酱香型白酒丢糟是以红缨子高粱、赤水河水和高温大曲为原料，在多种霉菌、酵母、细菌和放线菌作用下，于长达一年的时间里经过九次蒸煮，八次发酵和七次蒸馏取酒后剩余的固体残渣[1-2]。鲜丢糟营养物质含量高，易酸化腐败，不易保存，对环境造成较大污染[3-4]。研究发现，经过“多微、多酶共酵”后的酱香型丢糟中含有大量的高附加值活性物质，主要包括蛋白（肽）类、多酚类、黄酮类等。通过提取、分离和纯化分析研究提取丢糟中的生物活性物质，如多酚、糖类和蛋白等，发现其中多酚是酱香型白酒具有独特口感和香味特征的原因之一[5]，通过进一步对其结构特性和药学特性进行研究，可有效提高丢糟的二次高效利用，实现酿酒企业的资源最大化利用。
多酚类主要包括单宁、香豆素（酸）类、黄酮类和酚酸类等，具有一定的抗氧化、消炎、抗病毒和维持肠道健康的能力[6-10]，广泛应用于化妆品和保健品行业，并得到药学领域的重视[11-12]。目前提取多酚类物质主要是从植物的根、茎、叶、花和果实中提取，其来源有限且含量相对固定[13-17]。常用提取多酚的方法主要有超声波提取法、酶解法、微波提取法和溶剂萃取法等[18-19]。选取不同的方法提取多酚，对多酚的提取活性和提取率都有一定的影响[20-21]。微波辅助乙醇浸提法具有穿透性较强，对多酚类等热敏性物质友好等特点[22]。研究发现，从酒糟中提取多酚类物质研究较少，曹新志等[23]研究了乙醇热回流提取郎酒酒糟中多酚的工艺条件并对其提取方法和检测方法进行优化，谢雨寻等[24]研究了水浴振荡法提取茶多酚的最优工艺条件并对其抗氧化活性进行了研究，然而，鲜有关于酱香型白酒丢糟多酚的提取工艺及其生物活性方面的研究报道。
本研究通过微波辅助乙醇浸提酱香型白酒丢糟中的多酚类物质，以多酚得率为评价指标，采用单因素试验和正交试验对丢糟中多酚类物质提取条件进行优化，并对其抗氧化能力进行测定。以期开发富含多酚类调味酒的原料，为制备富含多酚类调味酒提供物质理论基础。
1 材料与方法
1.1 材料与试剂
酱香型丢糟：产自贵州仁怀某酒厂。
没食子酸标准品（纯度＞98%）、铁氰化钾、磷酸二氢钠、磷酸氢二钠、三氯乙酸、水杨酸（均为分析纯）：天津市科密欧化学试剂有限公司；无水乙醇（分析纯）：常熟市鸿盛精细化工有限公司；福林酚试剂（分析纯）：国药集团化学试剂有限公司；三氯化铁、硫酸亚铁（均为分析纯）：成都金山化学试剂有限公司。所用有机溶剂均为国产分析纯。
1.2 仪器与设备
MCR-3E常压微波合成萃取仪：上海勒顿实业有限公司；SHB-Ⅲ循环水式多用真空泵、DGG-9240A电热恒温鼓风干燥箱：上海森信实验仪器有限公司；ZK-300A小高速万能粉碎机：北京中科浩宇科技发展有限公司；UV5100紫外分光光度计：上海元析仪器有限公司；FA2204N电子天平：上海菁海仪器有限公司；3K15离心机：美国SIGMA公司；XMTD203恒温水浴锅：江苏中大仪器科技有限公司。
1.3 方法
1.3.1 酱香型白酒丢糟中多酚的提取
将酱香型白酒丢糟置于50 ℃的恒温箱中干燥至恒定质量，并用万能粉碎机粉碎，过80目筛备用。
准确称取5.000 g酱香型白酒酒糟干粉末，乙醇体积分数为80%、料液比为1∶20（g∶mL）、微波功率为300 W、微波时间150 s的条件下，对酱香型白酒酒糟中的多酚进行提取。
1.3.2 酱香型白酒丢糟中多酚的测定及计算
采用分光光度法测定酱香型白酒丢糟中多酚含量[25-26]。分别移取0、0.5mL、1.0mL、1.5mL、2.5mL、3.0mL的0.1mg/mL的没食子酸标准溶液置于6个100 mL的容量瓶中，分别加入1.0 mL福林酚试剂，振荡摇匀后加入3.0 mL 10%Na2CO3溶液，充分摇匀后定容到100 mL，于20 ℃下避光反应80 min后，以不含有没食子酸溶液作空白对照，于波长765 nm条件下测定吸光度值，以没食子酸质量浓度（X）为横坐标，以吸光度值（Y）为纵坐标，绘制没食子酸的标准曲线，得到其线性回归方程为Y=48.554X+0.024 4，相关系数R2=0.999 6。
根据曹新志等[23]提供的方法测定样品中多酚的含量，并根据没食子酸线性回归方程计算多酚的含量。酱香型白酒丢糟多酚得率计算公式如下：
式中：W为多酚得率，mg/g；C为多酚含量，mg/mL；V为提取液体积，mL；n为稀释倍数，100；M为丢糟的质量，g。
1.3.3 酱香型白酒丢糟多酚提取条件优化
单因素试验：分别探究料液比（1∶10、1∶15、1∶20、1∶30、1∶50（g∶mL）、乙醇体积分数（60%、70%、80%、90%、100%）、提取时间（60 s、90 s、120s、150 s、180 s）和提取功率（200 W、250 W、300 W、350W、400 W）对多酚得率的影响。
正交试验：根据单因素试验分析结果综合考虑，确定料液比（A）、提取时间（B）、乙醇体积分数（C）、微波功率（D）4个影响因素，以多酚得率为评价指标，建立4因素3水平的正交试验，优化微波辅助乙醇提取丢糟中多酚工艺条件，正交试验因素与水平见表1。
表1 多酚提取工艺条件优化正交试验因素与水平
Table 1 Factors and levels of orthogonal experiments for polyphenols extraction process conditions optimization
水平A 料液比（g∶mL）B 提取时间/s C 乙醇体积分数/% D 微波功率/W 1 2 3 1∶10 1∶15 1∶20 120 150 180 70 80 90 200 250 300
1.3.4 酱香型白酒丢糟中多酚提取液的羟基自由基清除能力
根据唐婷范等[27-28]的方法，略有修改。向试管中依次加入1 mL的9 mmol/L硫酸亚铁溶液、2 mL的9 mmol/L水杨酸乙醇溶液、3 mL的蒸馏水，再加入2 mL的8.8 mmol/L H2O2混合均匀后暗处静置30 min，以不加H2O2为空白（以2.0 mL蒸馏水替代H2O2为空白），用水定容到10 mL比色管中，在波长510 nm的条件下测得吸光度值（A0），另取试管依次加入1.0 mL的9 mmol/L硫酸亚铁溶液、2 mL的9 mmol/L水杨酸乙醇溶液、3 mL不同浓度的丢糟提取液后，再加入2 mL 8.8 mmol/L的H2O2混合均匀后暗处静置30 min，用水定容到10 mL比色管中，以蒸馏水作参比溶液，在波长510 nm的条件下测定吸光度值（A1），按上述条件在加入不同浓度的丢糟提取液后不加2 mL 8.8 mmol/L的H2O2（以2.0 mL蒸馏水替代H2O2为空白），用水定容到10 mL比色管中，测定吸光度值（A2），平行测定3次求平均值，羟自由基清除率公式如下：
2 结果与分析
2.1 多酚提取工艺条件优化单因素试验结果
2.1.1 料液比的确定
图1 料液比对丢糟多酚得率的影响
Fig.1 Effect of solid and liquid ratio on the yield of polyphenols in distiller's grains
当料液比为1∶10、1∶15（g∶mL）时，多酚得率逐渐增加；当料液比为1∶15（g∶mL）时，多酚得率达到最高值，为12.45%；当料液比为1∶20、1∶30、1∶50（g∶mL）时，丢糟多酚得率呈现下降趋势。主要原因可能是当料液比达到一定程度时，适当的溶剂用量，在一定程度上提高了丢糟固体和提取液体溶剂之间的传质推动力，且增大了固体丢糟与液体的接触面积，使丢糟多酚充分溶解，有利于酚类物质的充分溶出；溶剂量过多，对溶出的多酚物质起到一定的稀释作用[29]。因此，确定最适料液比为1∶15（g∶mL）。
2.1.2 乙醇体积分数的确定
乙醇体积分数对丢糟中多酚得率影响见图2。由图2可知，当乙醇体积分数为60%～80%时，丢糟中多酚得率逐渐增加；当乙醇体积分数为80%时，多酚得率达到最大值，为11.87%；当乙醇体积分数为80～100%时，多酚得率逐渐下降。多酚物质主要通过氢键和疏水键与蛋白质和多糖结合形成稳定性化合物[30]。当乙醇体积分数在一定范围内增大时，溶剂的极性变小，有利于低极性的多酚物质的溶出。当乙醇体积分数＞80%时，随着极性的不断降低，其氢键被破坏，更多依靠氢键结合的物质被破坏，更多杂质被溶出，使多酚的稳定性受到影响，导致多酚含量下降[31]。因此，确定最适乙醇体积分数为80%。
图2 乙醇体积分数对丢糟多酚得率的影响
Fig.2 Effect of ethanol volume fraction on the yield of polyphenols in distiller's grains
2.1.3 提取时间的确定
提取时间对多酚得率的影响见图3。由图3可知，当提取时间为60～150 s时，丢糟中多酚得率逐渐增加；当提取时间为150 s时，丢糟中多酚得率达到最大值，为12.33%；当提取时间＞150 s，丢糟中多酚得率趋于稳定。其原因可能是，随着提取时间的不断增加，能更充分的将丢糟中的多酚物质溶出；提取时间较长时，导致提取温度升高，杂质溶出不断增多，多酚本身的稳定性偏弱，易与杂质发生反应，多酚遭到破坏而使多酚的含量下降[32]。因此，确定最适提取时间为150 s。
图3 提取时间对丢糟多酚得率的影响
Fig.3 Effect of extraction time on the yield of polyphenols in distiller's grains
2.1.4 微波功率的确定
微波提取功率对丢糟中多酚得率的影响见图4。由图4可知，当微波功率为200～250 W时，丢糟中多酚得率呈上升趋势；微波功率为250 W时，丢糟中多酚得率达到最大值，为11.88%；微波功率＞250 W时，丢糟中多酚得率逐渐下降。其原因可能是，随着微波功率的增加，固液系统升温较快，细胞破碎加剧，更有利于多酚物质的溶出，微波功率过高会造成体系升温过快，使多酚结构被破环[32]。因此，确定最适微波功率为250 W。
图4 微波功率对丢糟多酚得率的影响
Fig.4 Effect of microwave power on the yield of polyphenols in distiller's grains
2.2 酱香型白酒丢糟多酚提取工艺优化的正交试验结果
根据单因素试验结果，选择料液比（A）、提取时间（B）、乙醇体积分数（C）、微波功率（D）4个影响因素，以丢糟多酚得率为评价指标，进行正交试验设计，正交试验结果与分析见表2，方差分析见表3。
表2 多酚提取工艺条件优化正交试验结果与分析
Table 2 Results and analysis of orthogonal experiments for polyphenols extraction process conditions optimization
试验号 A 料液比（g∶mL）B 提取时间/s C 乙醇体积分数/%D 微波功率/W多酚得率/%1 2 3 4 5 6 7 8 9 K1 K2 K3 10.35 13.54 11.43 12.29 10.86 10.79 11.03 11.52 12.19极差R 1∶10 1∶10 1∶10 1∶15 1∶15 1∶15 1∶20 1∶20 1∶20 11.44 11.65 11.25 0.40 120 150 180 120 150 180 120 150 180 10.56 11.97 11.80 1.41 70 80 90 80 90 70 90 70 80 11.55 12.34 10.44 1.90 200 250 300 300 200 250 250 300 200 11.13 12.12 11.08 1.04
表3 正交试验结果方差分析
Table 3 Variance analysis of orthogonal experiments results
注：“*”表示对结果影响显著（P＜0.05）；“**”表示对结果影响极显著
（P＜0.01）。
因素 偏差平方和 自由度 F 值 P 值 显著性ABCD 0.320 0.877 5.695 0.805 2 2 2 2 12.68 31.12 67.18 1 0.073 0.031 0.014 0.5**
由表2可知，各种因素对酱香型白酒丢糟中多酚得率影响的主要次序为C＞B＞A＞D，即乙醇体积分数＞提取时间＞料液比＞微波功率。获得提取工艺条件的最佳方案组合为A2B2C2D2，即料液比为1∶15（g∶mL）、提取时间为150 s、乙醇体积分数为80%、微波功率为250 W，因正交试验设计方案未涉及此提取工艺条件，需要对此方案进行3次平行验证试验，在该优化工艺条件下得到的酱香型白酒丢糟多酚得率为15.22%。表明该方案符合优化结果，达到丢糟中多酚提取条件优化的目的。
由表3可知，提取时间及乙醇提取分数对酱香型白酒丢糟多酚得率影响显著（P＜0.05），而料液比、微波功率对酱香型白酒丢糟多酚得率影响不显著（P＞0.05），其原因很可能是酱香型白酒丢糟经过多次蒸煮发酵，在多种微生物和酶的共同作用下，其多酚类物质已经溶出或者是由微生物发酵产生的次级代谢产物。
2.3 羟自由基清除能力检测结果
羟自由基清除能力检测结果见图5。由图5可知，随着VC溶液和多酚溶液质量浓度在0～0.093 mg/mL范围内的增加，VC溶液和多酚提取液的羟自由基清除能力逐渐增加；当VC溶液和多酚溶液质量浓度＞0.093 mg/mL，羟自由基清除率变化趋于平稳，当多酚提取液的质量浓度为0.116 mg/L时，其羟自由基清除能力达到最大值，为75.79%。因此，从酱香型白酒丢糟中提取出的多酚样液具有羟基自由基清除能力。
图5 丢糟多酚的羟自由基清除能力
Fig.5 Hydroxyl free radical scavenging ability of polyphenols in distiller's grains
3 结论
本实验以酱香型白酒丢糟为原料，通过单因素试验和正交试验探究了微波辅助乙醇浸提酱香型白酒丢糟中多酚的最佳提取工艺条件，并对其抗氧化能力进行初步测定。结果表明，各种因素对酱香型白酒丢糟中多酚得率影响的主要次序为：乙醇体积分数＞提取时间＞料液比＞微波功率，即当料液比为1∶15，提取时间为150 s，乙醇体积分数为80%，微波功率为250 W时，丢糟多酚得率可达15.22%，羟基自由基清除率可达75.79%。结果表明，酱香型白酒丢糟中含有氧化还原能力较好的多酚类活性物质，该优化条件对酱香型白酒丢糟中高附加值活性物质的提取具有重要指导意义，为富含多酚类调味酒的研制提供参考价值，为酱香型白酒丢糟的高效回收利用，减少环境污染，酿酒资源的循环高效利用提供参考思路。
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