沙棘（Hippophaë rhamnoides L.）是胡颓子科、沙棘属落叶性灌木，成熟的浆果呈椭圆形，通常颜色为黄色、橙色或橙红色[1]。沙棘浆果富含矿物质、维生素、多糖、不饱和脂肪酸、多酚化合物、类黄酮、有机酸等成分[2]。沙棘具抗氧化、调节免疫、保护心脏和抗动脉粥样硬化、抗菌和抗病毒作用等[3]。沙棘浆果由23%沙棘籽、68%果肉和8%果皮组成[4]，沙棘种子中富含油酯，含有多种多不饱和脂肪酸和β-谷甾醇，这些物质对抗氧化性有一定的贡献[5-6]，而果肉中则含有更多有机酸，尤其是苹果酸含量高[7]，其次是酒石酸、柠檬酸，这些有机酸使沙棘呈现苦味及酸涩的口感[8]。
目前，市面上的沙棘果汁产品的加工方式简单调配为主，产品附加值不高，且对消费者吸引力不强[7]。发酵有助于维持和改善食物营养和感官特性，YANG H等[9]研究发现，酵母菌发酵可以代谢产生一些功能物质，有利于提高果汁的品质；陈丽花等[10]对酿酒酵母和乳酸菌共发酵沙棘汁的抗氧化能力及香气成分进行检测，发现沙棘汁的抗氧化能力和香气成分在发酵后显著提高；WU D等[11]对沙棘汁发酵过程中的风味化合物进行了检测，发现酵母菌发酵提高了沙棘汁的甜味，但果香减少，苦味增加。
本研究分别向带籽处理、去籽处理及果肉破碎处理的沙棘汁中加入酵母菌RV171进行发酵，对不同处理组发酵沙棘汁的总黄酮、总酚含量、抗氧化能力进行分析，同时使用高效液相色谱（high performance liquid chromatography，HPLC）和顶空固相微萃取-气相色谱-质谱联用（headspace solid-phase microextraction-gas chromatography-mass spectrometry，HS-SPME-GC-MS）法对酵母菌发酵沙棘汁的有机酸和挥发性化合物进行检测，探究不同预处理方法对酵母菌发酵沙棘汁的影响，以期为沙棘酵母菌发酵饮料的研制奠定基础，通过发酵手段掩蔽沙棘汁不良风味，提升沙棘汁品质。
1 材料与方法
1.1 材料与试剂
1.1.1 原料与菌株
沙棘果（Hippophae rhamnoides L.）：新疆石河子产，于-18 ℃贮存；酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）RV171：湖北安琪酵母股份有限公司。
1.1.2 试剂
1,1-二苯基-2-三硝基苯肼（1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl，DPPH）、2,2'-联氮-双-3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸（2,2'-azino-bis（3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonic acid），ABTS）、水杨酸、芦丁、福林酚（均为分析纯）：天津市盛奥化学试剂有限公司；酒石酸、苹果酸、柠檬酸、琥珀酸（均为色谱纯）：上海源叶生物科技有限公司；2-辛醇（纯度＞98%）：上海麦克林生化科技有限公司；Carboxen/聚二甲基硅氧烷/二乙烯基苯（carboxane/polydimethylsiloxane/divinylbenzene，CAR/PDMS/DVB）固相微萃取萃取头：北京飞美斯分析科技有限公司。
1.2 仪器与设备
JYL-C4OT破壁机：颍上卓越电子商务有限公司；WSC-C色差仪：上海荆和分析仪器有限公司；N6000紫外分光光度计：广州市璟琪有限公司；LC-20A高效液相色谱（HPLC）仪：日本岛津公司；8890-7000D气相色谱-质谱联用（GC-MS）仪：苏州市莱顿科学仪器有限公司。
1.3 方法
1.3.1 发酵沙棘汁的加工工艺流程及操作要点
原料预处理→成分调整→灭菌→接种发酵→灭菌→成品
沙棘预处理：将沙棘果去梗、清洗后，带籽打浆：将沙棘全果与水按比例1.0∶1.5（g∶mL）放入破壁机中打浆，备用。去籽打浆：除去沙棘籽后，将按果肉与水按比例1.0∶1.5（g∶mL）放入破壁机中打浆，备用。果肉破碎：将沙棘全果至于纱布中将果肉压碎，随后将其置于锥形瓶中，备用。
成分调整：分别用等质量的白砂糖和木糖醇调节初始糖度至13°Bx，用Na2CO3调节初始pH至4.00，为酵母菌生长提供适宜的碳源和酸碱度。
杀菌：对沙棘汁进行巴氏杀菌（75 ℃，20 min）并冷却至37 ℃。
酵母菌活化、接种：称取沙棘汁体积0.03%酵母菌，放入装有5 mL 5%葡萄糖溶液的试管中，于38 ℃条件下活化25 min，将活化好的酵母菌加入已灭菌的沙棘汁中，于37 ℃恒温培养箱中发酵至酒精度符合GB/T 31121—2014《果蔬汁类及其饮料》要求（轻度发酵饮料酒精度＜0.5%vol），沙棘汁发酵液酒精度达到0.4%vol约需18 h，此时终止发酵。
杀菌：将发酵好的沙棘汁进行巴氏杀菌（75 ℃，20 min）后，于4 ℃保存备用，即得发酵沙棘汁成品。
1.3.2 理化指标的测定
总酚含量采用福林酚法[12]进行测定，以没食子酸作为标准物质，以质量浓度（X）为横坐标，吸光度值（Y）为纵坐标，绘制没食子酸标准曲线，得到其标准曲线回归方程Y=0.06X+0.039 7，相关系数R2=0.998 4。测量样品在波长765 nm处的吸光度值，利用标准曲线回归方程计算样品中的总酚含量，并进行3次实验以获得平均值。
总黄酮含量参照GUO Y等[13]的方法进行测定，以芦丁作为标准物质，以芦丁质量浓度（X）为横坐标，吸光度值（Y）为纵坐标，绘制芦丁标准曲线，获得标准曲线回归方程Y=3.35X+0.000 3，相关系数R2=0.994 8。使用紫外分光光度计在波长508 nm处测量样品的吸光度值，根据标准曲线回归方程计算样品中的总黄酮含量，并进行3次实验以获得平均值。
颜色参数：采用色差仪进行测定[14]；酒精度：采用酒精计[15]进行测定。
1.3.3 有机酸含量的测定
酒石酸、苹果酸、琥珀酸、柠檬酸4种有机酸参照GB 5009.157—2016《食品安全国家标准食品有机酸》中规定的方法进行测定。
1.3.4 抗氧化能力的测定
DPPH自由基清除能力和ABTS+自由基清除能力：参照刘原野等[16]的方法测定；·OH自由基清除能力：使用分光光度法[17-18]测定。
1.3.5 挥发性风味物质的测定
采用HS-SPME-GC-MS[19]法测定发酵沙棘汁中挥发性风味物质的含量。
样品预处理：将5 mL样品和1g NaCl放入20 mL顶空小瓶中，并加入10 μL（S）-（+）-2-辛醇溶液（1 000 μg/L）作为内标。其次，顶空瓶置于45 ℃平衡15 min后，将萃取头插入顶空瓶中萃取30 min，从样品中提取挥发性化合物。最后，将萃取头插入气相色谱（GC）进样口解吸（240 ℃，5 min）。
色谱条件：采用不分流模式，进样口温度240 ℃。升温程序为初始温度40 ℃保持2 min，然后以3 ℃/min的速率升至85 ℃，然后以1 ℃/min的速率升至105 ℃，然后以3 ℃/min的速率升至180 ℃，最后以10 ℃/min的速度升温至230 ℃，并在230 ℃下保持5 min。
质谱条件：电子电离（electron ionization,EI）源，离子源温度230 ℃，电子能量为70 eV，质量扫描范围35～750 amu。
定性定量分析：基于与美国国家标准与技术研究所（national institute of standards and technology，NIST）2017和Wiley 8.0数据库对样品中的挥发性化合物定性，采用内标法进行定量。并采用CAI W C等[20]描述的方法计算，其计算公式如下：
式中：C为挥发性化合物的相对质量浓度，μg/L；S为挥发性化合物的峰面积；S内为内标的峰面积；C内为内标的质量浓度，μg/L。
使用挥发性风味物质的含量与其阈值的比值计算挥发性化合物的气味活度值（odor activity value，OAV）[16]，其计算公式如下：
1.3.6 数据处理
每个试验均重复3次，结果以“平均值±标准差”表示，统计检验的显著水平为0.05，利用SPSS 25进行方差分析，并使用Origin 2022b软件绘图。
2 结果与分析
2.1 理化指标检测结果
黄酮和酚类物质是天然的抗氧化剂，具有抗氧化活性[21]。由表1可知，带籽组、去籽组、果肉破碎组发酵沙棘汁的可溶性固形物含量、pH均分别为12.00 °Bx、3.96。带籽组发酵沙棘汁中的总黄酮及总酚含量分别为（247.87±4.56）μg/mL、（264.92±5.47）μg/mL，均显著高于其他两种组别（P＜0.05）。同时，从色差结果可知，带籽组发酵沙棘汁的a*值、b*值最高，这可能是由于在发酵过程中黄酮及酚类物质被分解成小分子物质，从而使其颜色发生了变化[16]。发酵沙棘汁明亮的黄色是影响其消费者接受度的重要参数[22]，因此，带籽组发酵的沙棘汁颜色较佳。
表1 不同前处理发酵沙棘汁的理化指标
Table 1 Physicochemical indexes of fermented seabuckthorn juice with different pretreatment
注：同行不同字母表示差异显著（P＜0.05）。下同。
指标 带籽组 去籽组 果肉破碎组可溶性固形物含量/°Bx pH总黄酮含量/（μg·mL-1）总酚含量/（μg·mL-1）色度L*值a*值b*值247.87±4.56a 264.92±5.47a 43.06±0.2c 44.09±0.14a 163.24±0.67a 12.00±0.20 3.96±0.02 191.6±15.07c 177.7±4.59c 48.31±0.19b 26.26±0.55b 147.07±0.87c 188.16±17.24b 194.09±1.45b 49.25±0.05a 23.14±0.32c 156.14±0.73b
2.2 有机酸含量检测结果
4种沙棘中最常见的重要有机酸为酒石酸、苹果酸、柠檬酸和琥珀酸[23]，其可以影响沙棘汁感官特性[4]，使用HPLC测定不同处理组发酵沙棘汁中的有机酸含量，结果见图1。
图1 不同处理组发酵沙棘汁的有机酸含量检测结果
Fig.1 Determination results of organic acids contents of fermented seabuckthorn juice with different pretreatment
由图1可知，在三组处理中，带籽处理组发酵沙棘汁的4种有机酸总含量最高（9.4±0.12）g/L，去籽处理组次之（8.36±0.11）g/L，果肉破碎处理组最低（6.53±0.11）g/L。苹果酸具有呈尖锐的酸味，它可以作为酵母菌生长所需的碳源[24]，酒石酸是一种羧酸，它与柠檬酸一起提供酸味，琥珀酸略带咸苦味[25]，在带籽处理组中，苹果酸、酒石酸、柠檬酸、琥珀酸含量均最高，分别为（4.31±0.33）μg/mL、（3.23±0.21）μg/mL、（1.57±0.13）μg/mL、（0.29±0.05）μg/mL，而果肉破碎组的4种有机酸含量均为最低值。在4种有机酸中，带籽处理组发酵沙棘汁发酵沙棘汁中苹果酸、酒石酸的比例分别为34.34%、45.89%，低于其他处理组。由此可见，带籽组发酵沙棘汁的酸味较其他处理组更温和，口感更好。
2.3 抗氧化能力测定结果
抗氧化能力是提高水果和蔬菜营养价值的重要因素，饮料中的抗氧化成分可以减少脂质氧化，预防心血管疾病[26]。3种前处理发酵沙棘汁的抗氧化能力测定结果见表2。由表2可知，相比于去籽组和果肉破碎组，带籽组发酵沙棘汁的ABTS+自由基清除率[（88.40±2.12）%]、羟自由基（·OH）清除率[（87.47±1.78）%]均最高。去籽组发酵沙棘汁的ABTS+、羟自由基清除率均最低，果肉破碎组发酵沙棘汁的DPPH自由基清除率最低，其原因可能是沙棘果与沙棘籽中富含的酚类、黄酮类等天然生物活性成分具有很强的抗氧化作用[27]。
表2 不同前处理发酵沙棘汁的抗氧化能力测定结果
Table 2 Determination results of antioxidant capacity of fermented seabuckthorn juice with different pretreatment
带籽组 去籽组 果肉破碎组ABTS+自由基清除率/%DPPH自由基清除率/%·OH清除率/%88.40±2.12a 71.26±1.18b 87.47±1.78a 83.16±1.16c 72.47±2.09a 81.13±2.62c 85.17±1.77b 66.27±1.76c 82.50±2.07b
2.4 Pearson相关性分析
对总黄酮、总酚、有机酸含量、抗氧化能力及颜色参数进行了相关性分析，结果见图2。由图2可知，总酚与ABTS+自由基清除能力、羟自由基清除能力、L*值、b*值呈显著正相关（P＜0.05），这说明酚类物质是影响发酵沙棘汁颜色和抗氧化能力的重要原因之一。总黄酮与a*值、酒石酸、苹果酸、琥珀酸、柠檬酸呈显著正相关（P＜0.05），黄酮和酚类物质是一种天然的抗氧化剂，具有抗菌、抗肿瘤等作用[17]，而有机酸可以有效地影响沙棘浆果的感官特性，这些因素对消费者的市场接受度起着重要作用[28]。综上，带籽处理是一种较好的前处理方式。
图2 理化指标、有机酸含量、抗氧化能力及色度的Pearson相关性分析
Fig.2 Pearson correlation analysis of physicochemical properties,organic acids contents, antioxidant activity and chromacity
2.5 挥发性风味化合物分析
使用HS-SPME-GC-MS技术对不同处理组发酵沙棘汁的挥发性风味化合物进行分析，结果见表3。
表3 不同处理组发酵沙棘汁的挥发性风味化合物含量
Table 3 Volatile flavor compounds contents of fermented sea buckthorn juice with different pretreatment
挥发性化合物种类醇类酸类酯类醛类酮类其他总计带籽组挥发性化合物数量/种含量/（μg·L-1）含量/（μg·L-1）去籽组挥发性化合物数量/种8 8 4 1 4 3 7 7 1 195.66±19.41a 11.07±1.81b 823.22±86.97a 0.34±0.09a 3.38±0.64a 7.12±1.59a 1 040.77±108.30a 10 7 38 1 4 1 0 70 101.55±22.06c 21.87±3.51a 483.95±86.18c 0.03±0.01b 2.04±0.41b 3.73±0.72c 613.13±109.15c果肉破碎组挥发性化合物数量/种 含量/（μg·L-1）11 7 28 2 5 4 5 7 160.30±37.00b 22.68±1.48a 776.85±82.20b 0.22±0.04a 1.68±0.15c 4.77±0.49b 966.47±118.10b
由表3可知，3个处理组发酵沙棘汁中共检出106种挥发性化合物，其中，醇类16种，酸类12种，酯类51种，醛类5种，酮类7种，其他类化合物15种。发酵沙棘汁中酯类和醇类种类多，是主要化合物。带籽发酵的沙棘汁中挥发性风味化合物为71种，挥发性风味化合物含量为（1 040.77±108.30）μg/L，去籽处理组挥发性风味化合物为70种，挥发性风味化合物含量为（613.13±109.65）μg/L，果肉破碎组挥发性风味化合物为57种，挥发性风味化合物含量为（966.47±118.10）μg/L，3个处理组中的挥发性化合物含量有显著性差异（P＜0.05）。
酯类是发酵沙棘汁中含量最高的挥发性化合物。酯类物质是酵母在发酵过程中产生的次级代谢产物[29]，是发酵饮料中含量最高和最重要的风味化合物之一[30]，酯类物质在化学结构差异上主要分为乙酯和乙酸酯[20]，3组发酵沙棘汁中共检测出19种乙酯和6种乙酸酯，其中含量最高的物质为正己酸乙酯（果香）、异戊酸乙酯（类似苹果、香蕉的香气和酸甜气味）、辛酸乙酯（类似于白兰地的香气）、苯甲酸乙酯（类似冬青油和依兰油的香气）、乙酸异戊酯（愉快的香蕉味）等，乙酯和乙酸酯类化合物含量在带籽处理组中最高（259.00 μg/L），其主要提供果香和花香，这对发酵沙棘汁的香气有积极的影响。
醇类物质是发酵沙棘汁中的第二大类挥发性化合物，带籽处理的发酵沙棘汁中醇类物质含量最高[（195.66±19.41）μg/L]，果肉破碎组次之[（160.30±37.00）μg/L]，去籽组醇类物质含量最低[（101.55±22.06）μg/L]。醇是由酵母菌通过糖或氨基酸的代谢产生的，是酵母发酵饮料中主要芳香化合物，可以促进香味协调[30-31]，同时是生产酯的重要前体。异戊醇、正庚醇、辛醇、1-壬醇、苯甲醇被描述为白兰地香气、柑橘香气、脂蜡香气、玫瑰花蜡香气、芳香气味，这些化合物相对含量较高，对发酵沙棘汁的香气有积极的贡献。此外，还检测到少量的的酸类、醛类、酮类及其他类化合物，这些挥发性物质共同构成了发酵沙棘汁的香气。
为了研究不同前处理对酵母菌发酵沙棘汁香气成分的差异，对气味活度值（OAV）进行计算，OAV≥1的挥发性化合物被认为对风味具有贡献[16]，3个处理组的发酵沙棘汁中共有OAV＞1的17种挥发性化合物见表4。由表4可知，在3个处理组的发酵沙棘汁中，丁酸乙酯、2-甲基丁酸乙酯、异戊酸乙酯、乙酸异戊酯、丁酸异戊酯、异戊酸异戊酯、庚酸乙酯、己酸异戊酯等酯类的OAV显著高于阈值，它们赋予了发酵沙棘汁苹果、菠萝、香蕉等果香；异戊醇、正己醇、正庚醇、辛醇的气味活度值均高于阈值，赋予了发酵沙棘汁白兰地香气、果香和脂蜡香气，其中辛醇仅在带籽处理组沙棘汁中OAV＞1，这为沙棘汁增加了干甜而尖锐的脂蜡香气和柑橘、橙皮及玫瑰样的气息。综上所述，在带籽处理组中，芳香化合物的含量显著高于其他两组（P＜0.05），因此带籽发酵的沙棘汁香味更加协调，醇香、果香更为浓郁。
表4 17种挥发性风味物质的气味活度值
Table 4 Odor activity value of 17 volatile flavor compounds
注：“-”表示未检出。
种类 中文名称 阈值/（μg·L-1）[32] 香气描述[32]带籽组OAV去籽组 果肉破碎组醇类有苹果白兰地香气和辛辣味有淡青的嫩枝叶气息，微带酒香、果香和脂肪气息有油脂气息和辛辣香气，近似柑橘香气有干甜而尖锐的脂蜡香气，又带有柑橘、橙皮和玫瑰样的气息菠萝芳香气味呈强烈苹果皮、菠萝皮和未成熟李子皮香气酯类异戊醇正己醇正庚醇辛醇丁酸乙酯2-甲基丁酸乙酯异戊酸乙酯乙酸异戊酯正己酸乙酯丁酸异戊酯异戊酸异戊酯庚酸乙酯辛酸乙酯己酸异戊酯癸酸乙酯苯甲酸乙酯苯甲酸异戊酯316.28 17.29 60.79 1.11 24.53 2 293.29 60 329.32 545.25 280.46-181.58 6.34 9.59 3.52 3.08 3.10 2.14 217.98 3.89 8.88-13.89 735.76 24 567.84 616.75 129.58 2.04 108.37 4.27 9.98 2.06 3.44 2.02 1.38 323.53 9.22 24.32-27.55 4 057.23 52 014.65 835.41 205.20 2.33 145.29 10.45 16.84 4.06 11.04 4.6 2.45 0.004 0.005 6 0.005 4 0.11 0.000 9 0.000 013 0.000 01 0.000 15 0.005 0.015 0.02 0.001 9 0.019 3 0.32 0.005 0.055 56 0.25类似苹果、香蕉的香气和酸甜气味有愉快的香蕉香味有水果香气味具有强烈的香蕉、洋梨芳香气味具有苹果、香蕉等水果香气有菠萝香气味有类似白兰地的香气，并有甜味呈苹果和菠萝似香味有椰子香味具有类似冬青油和依兰油的香气有水果似刺激臭味
3 结论
本研究分别采用带籽打浆、去籽打浆及果肉破碎3种预处理方式制备沙棘汁，并经酵母菌发酵通过测定总黄酮含量、总酚含量、有机酸含量、抗氧化能力及挥发性风味化合物等指标综合性评价不同预处理对发酵沙棘汁品质的影响。结果表明，带籽发酵的沙棘汁总黄酮、总酚含量最高，分别为（247.87±45.6）μg/mL、（264.92±5.47）μg/mL；有机酸含量也显著高于其他处理组，结合相关性分析表明这可能是带籽发酵沙棘汁的抗氧化能力高的原因。通过HS-SPMEGC-MS挥发性化合物分析，带籽发酵沙棘汁的芳香挥发性化合物种类、相对含量显著高于其他处理组。因此，带籽打浆处理是制作发酵沙棘汁的一种有效的预处理方法，这为发酵沙棘汁的开发提供了理论依据和技术支撑。
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