测后，结果如图1所示。从图1中可以看出，所有样品均扩增出碱基长度约为230 bp的目的片段且阴性对照没有条带，满足后续DGGE试验对样品DNA质量要求。
图1 豆豉粑样品中细菌16S rDNA V3区PCR扩增产物电泳图
Fig.1 Electrophoresis of PCR amplification products of bacterial 16S rDNA V3 region of Douchiba samples
以总DNA产物为模板，采用降式PCR程序进行真菌18S rDNA的PCR扩增，经过1.5%琼脂糖电泳检测后，结果如图2所示。从图2中可以看出，所有样品均扩增出碱基长度约为390 bp的目的片段且阴性对照没有条带，满足后续DGGE试验对样品DNA质量要求。
图2 豆豉粑样品中真菌18S rDNA PCR扩增产物电泳图
Fig.2 Electrophoresis of PCR amplification products of fungal 18S rDNA of Douchiba samples
2.3.1 豆豉粑细菌多样性
4种豆豉粑样品中细菌基因组总DNA的DGGE图谱如图3所示。每一条泳道代表一种样品中细菌的DGGE指纹图谱，泳道中每一条亮带代表一种细菌，不同位置的条带代表不同物种，条带越亮代表相应种属的细菌相对丰度越高[21]。从图3可知，不同地区豆豉粑显示出不同的细菌群落结构组成，均有较高的多样性。DGGE试验总共检测到35条不同条带，其中样品DF主要有19个条带、样品DFQ主要有17个条带、样品ZJ主要有14个条带、样品QX主要有14个条带，说明贵州豆豉粑中细菌多样性较高。其中，样品DFQ和样品DF两者包括共有的条带为2、9、10、11、13、14、17、18、19和21，表明同一地区工厂规模化加工和传统作坊制作的豆豉粑微生物种群结构有差异，但是含有共同的细菌种群；样品DFQ和样品ZJ、QX比较看出，共有的条带较少（只有2和14），说明地理原因可能也占一定的因素，不同地区制作的豆豉粑产品中细菌组成差异较大，含有的相同种类细菌较少。4种豆豉粑细菌DGGE图谱中共同条带包含2和14；另外，条带17在3种豆豉粑（DF、DFQ和ZJ）中也同时出现。从图4可知，黔西豆豉粑（QX）和织金豆豉粑（ZJ）所含微生物（细菌）有较高的相似性，说明两个地区可能由于地理位置更接近，细菌种群亲缘关系也较接近；样品DFQ来自大方县某食品企业，由于工厂加工模式与传统作坊过程有所不同，显示出该样品与其他3种样品（DF、QX、ZJ）中细菌种群亲缘关系上相对较远。
图3 豆豉粑样品细菌16S rDNA V3可变区DGGE图谱
Fig.3 DGGE fingerprint of bacterial 16S rDNA V3 variable region of Douchiba samples
图4 4种豆豉粑细菌样品DGGE聚类分析图
Fig.4 DGGE cluster analysis chart of bacteria of four kinds of Douchiba
4种豆豉粑样品中细菌多样性指数统计结果见表2。
表2 细菌多样性指数统计
Table2 Statistics of bacterial diversity indexes
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通过表2得知，在4种豆豉粑中，细菌丰度值（S）为17～23，香农-威纳指数（H）值为2.818～3.100，且样品QX＞ZJ＞DFQ＞DF，表明黔西豆豉粑所含细菌微生物多样性最高；而以均匀度（Evenness e^H/S）来分析，大方豆豉粑显示出最高均匀指数值。
2.3.2 豆豉粑真菌多样性
利用DGGE技术对4种样品中真菌多样性进行研究，结果如图5所示。由图5可知，4种样品中共检测到33条不同条带；其中，样品DF主要有13个条带、样品DFQ主要有19个条带、样品ZJ主要有11个条带、样品QX主要有6个条带，说明贵州豆豉粑中的真菌多样性较高。样品DFQ和DF共有的条带为2、9、11、32和33，表明同一地区规模化工厂加工和传统作坊制作工艺均含有一些共同的优势真菌菌群；样品DFQ和样品ZJ、QX比较看出真菌种群结构差异较大，它们之间未有共有的条带，说明规模化工厂加工和传统作坊制作以及地理位置的远近等因素对豆豉粑中真菌微生物的种群组成影响较大。4种豆豉粑样品中没发现共同的真菌条带。从图6可知，黔西豆豉粑（QX）和织金豆豉粑（ZJ）所含真菌有较高的相似性，说明不同地方所制作的豆豉粑有着相似的真菌菌群，这可能是由于地理位置相邻或制作工艺相似形成的。
图5 豆豉粑样品真菌18S rDNA DGGE图谱
Fig.5 DGGE fingerprint of fungal 18S rDNA of Douchiba samples
图6 4种豆豉粑真菌样品DGGE聚类分析图
Fig.6 DGGE cluster analysis chart of fungal of four kinds of Douchiba
4种豆豉粑样品中真菌多样性指数统计结果见表3。
表3 真菌多样性指数统计
Table3 Statistics of fungal diversity indexes
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通过表3得知，在4种豆豉粑样品中，真菌丰度值（S）为11～17，香农-威纳指数（H）值为2.335～2.782，且DFQ＞DF＞QX＞ZJ，表明食品厂生产豆豉粑所含真菌种群多样性较高；以均匀度（Evenness e^H/S）分析可知，该食品厂生产豆豉粑也显示出最高均匀指数值，这可能由于该食品厂在长期加工豆豉粑过程中，环境微生物等得到了大量的积累，微生物种类及丰度较作坊生产更加稳定。
2.4.1 细菌DGGE图谱条带分析
将4种样品中的切胶条带（1～35）对应的PCR产物进行双向测序并拼接，将所得结果与GenBank中的已知序列进行相似性比对，结果见表4。
表4 豆豉粑样品中细菌条带测序结果
Table4 Sequencing results of bacterial bands of Douchiba samples
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续表
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4种豆豉粑样品中细菌DGGE指纹图谱条带及所代表细菌鉴定结果见图3和表4所示。4种样品都分离出了不同强度和数量的条带，说明每种豆豉粑样品中具有较丰富的细菌多样性。回收条带经DNA测序比对后，同源性均在95%～100%之间。由DGGE图谱显示，样品DF中最亮的条带是10、14、17、19和33，表明优势菌群为缓慢葡萄球菌（Staphylococcus lentus）、枯草芽孢杆菌①（Bacillus subtilis）、地衣芽孢杆菌（Bacillus licheniformis）、不可培养嗜盐四联球菌（unculturedTetragenococcussp.）和淀粉芽孢杆菌②（Bacillus thermoamylovorans）；样品DFQ中最亮的条带是9、10、11、14、15、17和28，表明优势菌群为不可培养菌③（uncultured bacterium）、缓慢葡萄球菌（Staphylococcus lentus）、科氏葡萄球菌亚种（Staphylococcus cohniisubsp.urealyticus）、枯草芽孢杆菌①（Bacillus subtilis）、不可培养菌④（uncultured bacterium）、地衣芽孢杆菌（Bacillus licheniformis）和枯草芽孢杆菌②（Bacillus subtilis）；样品ZJ中最亮的条带是11、14、26、29和30，表明优势菌群为科氏葡萄球菌亚种（Staphylococcuscohniisubsp.urealyticus）、枯草芽孢杆菌①（Bacillus subtilis）、不可培养菌⑥（uncultured bacterium）、坚强芽孢杆菌（Bacillus firmus）和解淀粉芽孢杆菌（Bacillus amyloliquefaciens）；样品QX中最亮的条带是18、20、22和30，表明优势菌群为嗜盐四联球菌（Tetragenococcus halophilus）、乳酸乳球菌（Lactococcus lactis）、淀粉芽孢杆菌①（Bacillus thermoamylovorans）和解淀粉芽孢杆菌（Bacillus amyloliquefaciens）。样品DFQ和DF两者共有最亮条带：10、14和17，即：缓慢葡萄球菌（Staphylococcus lentus）、枯草芽孢杆菌①（Bacillus subtilis）和地衣芽孢杆菌（Bacillus licheniformis）为它们共有细菌；样品DFQ和样品ZJ、QX比较看出虽有共有的条带（2和14），但是不属于3种豆豉粑中的优势菌群。在4种豆豉粑细菌DGGE图谱中共同条带为2和14，即为不可培养菌①（uncultured bacterium）和枯草芽孢杆菌①（Bacillus subtilis）。由4种豆豉粑细菌DGGE图谱可知：虽然每种豆豉粑中的细菌群落多样性有差异，但是优势菌群主要以芽孢杆菌为主，且其中条带17（地衣芽孢杆菌（Bacillus licheniformis））同时出现在3种豆豉粑（DF、DFQ和ZJ）中。经分析发现，4种豆豉粑中共有的优势菌群为枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）和地衣芽孢杆菌（Bacillus licheniformis）。工厂规模加工产品（DFQ）与传统作坊加工产品（DF、ZJ和QX）中都是以芽孢杆菌属类为主要优势菌群。
2.4.2 真菌DGGE图谱条带分析
表5 豆粑样品真菌条带测序结果
Table5 Sequencing results of fungal bands of Douchiba samples
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4种豆豉粑样品中真菌DGGE指纹图谱条带及所代表真菌鉴定结果见图5和表5所示，4种样品都分离出了不同强度和数量的条带，说明每种样品具有较丰富的真菌种群多样性。回收真菌条带经DNA测序比对后，同源性为94%～100%；由DGGE图谱可知，样品DF中最亮的条带是9、19、21和32，表明优势菌群为曲霉（Aspergillussp.）A1bC-4、真菌属（Fungalsp.）J270、支孢样支孢霉（Cladosporium cladosporioides）和出芽短梗霉菌（Aureobasidium pullulans）；样品DFQ中最亮的条带是3、6、9、24、25和29，表明优势菌群为扣囊复膜孢酵母（Saccharomycopsisfibuligera）、班图酒香酵母（Brettanomycescustersianus）、曲霉（Aspergillus sp.）A1bC-4、不可培养伞菌（uncultured Agaricales）、库德里阿兹氏毕赤酵母（Pichia kudriavzevii）和不可培养真菌（uncultured fungus）；样品ZJ中最亮的条带是6、7、11、15、20、27和31，表明优势菌群为班图酒香酵母（Brettanomyces custersianus）、沙门柏干酪青霉（Penicillium camemberti）、不可培养曲霉（uncultured Aspergillus）、不可培养酵母菌（uncultured Saccharomycete）、不可培养真菌（uncultured fungus）、粉状毕赤酵母（Pichia farinose）和不可培养真菌（unculturedfungus）；样品QX中最亮的条带是8、14、18和28，表明优势菌群为汉逊德巴利酵母（Debaryomyces hanseni）、毕赤酵母（Pichia deserticola）、隐球酵母属（Cryptococcus sp.）CFL-2008a和掷孢酵母（Bullerasp.）VY-120，样品DFQ和DF两者包括共有最亮条带为9，即曲霉（Aspergillussp.）A1bC-4；样品DFQ和ZJ、QX比较未找到共有条带，表明4个豆豉粑样品中无共有的真菌。
本研究表明，贵州4种豆豉粑所包含细菌多样性较高，虽然每种豆豉粑中的细菌群落多样性有差异，但是优势菌群主要以芽孢杆菌为主。包括：热噬淀粉芽孢杆菌（Bacillus thermoamylovorans）、短小芽孢杆菌（Bacillus pumilus）、枯草芽孢杆菌①（Bacillus subtilis）、地衣芽孢杆菌（Bacillus licheniformis）、淀粉芽孢杆菌①（Bacillus thermoamylovo rans）、高地芽孢杆菌（Bacillus altitudinis）、蜡样芽孢杆菌（Bacillus cereus）、坚强芽孢杆菌（Bacillus firmus）和解淀粉芽孢杆菌（Bacillus amyloliquefaciens）。芽孢杆菌在豆类食品发酵过程中起到分泌微生物抑制剂和纤维蛋白溶酶原的作用[22]。在4种豆豉粑细菌DGGE图谱中共同条带为2和14，即为不可培养菌①（unculturedbacterium）和枯草芽孢杆菌①（Bacillus subtilis）。另外地衣芽孢杆菌（Bacillus licheniformis）在其中所占比例较大。研究结果与以往的研究报道有相似之处。李洋[23]研究表明，细菌性豆豉中主要发酵微生物包括芽孢杆菌、微球菌和乳酸菌等。秦礼康等[9]对陈窖豆豉粑菌群鉴定为蜂房芽孢杆菌（Bacillusalvei）、泛酸芽孢杆菌（Bacillus pantothenticus）、坚强芽孢杆菌（Bacillus firmus）等优势菌群，为细菌发酵型产品。JEYARAM K等[8]研究表明，细菌性豆豉的主要发酵微生物是蜡状芽孢杆菌和枯草芽孢杆菌，并含有少量葡萄球菌。贾东旭等[24]在贵州10个细菌型豆豉样品中分离出枯草芽孢杆菌。研究表明在豆豉的发酵过程中，枯草芽孢杆菌可以提高各种酶类（淀粉酶、脂肪酶、蛋白酶和谷氨酰胺酶）的产量，使大分子物质（脂肪、蛋白质、碳水化合物和黄酮甙类）分解转化为小分子物质（有机酸、氨基酸和糖苷配基），为豆豉的风味物质、功能成分和营养价值等做出贡献[25]。
从细菌DGGE图谱分析得到牛粪乳杆菌（Lactobacillus vaccinostercus）、嗜盐四联球菌（Tetragenococcus halophilus）和不可培养嗜盐四联球菌（unculturedTetragenococcussp.），可能与传统豆豉粑的制作工艺有关系，盐和酸有助于产品保藏。其他研究报道一些发酵豆制品中也检测到乳杆菌属和嗜盐四联球茵，可能与这些地区的发酵豆制品含盐量较高有关[26]。另外，通过DGGE方法还检测到一些葡萄球菌属（Staphylococcus），诸如缓慢葡萄球菌（Staphylococcus lentus）、科氏葡萄球菌亚种（Staphylococcus cohniisubsp.urealyticus）和小牛葡萄球菌（Staphylococcus vitulinus），且其中有些细菌为样品中的优势菌群，这些细菌的存在也和样品的制作环境及工艺有关。葡萄球菌属（Staphylococcus sp.）对食品发酵有一定作用，类似研究也有报道，例如鸡葡萄球菌（Staphylococcus gallinarum）在豆豉的发酵过程中具有抗菌活性和水解蛋白质的能力[12]。同时金黄色葡萄球菌（Staphylococcus equorum）、肠杆菌科（Enterobacteriaceae）和弗氏柠檬酸杆菌（Citrobacter freundii）致病菌也被检测到，说明传统方法制作豆豉粑产品亦存在潜在的安全问题，相似研究结果已有报道[27]，李晓然等[28]选择云南豆豉为研究对象，在豆豉中发现了属于人类致病菌弗氏志贺菌（Shigellaflexneri）和植物病原菌桃色欧文氏菌（Erwiniapersicina）的序列，显示出不同地区传统方法制作的豆豉中都存在着食品安全隐患，应加强传统工艺标准化生产的研究和质量管理。
本研究在4种豆豉粑中检测到酵母菌属和霉菌属等真菌。酵母属优势菌群包括扣囊复膜孢酵母（Saccharomycopsisfibuligera）、班图酒香酵母（Brettanomyces custersianus）、库德里阿兹氏毕赤酵母（Pichia kudriavzevii）、粉状毕赤酵母（Pichia farinose）和汉逊德巴利酵母（Debaryomyces hanseni），霉菌属有曲霉A1bC-4和沙门柏干酪青霉（Penicillium camemberti）。其中酵母属（粉状毕赤酵母（Pichia farinose）和汉逊德巴利酵母（Debaryomyces hanseni））存在于豆豉后发酵阶段[29]。汉逊德巴利酵母（Debaryomyces hansenii）主要作用是消耗糖类物质，这可能与贵州豆豉粑酱香风味的形成有关；粉状毕赤氏酵母（Pichia farinosa）大多存在于发酵可可豆、传统酵母、日本清曲酒和米酒中，这些酵母在豆豉粑的制作过程中亦有可能发挥重要的作用[30]。KIM T等[31]研究豆豉发酵阶段，曲霉属通过分泌淀粉酶和蛋白酶分解淀粉和蛋白质为多肽和氨基酸，被酵母菌吸收利用。秦礼康等[9]对陈窖豆豉耙优势菌群进行鉴定，结果表明大方陈窖豆豉耙则是爪哇毛霉（M.javanicusWehemer）、总状毛霉（M.racemosusFres）、鲁氏毛霉（M.rouxians（calmette）Wehmer），同时两地产品的后期陈窖阶段发现异常汉逊酵母（Hansenula anomala），本研究与上述传统分离方法相比，利用分子方法发掘更多种类的真菌属，还有部分不可培养真菌属，为贵州豆豉粑的传统工艺加工与提升提供理论认识。
本研究通过PCR-DGGE技术在4种贵州传统豆豉粑中鉴定主要的优势细菌以芽孢杆菌为主，共有的种群包含枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）和地衣芽孢杆菌（Bacillus licheniformis）；主要的真菌菌群包含酵母菌属（扣囊复膜孢酵母（Saccharomycopsis fibuligera）、班图酒香酵母（Bret tanomyces custersianus）、库德里阿兹氏毕赤酵母（Pichia kudriavzevii）、粉状毕赤酵母（Pichia farinose）和汉逊德巴利酵母（Debaryomyces hanseni））和霉菌属（曲霉A1bC-4和沙门柏干酪青霉（Penicillium camemberti）），没有发现共有的真菌菌群。研究表明，贵州豆豉粑中微生物多样性较高，其微生物种群亲缘关系受不同产地影响差异较大，同一地区规模化生产与传统加工豆豉粑微生物相似性较近。研究结果为探索特色豆豉粑的标准化加工及其质量安全控制提供参考。
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