漆酶是一种多功能的含铜氧化还原酶，它于1883年在日本漆树上首次被发现[1]，能催化多种芳香族化合物发生氧化反应，在反应中分子氧作为电子受体被还原成水[2-3]。目前，按照来源可将漆酶分为真菌漆酶、细菌漆酶和植物漆酶。漆酶由于其广泛的底物亲和性、去除苯酚的能力和清洁反应机制，已被证明在食品工业、医药工业、生物技术和环境保护领域具有广泛的应用前景[4-5]。
灵芝（Ganoderma lucidum）是一种传统中药，含有灵芝多糖、灵芝三萜等多种生物活性成分，具有调节免疫、抗病毒、抗肿瘤、抗衰老等药理作用，传统上作为药品与保健食品使用。由于灵芝能够分泌漆酶，近年来灵芝的应用也拓展到医药、农药、造纸、印染等行业的废水处理、土壤污染修复等环保领域[1]。由于野生灵芝对生长环境要求苛刻，人工栽培存在生产周期长、成本高、生物活性物质含量低等问题。目前，灵芝及其活性组分的生产主要依靠液态发酵与固态发酵两种方式，与液态发酵相比，固态发酵技术具有工艺简单、投资少、原料来源广、二次污染少等特点。因此，灵芝固态发酵研究备受学者瞩目，研究内容主要集中在寻找价格低廉的替代基质、菌种选育、发酵工艺条件优化、主要代谢产物的合成机制与调控机理研究、灵芝漆酶在食品加工、绿色制浆、环境保护等领域的应用等[1，6-7]。
中药渣与城市污泥是两种常见的固体废弃物，产生量大，处理处置压力很大。城市污泥中含有大量的有机质，氮源含量较高，保水性较强，但部分重金属含量较高[8]；由于中药渣中残留有多种活性成分和营养物质，可以将其作为灵芝发酵的基质使用[9-11]。但是，采用中药渣作为单一底物，营养组成可能不合理，如氮源、磷源及部分微量元素缺乏，不利于灵芝生长与产酶，添加适量的酵母粉、磷酸二氢钾、硫酸铜、硫酸镁等物质后，可以明显促进灵芝产酶[9]。因此，可以考虑将中药渣与城市污泥结合起来，作为混合基质用于灵芝发酵产漆酶。与单一基质相比，混合基质具有稀释毒性物质、提供合理的碳氮比，改善营养组成的优势。为了更好的利用这两种固体废弃物，该研究在单因素试验的基础上通过响应面分析法进行了培养基组成的优化研究，以期获得更高的漆酶活性。
1 材料与方法
1.1 材料与试剂
1.1.1 材料
三七渣：取自成都市某中成药厂；城市污泥：取自成都市某生活污水处理厂，三七渣与城市污泥经晾晒后于60 ℃烘72 h，再经粉碎、过筛后置于干燥器中保存备用；金地灵芝（Ganoderma lucidum）：四川省农业科学院土壤肥料研究所微生物室提供。
1.1.2 试剂
酵母浸出粉、葡萄糖、蛋白胨、硫酸铜、硫酸镁、吐温80、藜芦醇、磷酸二氢钠（均为分析纯或生化试剂）：成都科隆化学品有限公司；2,2'-联氮-二（3-乙基-苯并噻唑-6-磺酸）二铵盐（2,2'-azino-bis（3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonic acid）diammonium salt，ABTS）（分析纯）：上海阿拉丁试剂厂。
1.1.3 培养基
马铃薯葡萄糖琼脂（potato dextrose agar，PDA）培养基：马铃薯20.0 g，葡萄糖2.0 g，酵母粉0.3 g，蛋白胨0.2 g，磷酸二氢钾0.1 g，硫酸镁0.06 g，蒸馏水100 mL，琼脂粉2.0 g，121 ℃灭菌30 min。
种子液培养基：马铃薯20.0 g，葡萄糖2.0 g，酵母粉0.3 g，蛋白胨0.2 g，磷酸二氢钾0.1 g，硫酸镁0.06 g，蒸馏水100 mL，121 ℃灭菌30 min。
固态发酵培养基：过60目筛的三七渣和城市污泥共10.0 g（城市污泥占比为30%），酵母浸出粉6.0%，磷酸二氢钾添加量0.3%，硫酸镁0.3%，吐温-80 0.04%，硫酸铜0.04%，藜芦醇0.04%，pH自然，121 ℃灭菌30 min。
1.2 仪器与设备
PYX-250H-C恒温恒湿培养箱：广东韶关科力实验仪器有限公司；THZ-92A气浴恒温振荡器：上海博迅医疗生物仪器股份有限公司；BSA224S电子分析天平：赛多利斯科学仪器（北京）有限公司；WFJ 7200分光光度计：尤尼柯仪器有限公司；LDZX-50KB高压灭菌锅：上海申安医疗器械厂。
1.3 方法
1.3.1 菌种扩大培养
将试管内保存的金地灵芝菌种接入PDA培养基中，于28 ℃条件下恒温培养7～8 d。
1.3.2 种子液制备
用打孔器在培养菌种的培养皿边缘打取0.25 cm2的灵芝菌丝块，接入种子液培养基中（每250 mL锥形瓶中装入100 mL种子液），置于气浴恒温振荡器中，在170 r/min、28 ℃条件下培养5～7 d，即得种子液。
1.3.3 三七渣-城市污泥固态发酵采用固态发酵培养基在121 ℃条件下灭菌30 min后，在装有固态发酵培养基的250 mL三角瓶中接入15%的灵芝种子液，将其置于恒温培养箱中于28 ℃培养10 d，待发酵结束后提取粗酶液并测定其漆酶的活性。
1.3.4 漆酶酶活的测定与计算
粗酶液制备：待固态发酵完成后，使用剪刀将发酵产物剪碎，向发酵瓶内加入150 mL缓冲溶液（pH4.0乙酸-乙酸钠），于40 ℃水浴恒温保持1 h，间隔20 min振摇一次，水浴完成后用8层纱布分滤，将滤液在4 500 r/min条件下离心15 min，离心后所得上清液即为粗酶液，置于4 ℃条件下冷藏备用。
漆酶酶活的测定采用ABTS法[12-13]：分别将0.05 mL粗酶液，1 mL ABTS（10 mmol/L），2.95 mL磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲液（pH4.0）加入试管中，在35 ℃条件下水浴3 min，测定波长420 nm处的吸光度值，每个样品测3次，以平均值表示实验结果。一个酶活单位（IU）定义为每分钟催化1 μmol ABTS氧化所需的酶量。每克发酵基质（干基）生产的漆酶计算公式如下：
式中：P为每克发酵基质（干基）生产的漆酶酶活；ΔA为反应前后溶液吸光度差值；V1为反应体系的总体积，mL；V2为粗酶液总体积，mL；ε为ABTS消光系数，36 000 L/（mmol·cm）；V0为加入反应体系的粗酶液体积，mL；Δt为反应时间，min；b为吸收池厚度，cm；N为稀释倍数；m为发酵基质质量（干基），g。
1.3.5 培养基组成优化单因素试验
在固态发酵培养基的基础上，分别考察城市污泥占比（0、10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%、100%）、酵母浸出粉添加量（0、2%、4%、6%、8%、10%、12%、14%）、培养基初始含水量（40%、50%、60%、70%、80%）、硫酸铜添加量（0、0.02%、0.04%、0.06%、0.08%、0.10%）、磷酸二氢钾添加量（0、0.1%、0.2%、0.3%、0.4%、0.5%、0.6%、0.7%、0.8%）、藜芦醇添加量（0、0.02%、0.04%、0.06%、0.08%、0.10%）对漆酶活性的影响。
1.3.6 培养基组成优化Box-Behnken试验
在单因素试验的基础上，以磷酸二氢钾添加量（A）、硫酸铜添加量（B）、城市污泥占比（C）为自变量，以漆酶活性（Y）为响应值进行培养基组成优化响应面试验，Box-Behnken试验设计因素及水平见表1。
表1 Box-Behnken试验设计因素与水平
Table 1 Factors and levels of Box-Behnken experiments design
因素A 磷酸二氢钾添加量/%B 硫酸铜添加量/%C 城市污泥占比/%-1水平0 1 0.3 0.04 30 0.4 0.06 40 0.5 0.08 50
1.3.7 数据处理
采用SPSS17.0软件对单因素试验数据进行方差分析，采用Design-Expert8.0.6软件进行响应面分析。
2 结果与分析
2.1 培养基优化单因素试验
2.1.1 城市污泥占比对漆酶酶活的影响
基质的营养组成对发酵结果影响很大，为了尽量减少后续营养组分的添加，需要首先确定城市污泥在混合基质中的最佳占比。因此，在混合基质总质量10.0 g的条件下，考察城市污泥占比对漆酶酶活的影响，结果见图1。
图1 城市污泥占比对漆酶酶活的影响
Fig.1 Effect of the ratio of municipal sludges on laccase activity
由图1可知，城市污泥占比0～40%范围内随着基质中城市污泥占比增大，漆酶酶活先升高，在城市污泥占比40%～100%范围内，漆酶酶活逐渐降低。由于城市污泥中总糖与还原糖含量偏低，氮源丰富，重金属离子含量较高，而三七药渣中总糖与还原糖含量丰富，氮源偏低，两者单独作为发酵基质使用，其营养成分都不完善，不能很好地满足灵芝生长与产酶所需。葛元[14]研究发现，餐厨垃圾单独发酵存在容易酸化及高盐导致的发酵抑制，城市剩余污泥单独发酵存在较硬结构难以水解酸化的问题。而把餐厨垃圾与城市剩余污泥进行混合发酵可以克服各自理化特性的缺点，从而提高有机物质降解效率且大幅度提高发酵系统稳定性及产气特性。黄庆等[15]研究发现，以市政污水处理厂污泥（以下简称污泥）协同农林废物为原料，采用生物反应器开展好氧发酵，可以提高堆肥效率及产品质量。由此可见，城市污泥在混合基质中的最佳占比为40%。
2.1.2 酵母浸出粉添加量对漆酶酶活的影响
氮源是微生物的重要营养物质。适宜的C/N比能够影响灵芝菌丝体的生长和漆酶的分泌[16]。考虑到有机氮源更适合灵芝生长，选择酵母浸出粉为氮源，考察不同添加量对漆酶酶活的影响，结果见图2。
图2 酵母浸出粉添加量对漆酶酶活的影响
Fig.2 Effect of nitrogen source addition on laccase activity
由图2可知，随着酵母浸出粉添加量在0～8%范围内增加，漆酶酶活逐渐升高，在添加量8%～14%范围内酶活逐渐降低，加入适量有机氮源调节C/N比，可以促进漆酶的合成，添加的比例则与发酵基质自身的营养组成（碳氮比）有关。单独采用三七渣为基质发酵灵芝产漆酶时，酵母粉添加量为3%时酶活最高。张丁倩等[17]的研究结果表明，氮源对灵芝和产朊假丝酵母混菌固态发酵油菜秸秆产漆酶的影响也十分显著。由此可见，最佳酵母浸出粉添加量为8%。
2.1.3 培养基初始水含量对漆酶酶活的影响
水在固态发酵中具有溶解和传递营养物质的作用，灵芝生长及漆酶合成也需要充足的水分。考察培养基不同初始水含量对漆酶酶活的影响，结果见图3。
图3 培养基初始水含量对漆酶酶活的影响
Fig.3 Effect of initial water content of medium on laccase activity
由图3可知，随着培养基初始含水量在40%～60%范围内增加，漆酶酶活逐渐升高，培养基初始含水量在60%～80%范围时，漆酶酶活随着培养基初始水含量的增加逐渐降低。当水含量太低时，不利于营养物质的溶解和传递；当水含量太高时，培养基内部黏性增大，阻碍空气的传递和散热，进而影响菌体生长和产漆酶[18]，曲墨等[19]优化了灵芝菌固体发酵三七渣的工艺条件，发现培养基中初始含水量为60%时，更利于灵芝菌丝生长，有利于菌蕾形成，与该研究结果相同。王蕾等[20]以青霉菌固态发酵产漆酶，当固液比为1∶1.5时，漆酶酶活最高。由此可见，最佳培养基初始含水量为60%。
2.1.4 硫酸铜添加量对漆酶酶活的影响
漆酶是一种含铜离子的多酚氧化酶，加入铜可提高编码漆酶基因的表达水平，有研究表明，CuSO4作为诱导剂能够有效提高漆酶的产量和活性[21-22]。考察硫酸铜添加量对漆酶酶活的影响，结果见图4。
图4 硫酸铜添加量对漆酶酶活的影响
Fig.4 Effect of copper sulphate addition on laccase activity
由图4可知，在硫酸铜添加量在0～0.06%范围内，漆酶酶活随着硫酸铜添加量的增加先升高，硫酸铜添加量在0.06%～0.08%范围时逐渐降低。柴新义等[23-24]的研究结果也表明，低浓度的铜离子能促进漆酶形成，而高浓度的铜离子则会阻碍漆酶的产生。由此可见，最佳硫酸铜添加量为0.06%。
2.1.5 磷酸二氢钾添加量对漆酶酶活的影响
研究发现少量KH2PO4可提高漆酶酶活，这可能是因为PO43-为遗传物质的组成成分，KH2PO4为遗传物质的合成提供了足够的PO43-[25]。考察磷酸二氢钾添加量对漆酶酶活的影响，结果见图5。
图5 磷酸二氢钾添加量对漆酶酶活的影响
Fig.5 Effect of potassium dihydrogen phosphate addition on laccase activity
由图5可知，在磷酸二氢钾添加量0～0.4%范围内，漆酶酶活随着磷酸二氢钾添加量的增加先升高，在磷酸二氢钾添加量0.4%～0.8%范围内时灵芝漆酶酶活降低，可能是因为磷过量，漆酶的合成受到抑制[26]。PREETI N等[27]对固态发酵生产漆酶的条件进行了优化，发现磷酸二氢钾的浓度影响漆酶的产生，它对微生物生长过程中营养物质的传质有重要影响。由此可见，最佳磷酸二氢钾添加量为0.4%。
2.1.6 藜芦醇添加量对漆酶酶活的影响
藜芦醇作为诱导物可以促进漆酶的产生[28-29]。考察藜芦醇添加量对漆酶酶活的影响，结果见图6。
图6 藜芦醇添加量对漆酶酶活的影响
Fig.6 Effect of veratryl alcohol addition of on laccase activity
由图6可知，在藜芦醇添加量0～0.08%范围内，漆酶酶活随着藜芦醇添加量的增加先升高，超过0.08%后逐渐降低。芳香类化合物作为漆酶广泛的底物，能激发漆酶启动子上的外源化合物响元素，有利于漆酶的产生[30]，但浓度过高会产生毒副作用。由此可见，最佳藜芦醇添加量为0.08%。
2.2 培养基优化响应面试验
2.2.1 响应面试验设计与结果
采用SPSS17.0软件对单因素试验结果进行方差分析，选择对漆酶酶活影响最显著的3个因素（磷酸二氢钾添加量（A）、硫酸铜添加量（B）、城市污泥占比（C））为自变量，采用Box-Behnken中心组合方法，以漆酶酶活（Y）为响应值设计响应面优化试验，试验设计及结果见表2，方差分析结果见表3。
表2 Box-Behnken试验设计与结果
Table 2 Design and results of Box-Behnken experiments
试验号 A B C Y 漆酶酶活/（IU·g-1）1 2 3 4 5 6 7 8 9 1 0-1 1-1 1-1 1-1-1-1 1 1 0 0 0 0 -0 0 0 0 -1-1 1 1 -1 11 1 0 0 0 1 1 -1-1 1 5.64 5.17 4.82 4.92 5.98 5.36 5.27 5.33 5.58 5.17 5.10
续表
试验号 A B C 12 13 14 15 16 17 0 0 0 0 0 0 1 0 0 0 0 0 1 0 0 0 0 0 Y 漆酶酶活/（IU·g-1）4.52 5.67 5.58 5.61 5.59 5.56
表3 回归模型方差分析
Table 3 Variance analysis of regression model
注：“**”表示对结果影响极显著（P＜0.01）；“*”表示对结果影响显著
（P＜0.05）。
方差来源 平方和 自由度 均方 F 值模型ABCA B AC BC A2 B2 C2误差项失拟项纯误差合计2.12 0.11 0.53 0.44 0.081 0.12 0.007 0.005 0.77 0.028 0.031 0.024 0.007 2.15 9 1 1 1 1 1 1 1 1 1 7 3 4 1 6 0.24 0.11 0.53 0.44 0.081 0.12 0.007 0.005 0.77 0.028 0.004 0.008 0.002 52.40 24.10 118.23 97.43 18.10 25.77 1.61 1.22 172.32 6.16 P 值 显著性＜0.000 1 0.001 7＜0.000 1＜0.000 1 0.003 8 0.001 4 0.245 0 0.306 6＜0.000 1 0.042 1***************4.58 0.087 8
通过Design-Expert 8.0.6软件对表2中的试验数据进行多元回归拟合，得到漆酶酶活（Y）与磷酸二氢钾添加量（A）、硫酸铜添加量（B）、城市污泥占比（C）的二次回归方程：
由表3可知，磷酸二氢钾添加量（A）、硫酸铜添加量（B）、城市污泥占比（C）三个因素对漆酶酶活的影响极显著（P＜0.01），交互项AB、AC对漆酶酶活影响极显著（P＜0.01），交互项BC对漆酶酶活影响不显著（P＞0.05）；二次项A2、B2、C2对漆酶酶活影响分别为不显著（P＞0.05）、极显著（P＜0.01）和显著（P＜0.05）。
由F值可知，三个因素及其交互作用对漆酶酶活影响的大小顺序为：硫酸铜添加量（B）＞城市污泥占比（C）＞磷酸二氢钾添加量与城市污泥占比的交互作用（AC）＞磷酸二氢钾添加量（A）＞磷酸二氢钾添加量与硫酸铜添加量的交互作用（AB）＞硫酸铜添加量与城市污泥占比的交互作用（BC）。回归模型P＜0.000 1，说明整个模型回归效果极显著，建立的模型较为准确；失拟项P=0.228 6，失拟项不显著（P＞0.05），说明模型拟合度较好，没有明显的失拟现象。
2.2.2 响应面分析
利用Design Expert 8.0.6软件绘制回归模型的三维响应曲面图，考察不同因素之间的交互作用对漆酶活性的影响。响应面图可以体现各因素对响应值的影响程度，曲面越陡峭，该因素对响应值的影响越显著[25]。各因素间交互作用对漆酶酶活影响的响应曲面和等高线见图7。
图7 城市污泥占比、磷酸二氢钾和硫酸铜添加量间交互作用对漆酶酶活影响的响应曲面和等高线
Fig.7 Response surface plots and contour lines of effects of interaction between the ratio of municipal sludges,potassium dihydrogen phosphate addition and copper sulphate addition on laccase activity
由图7（a）可知，当城市污泥占比固定不变时，随着硫酸铜添加量、磷酸二氢钾添加量的增加，漆酶活性呈现先升高后降低的趋势且响应面呈凸形，表明这两个因素之间存在较显著的交互作用。由图7（b）可知，当硫酸铜添加量固定时，随着城市污泥占比和磷酸二氢钾添加量的增加，漆酶活性都呈现下降趋势且响应面呈凸形，表明城市污泥占比和磷酸二氢钾添加量存在交互作用。由图7（c）可知，当磷酸二氢钾添加量固定不变时，随着硫酸铜添加量和城市污泥占比的增加，漆酶的活性均呈现先升高后降低的趋势，但两者的交互作用不显著。
由二次回归模型得到的优化的培养基组成：城市污泥占比30.242%、磷酸二氢钾添加量0.306%、硫酸铜添加量0.050%，预测的漆酶酶活为6.051 IU/g。
2.2.3 验证试验
考虑到实际操作的便利性，最终决定进行验证试验的培养基组成为城市污泥占比30%、磷酸二氢钾添加量0.3%、硫酸铜添加量0.05%。在此条件下，获得的漆酶酶活为5.90 IU/g，与预测结果的相对误差为2.9%。表明该回归模型可靠，具备应用价值。
3 结论
该研究单因素试验和响应面分析法优化灵芝固态发酵三七渣和污泥产漆酶的发酵培养基配方。结果表明，最佳培养基配方为城市污泥占比30%、磷酸二氢钾添加量0.3%、硫酸铜添加量0.05%。在此条件下，每克三七渣-城市污泥混合物（干基）可产漆酶5.90 IU。通过灵芝固态发酵三七渣和污泥产漆酶，可为实现三七渣、城市污泥的资源化利用提供一定参考。
[1] ZOFAIR S, AHMAD S, HASHMI M A, et al.Catalytic roles, immobilization and management of recalcitrant environmental pollutants by laccases:Significance in sustainable green chemistry[J].J Environ Manag,2022,309:114676.
[2]SU J,FU J,WANG Q,et al.Laccase:a green catalyst for the biosynthesis of poly-phenols[J].Crit Rev Biotechnol,2018,38(2):294-307.
[3]RAMIREZ-MONTOYA L A,HERNANDEZ-MONTOYA V,MONTESMORAN M A, et al.Correlation between mesopore volume of carbon supports and the immobilization of laccase from Trametes versicolor for the decolorization of acid orange 7[J].J Environ Manag,2015,162:206-214.
[4] TEERAPATSAKUL C, PARRA R, KESHAVARZ T, et al.Repeated batch for dye degradation in an airlift bioreactor by laccase entrapped in copper alginate[J].Int Biodeter Biodegrad,2017,120:52-57.
[5]马莹莹，贾红华.细菌漆酶的研究及应用进展[J].生物技术通报，2013（2）：41-45.
[6]杨宗渠，李长看，雷志华，等.灵芝固态发酵研究进展[J].北方园艺，2017（7）：200-204.
[7]魏滔，张长生，陈琼华，等.灵芝真菌液体发酵及其产物应用的研究进展[J].微生物学通报，2022，49（1）：336-351.
[8]王睿坤，刘建忠，虞育杰，等.城市污泥特性及其干化技术[J].给水排水，2010，46（1）：153-158.
[9]谭显东，吉栗漫，陈楠，等.灵芝固态发酵三七渣产漆酶的培养基配方优化[J].中国酿造，2021，40（5）：153-156.
[10]谭显东，陈楠，王浪，等.响应面法优化灵芝发酵三七渣产灵芝三萜工艺[J].中国酿造，2021，40（6）：147-151.
[11]谭显东，卢上飞，胡伟，等.三七渣固态发酵生产灵芝菌质的工艺优化[J].食品工业科技，2020，41（18）：130-134.
[12] DROZD R, RAKOCZY R, WASAK A, et al.The application of magnetically modified bacterial cellulose for immobilization of laccase[J].Int J Biol Macromol,2018,108:462-470.
[13]MA J,XU Z S,WANG F,et al.Isolation,purification and characterization of two laccases from carrot(Daucus carota L.)and their response to abiotic and metal ions stresses[J].Prot J,2015,34(6):444-452.
[14]葛元.餐厨垃圾与城市剩余污泥混合厌氧发酵研究[D].杨凌：西北农林科技大学，2019.
[15]黄庆，刘惠琼，郑恒，等.市政污泥协同农林废物好氧发酵中试研究[J].环境卫生工程，2022，30（4）：41-47.
[16]岳鹍，潘志恒，孙勇民.混料设计及响应面法优化大黄药渣固态发酵生产漆酶的工艺[J].保鲜与加工，2019，19（2）：121-128.
[17]张丁倩，柯丽霞，赵文科，等.混菌发酵油菜秆氮源对灵芝木质素酶系的影响[J].中国食用菌，2010，29（1）：39-41.
[18]TUGˇBA A, SAYIT S.Production of laccase from Trametes versicolor by solid-state fermentation using olive leaves as a phenolic substrate[J].Bioproc Biosystems Eng,2013,36(2):215-222.
[19]曲墨，邱智东，王伟楠.灵芝菌固体发酵三七药渣工艺研究[J].长春中医药大学学报，2016，32（2）：263-265.
[20]王蕾，张永，田乔鹏，等.IMBH-2固态发酵产漆酶条件的优化及酶学性质的初步研究[J].科学技术与工程，2018，18（3）：184-188.
[21] LINSON L, TAREK R, AMINE L M, et al.Agro-industrial-produced laccase for degradation of diclofenac and identification of transformation products[J].ACS Sust Chem Eng,2017,5(7):5772-5781.
[22]GASSARA F,BRAR S K,TYAGI R D,et al.Screening of agro-industrial wastes to produce ligninolytic enzymes by Phanerochaete chrysosporium[J].Biochem Eng J,2010,49(3):388-394.
[23]柴新义，安双登，盛硕，等.产漆酶真菌筛选及其产酶条件的优化[J].西北农林科技大学学报（自然科学版），2015，43（3）：205-210.
[24]窦欣.灵芝漆酶的性质、应用及其基因在毕赤酵母中的表达[D].无锡：江南大学，2019.
[25]LIANG H,GAO D W,ZENG Y G.Effects of phosphorus concentration on the growth and enzyme production of Phanerochaete chrysosporium[J].Bioresource Technol,2012,107:535-538.
[26]谭叶林，杜全能，朱文娟，等.产漆酶细菌筛选鉴定及固体发酵条件研究[J].安徽农业科学，2020，48（1）：1-6.
[27]PREETI N,RAO R S,CHANDER K R.Laccase production by Coriolopsis caperata RCK2011: optimization under solid state fermentation by Taguchi DOE methodology[J].Scientif Rep,2013,3(1):1386-1386.
[28]陈中维，杨锐，李宁杰，等.黄孢原毛平革菌产漆酶优化培养及其对刚果红的脱色降解[J].菌物学报，2021，40（6）：1538-1548.
[29]XIN F,GENG A.Utilization of horticultural waste for laccase production by Trametes versicolor under solid-state fermentation[J].Appl Biochem Biotechnol,2011,163(2):235-246.
[30] QUARATINO D, CIAFFI M, FEDERICI E, et al.Response surface methodology study of laccase production in Panus tigrinus liquid cultures[J].Biochem Eng J,2007,39(2):236-245.