桑葚（Morus alba L.），也被称为桑葚果、桑实和桑枣，是桑科桑属多年生木本植物桑树的果实，主要产于四川和湖南两省，是一种药食两用的水果[1-3]。研究表明，桑葚不仅含有丰富的碳水化合物、17种氨基酸、7种维生素和矿物质，还能调节人体的免疫功能，促进造血细胞的生长，具有抗突变、抗衰老、降低血糖水平和降低血脂等保健作用[4-7]。桑葚鲜果在自然环境下极易腐败，采摘期和贮存周期都非常短，因此桑葚的深加工显得极其重要，酿造桑葚酒不仅极大地保留桑葚本身的营养成分，增加桑葚附加值，还可以推动三产融合，促进桑农收入。
果酒酿造过程中，酵母菌直接影响果酒风味和酒精度。普通酿酒酵母发酵的桑葚酒常出现口感粗糙、香味寡淡等问题。随着研究深入，非酿酒酵母在果酒酿造中的作用逐渐受到重视，如能够合成乙酸丁酯、乙酸异戊酯等挥发性物质，而且酶系丰富，能产生大量果胶酶和葡萄糖苷酶等，在塑造酒体香气和提高酒体复杂性方面具有积极作用[8-10]。扣囊覆膜酵母（Saccharomycopsis fibuligera）是一株从中高温大曲中分离出来的酵母，由于其产香能力较强，出酒率较高，正被运用于多种酒的酿造[11]。王乃军等[12]研究发现，扣囊覆膜酵母酶系丰富，产酯、产酸、产醇等风味物质能力较强，能增强白酒细腻感，提升白酒品质。YANG Y等[13]研究发现，将扣囊覆膜酵母和其他非酿酒酵母用于发酵甜米酒，会增加甜米酒中的己酸乙酯、丁酸乙酯等酯类和一些醇类、酮类物质，产生令人愉悦的香气。目前，扣囊覆膜酵母发酵桑葚的研究还鲜见报道。
本研究以桑葚为原料，扣囊覆膜酵母为发酵菌株制备桑葚酒，通过单因素试验及响应面法优化其发酵工艺条件，对其理化、微生物指标及挥发性风味物质进行分析，以期为扣囊覆膜酵母发酵桑葚酒提供理论参考，同时拓宽桑葚的加工形式，降低丰产后的滞销问题。
1 材料与方法
1.1 材料与试剂
1.1.1 原料与菌株
桑葚（无核大十）：宜宾市长宁县；扣囊覆膜酵母（Saccharomycopsis fibuligera）：四川轻化工大学生物工程学院实验室；安琪酿酒酵母SY：安琪酵母股份有限公司。
1.1.2 试剂
葡萄糖（分析纯）：成都市科龙化工试剂厂；五水硫酸铜、酒石酸钾钠、亚铁氰化钾（均为分析纯）：重庆川东化工试剂厂。
1.1.3 培养基
酵母浸出粉胨葡萄糖（yeast extract peptone dextrose，YPD）固体培养基：青岛高科技工业园海博生物技术有限公司。
1.2 仪器与设备
PHSJ-3F型pH计：上海精密科学仪器有限公司；WZ101型手持糖度计：海南博汉森科技开发有限公司；890N-5975B型气相色谱-质谱（gas chromatography-mass spectrometer，GC-MS）联用仪：美国Agilent科技有限公司。
1.3 试验方法
1.3.1 桑葚酒加工工艺流程及操作要点
桑葚→打浆→调整成分→接种活化酵母→发酵→灭菌→倒罐→陈酿→过滤、澄清→桑葚酒
操作要点：
预处理：清洗鲜桑葚表面的灰尘、泥土，沥干后于打浆机中低速打浆。
调整成分：偏重亚硫酸钾的使用量为60 mg/L，将糖度调整为18°Bx，用柠檬酸调节pH至3.5～4.5。
扣囊覆膜酵母的活化：将扣囊覆膜酵母划线接种到YPD固体培养基，在26 ℃条件下培养20 h。挑取单菌落接种到YPD液体培养基中，在26 ℃、150 r/min条件下培养20 h。将所得菌液于4 ℃、3 000 r/min的条件下离心10 min，弃掉上清液，将菌体重悬后再次离心取沉淀。
接种与发酵：发酵罐的装液量为175 mL/250 mL，扣囊覆膜酵母接种量为2%，在28 ℃的条件下发酵12 d左右，测其酒精度不再变化时，终止发酵。
灭菌：将发酵结束的发酵液取出，采用7层纱布进行粗滤，然后放入65～85 ℃恒温水浴锅灭菌30 min。
倒罐与陈酿：陈酿期间每隔24 h倒罐一次，10 ℃条件下避光陈酿30 d。
过滤、澄清：选用自然澄清法，将果酒放在一个密封的容器中，放置10 d，待果酒中的悬浮物慢慢沉淀后，将上清液转移到一个新的容器中，得到清澈透明的桑葚酒成品。
1.3.3 桑葚酒发酵工艺优化单因素试验
本次试验采用单因素轮换法，依次考察酵母接种量（1%、2%、3%、4%、5%）、桑葚与水料液比（100∶0、85∶15、70∶30、55∶45、40∶60（g∶mL））和发酵温度（22 ℃、24 ℃、26 ℃、28 ℃、30 ℃）对桑葚酒酒精度及感官品质的影响。
1.3.4 桑葚酒发酵工艺优化响应面试验
以单因素试验的结果为依据，以桑葚酒酒精度（Y）为响应值，选择影响显著的因素发酵温度（A）、酵母接种量（B）和料液比（C）为自变量进行响应面试验，对其发酵工艺进行优化，响应面试验设计因素与水平见表1。
表1 桑葚酒发酵工艺优化响应面试验设计因素与水平
Table 1 Factors and levels of response surface tests for fermentation process optimization of mulberry wine
因素A 发酵温度/℃B 酵母接种量/%C 料液比（g∶mL）-1水平0 1 24 1 55∶45 26 2 70∶30 28 3 85∶15
1.3.5 分析检测
还原糖、总酸、总酯含量的测定：参照GB/T15038—2006《葡萄酒、果酒通用分析方法》；酒精度的测定：参照GB 5009.225—2016《食品安全国家标准酒中乙醇浓度的测定》；可溶性固形物含量的测定：参照GB/T 12143—008《饮料通用分析方法》；pH的测定：参照HJ 1147—2020《水质pH值的测定电极法》；花青素含量的测定：参照DB12T885—2019《植物提取物中原花青素的测定紫外-可见分光光度法》。微生物菌落总数、大肠杆菌、致病菌的测定：参照NYT 1508—2017《绿色食品果酒》。
1.3.6 挥发性风味物质的测定
挥发性风味物质的测定参照许强等[14]方法并加以修改，具体如下。
预处理：萃取头在气相色谱-质谱联用（GC-MS）仪进样口活化25 min，用精密注射器从样品瓶中部抽取2.5 mL桑葚酒注入加有磁力搅拌子的密封顶空瓶中，再加入3 g NaCl，采用恒温磁力搅拌器调节水浴控制酒样温度，将活化好的萃取头插入顶空瓶进行顶空萃取5 min，达到萃取时间后抽出萃取头，插入气相色谱仪进样口进行解吸。
气相色谱条件：载气为高纯氦气（He），流速1.00mL/min；进样方式为无分流手动进样；进样口温度250 ℃；初始温度40 ℃保持3 min，再以5 ℃/min程序升温至230 ℃，保持10 min。
质谱条件：电子电离（electronic ionization，El）源；电子能量70 eV；传输线温度250 ℃；离子源温度230 ℃；四级杆温度150 ℃；扫描范围20～550 amu。
定性定量方法：根据全扫图中母离子信息，利用美国国家标准与技术研究院（national institute of standards and technology，NIST）MS Search2.3数据库做物质鉴定，对检测出得各组分定性分析，并用峰面积归一化法计算各挥发性风味成分相对含量。
1.3.7 感官评价
由10位经过感官培训的人员组成评审小组，从色泽、香气、滋味及典型性方面对桑葚酒进行感官评价[14]，满分为100分，桑葚酒感官评价标准见表2。
表2 桑葚酒感官评价标准
Table 2 Sensory evaluation standards of mulberry wine
项目 感官评价 得分/分色泽（20分）香气（30分）滋味（30分）典型性（20分）黄褐色，有悬浮物，无光泽浅红，澄清，不透明，无夹杂物，光泽暗淡深玫瑰红，澄清，透明，光泽较暗宝石红，深红色，澄清，透明，悦目协调，有光泽气味不良，使人厌恶果香、酒香较淡，无不良气味果香、酒香较浓郁和谐果香、酒香浓郁纯正，香气协调酸涩，苦，平淡，有异味酸度适中，酒体较丰满，甜度自然，回味单一爽口，舒适，酒质较柔顺，回味较好酒体丰满，醇厚协调，柔细轻快，回味绵长基本无典型性略带桑葚酒特有风味，典型性不明显有桑葚酒特有风味，典型明确，风格和谐良好独具桑葚酒风味，典型性完美，优雅无缺0～5 6～10 11～15 16～20 0～7 8～15 16～22 23～30 0～7 8～15 16～22 23～30 0～5 6～10 11～15 16～20
2 结果与分析
2.1 发酵工艺优化单因素试验
2.1.1 酵母接种量的确定
由图1可知，酵母接种量为1%～2%时，桑葚酒感官评分和酒精度均逐渐增加；酵母接种量为2%时，桑葚酒感官评分和酒精度均为最高，分别为83分和7.9%vol；当酵母接种量＞2%时，桑葚酒感官评分和酒精度均逐渐下降。其原因可能是，酵母接种量较低时，发酵速度缓慢，前发酵时间长，导致酒精度较低，影响风味口感；接种量较高时，酵母过多导致发酵速度过快、中心温度过高，产酒率随之下降，同时酵母菌的细胞壁吸附作用会导致花色素含量降低，酒体色泽不稳定，并且发酵结束后，酒体酵母味大，影响口感风味和营养物质[15]。综合考虑，确定酵母接种量为2%。
图1 酵母接种量对桑葚酒酒精度和感官评分的影响
Fig.1 Effect of yeast inoculum on alcohol content and sensory score of mulberry wine
2.1.2 料液比的确定
由图2可知，料液比为40∶60、55∶45、70∶30（g∶mL）时，桑葚酒酒精度和感官评分均逐渐增加；料液比为70∶30（g∶mL）时，桑葚酒酒精度和感官评分均为最高，分别为8.3%vol和86分；料液比为70∶30、85∶15、100∶0（g∶mL）时，桑葚酒酒精度和感官评分均逐渐下降。料液比的大小会影响酒体香气和口味的协调性，当料液比过低时，桑葚原汁较少导致酒体果香较弱，桑葚酒典型性差；当料液比过高时，桑葚原汁较多，酒体相对粘稠，酸感较突出，感官评分较低。综合考虑，确定最佳料液比为70∶30（g∶mL）。
图2 料液比对桑葚酒酒精度和感官评分的影响
Fig.2 Effects of material to liquid ratio on alcohol content and sensory score of mulberry wine
2.1.3 发酵温度的确定
由图3可知，随着发酵温度在22～24 ℃范围内的增加，感官评分逐渐增加；当发酵温度为24 ℃时，感官评分达到最大值，为87分；发酵温度＞24 ℃时，感官评分逐渐下降。随着发酵温度在22～26 ℃范围内的增加，酒精度逐渐增加；当发酵温度为26 ℃时，酒精度达到最大值，为8.57%vol；发酵温度＞26 ℃时，酒精度逐渐下降。发酵温度过低时，不仅易染杂菌，而且酵母活性较低，生长繁殖速度缓慢，导致发酵不充分，因此桑葚酒酒精度偏低和风味口感较差；当温度较高时，抑制微生物代谢能力的同时，也会使果酒中的花色苷降解，导致酒体酒精度不高、色泽不稳定、口感和成分被破坏[16-18]。综合考虑，确定最佳发酵温度为26 ℃。
图3 发酵温度对桑葚酒酒精度和感官评分的影响
Fig.3 Effect of fermentation temperature on alcohol content and sensory score of mulberry wine
2.2 桑葚酒发酵工艺优化响应面试验
2.2.1 响应面试验方案及结果
在单因素试验结果的基础上，以发酵温度（A）、酵母接种量（B）、料液比（C）为自变量，以酒精度（Y）为响应值进行3因素3水平的响应面试验设计，响应面试验设计及结果见表3，方差分析见表4。
表3 桑葚酒发酵工艺优化响应面试验设计及结果
Table 3 Design and results of response surface tests for fermentation process optimization of mulberry wine
试验号 A 发酵温度/℃B 酵母接种量/%C 料液比（g∶mL）酒精度/%vol 1 2 3 4 5 6 7 8 9 1 0 11 12 13 14 15 16 17 24 26 26 24 26 26 28 26 24 26 26 26 28 26 24 28 28 2 1 2 2 2 2 2 2 1 2 3 3 3 1 3 1 2 85∶15 85∶15 70∶30 55∶45 70∶30 70∶30 55∶45 70∶30 70∶30 70∶30 85∶15 55∶45 70∶30 55∶45 70∶30 70∶30 85∶15 7.7 8.2 8.6 7.7 8.7 8.5 7.4 8.4 7.9 8.6 8.2 7.3 7.5 7.7 7.8 7.8 8.2
表4 回归模型方差分析
Table 4 Variance analysis of regression model
注：“*”代表对结果影响显著（P＜0.05）；“**”代表对结果影响极显著
（P＜0.01）。
方差来源 自由度 平方和 均方 F 值 P 值 显著性模型**ABCA B**AC BC A2 B2 C2残差失拟项纯误差总差3.06 0.005 0 0.080 0 0.605 0 0.010 0 0.160 0 0.040 0 0.871 7 0.530 6 0.530 6 0.142 0 0.090 0 0.052 0 3.20 91111111117341 6 0.339 5 0.005 0 0.080 0 0.605 0 0.010 0 0.160 0 0.040 0 0.871 7 0.530 6 0.530 6 0.020 3 0.030 0 0.013 0 16.74 0.246 5 3.94 29.82 0.493 0 7.89 1.97 42.97 26.16 26.16 0.000 6 0.634 8 0.087 4 0.000 9 0.505 3 0.026 2 0.203 0 0.000 3 0.001 4 0.001 4*******2.31 0.218 3
采用Design Expert 13.0软件对表3中的数据进行回归拟合分析，得到3个因素与酒精度（Y）之间的回归方程：
由表4可知，用响应面法建立的二次回归模型极显著（P＜0.01），失拟项不显著（P＞0.05），即所构建的模型与试验的差异较小，说明其他因素对模型的干扰程度低[19-20]，决定系数R2为0.955 6，调整决定系数R2adj为0.898 5，说明89.85%的试验数据的变异型可用此回归模型解释，由表4亦可知，一次项C及二次项A2、B2、C 2对结果影响极显著（P＜0.01），交互项AC对结果影响显著（P＜0.05），其他项对结果影响不显著（P＞0.05）。由F值可知，3个因素对桑葚酒酒精度影响顺序：料液比（C）＞酵母接种量（B）＞发酵温度（A）。
2.2.2 各因素间交互作用对酒精度的影响
响应曲面越平缓说明该试验中的某一因素对酒精度的影响越小，等高线近似于一个圆球面，那么就表示这两个因素的交互作用越弱[21-22]。采用Design Expert 13.0软件绘制各因素间交互作用对桑葚酒酒精度影响的响应曲面及等高线见图4。由图4可知，在该模型中，AC的等高线呈现明显的椭圆形，说明AC交互作用显著（P＜0.05），而AB、和BC响应曲面较为平坦，并且等高线未呈现明显的椭圆形，说明其有一定的交互作用，但交互作用不显著（P＞0.05），这与方差分析结果一致。
图4 各因素间交互作用对桑葚酒酒精度影响的响应曲面及等高线
Fig.4 Response surface plots and contour lines of effects of interaction between various factors on the alcohol content of mulberry wine
采用Design Expert 13.0软件对多元回归方程预测，得到最优桑葚酒发酵工艺为发酵温度为26.1 ℃、酵母接种量为1.9%、料液比为75∶25（g∶mL），在此条件下，桑葚酒酒精度的理论值为8.62%vol，为方便实际操作，将发酵工艺条件修正为发酵温度26 ℃、酵母接种量2%、料液比为75∶25（g∶mL）。为了检验响应面法优化工艺的可行性，在最佳发酵条件下进行了3次试验，测得平均酒精度实际值为8.72%vol，感官评分为90分。与理论值相差不大，证明了响应面法得到的模型参数的准确性和可靠性，可真实反映不同因素对桑葚酒发酵的影响。
2.3 桑葚酒的理化及微生物指标检测结果
桑葚酒的理化及微生物指标检测结果见表5。由表5可知，扣囊覆膜酵母发酵的桑葚酒各项理化及微生物指标均符合行业标准NYT 1508—2017《绿色食品果酒》的要求。
表5 桑葚酒的理化及微生物指标的检测结果
Table 5 Determination results of physicochemical and microbiological indexes of mulberry wine
检测项目 NY/T 1508—2017 扣囊覆膜酵母发酵桑葚酒花青素/（mg·mL-1）可溶性固形物/%酒精度/%vol还原糖/（g·L-1）总酸（以酒石酸计）/（g·L-1）总酯（以乙酸乙酯计）/（g·L-1）--7～18≤4.0 4.0～9.0-3.1 5.0 8.72 3.9 4.8 5.7
花青素是桑葚中重要的营养成分，属于黄酮类化合物，基本结构是2-苯基苯并呋喃，具有预防心脑血管疾病，保护肝脏和抗癌等多种生理功能[23-25]。扣囊覆膜酵母桑葚酒在最佳发酵工艺条件下测得花青素含量高达3.1 mg/mL，分析原因可能是因为酵母种类不同所导致的，非酿酒酵母中胶酶、葡萄糖苷酶等分泌较多，从而发酵出来的桑葚酒花青素含量增加[26]。除花青素外，还原糖、总酯和多糖也高于商品酵母发酵的桑葚酒。
综上所述，扣囊覆膜酵母发酵桑葚酒的感官评分和酒体品质均高于安琪酵母发酵桑葚酒。
2.4 桑葚酒挥发性风味成分分析
将最优工艺条件下扣囊覆膜酵母发酵的桑葚酒与安琪酵母发酵的桑葚酒进行挥发性成分对比，结果见表6。
表6 桑葚酒主要挥发性成分测定结果
Table 6 Determination results of main volatile components in mulberry wine
注：“-”表示未检出。
编号 种类 化合物相对含量/%扣囊覆膜酵母发酵的桑葚酒安琪酵母发酵的桑葚酒1234567891 0 47.00 6.58-- - -酯类1.77 5.02-0.80 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 22.42 18.63 4.39 3.97 4.25 0.89 1.11 3.72 1.93 1.18 2.06 1.53--丁酸丁酯乙酸乙酯乙酸丁酯十八酸乙酯乙酸异戊酯乙酸苯乙酯正己酸乙酯辛酸乙酯乙酸苯甲酯丁酸乙酯癸酸乙酯壬酸乙酯乙酸乙烯酯丁二酸二乙酯丁酸异丁酯异丁醇异戊醇苯乙醇2,3-丁二醇乙酸3-甲基戊酸异戊酸异辛酸苯甲醛乙醛壬醛癸醛2（5H）-噻吩-- -醇类1.30 1.83 6.05 3.49 14.29 4.85 2.25 2.42酸类醛类-- - - - - -酮类4.61 3.83 15.67 2.30 1.63 1.93 0.16 1.10 0.93 0.20 0.74 0.82-2.37
由表6可知，扣囊覆膜酵母发酵桑葚酒中共检测出24种挥发性风味物质，其中酯类12种，醇类4种，酸类4种，醛类4种，而安琪酵母发酵桑葚酒仅检测出14种挥发性风味物质，其中，酯类8种，醇类4种，酸类1种，酮类1种。在两种酵母发酵的桑葚酒中，扣囊覆膜酵母发酵桑葚酒的酯类物质种类较多，扣囊覆膜酵母发酵对乙酸乙酯、乙酸丁酯、乙酸异戊酯等酯类物质含量的提升较为明显，增加了桑葚酒中的草莓香、含羞草香等，使得桑葚酒更加厚重[27]。两种酵母发酵的桑葚酒对醇类物质种类数量影响不大，均为4种，但扣囊覆膜酵母发酵增加了桑葚酒中苯乙醇（15.67%）和2,3-丁二醇（2.30%）的含量，同时大幅降低桑葚酒中异戊醇（3.83%）的相对含量，使得桑葚酒的口感更加细腻净爽。扣囊覆膜酵母发酵桑葚酒还降低了乙酸（1.63%）的含量，减少了桑葚酒中的酸味，使桑葚酒后味变得醇和回甜。扣囊覆膜酵母发酵桑葚酒还检测出酿酒酵母发酵桑葚酒中不具有的4种醛类物质，分别为苯甲醛（0.93%）、乙醛（0.20%）、壬醛（0.74%）和癸醛（0.82%），赋予了桑葚酒独特的杏仁香和橘皮香[28]。结合感官品质与理化指标分析，扣囊覆膜酵母发酵的桑葚酒香味与口感显著增强，能有效提升桑葚酒的品质。
3 结论
经过单因素和响应面优化试验得到适合于扣囊覆膜酵母的发酵条件：酵母接种量2%，料液比75∶25（g∶mL），发酵温度26 ℃。在此优化条件下，桑葚酒感官评分为90.0分，酒精度为8.72%vol，总酯含量为5.7 g/L、总酸含量为4.8 g/L、总多酚含量为2.5 mg/mL，理化指标及微生物指标均符合相关国标要求。桑葚酒共检出24种挥发性风味物质，其中，酯类12种，醇类4种，酸类4种，醛类4种，并且所得桑葚酒含有乙酸丁酯、乙酸异戊酯和乙酸苯甲酯等多种风味物质，香气协调，口感醇厚，具有桑葚酒典型风格。扣囊覆膜酵母用于桑葚酒发酵能有效改善果酒品质，为非酿酒酵母发酵果酒提供了一定的数据支撑，为高品质桑葚酒的开发提供参考。
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