膳食纤维是一种不能被人体吸收利用的非淀粉性多糖[1]，被誉为“第七营养素”[2]，具有降胆固醇、控制血糖、改善肠道功能紊乱等生理功能，对人体健康有显著的调理作用[3-5]，是人们膳食中重要的营养素，成为目前推崇的保健食品的原辅料功能成分，广泛应用在食品添加剂领域[6]。膳食纤维按溶解性不同分为可溶性膳食纤维（soluble dietary fiber，SDF）和不溶性膳食纤维（insolubledietaryfiber，IDF）[7]，两者比例对膳食纤维的功能特性影响较大[8-9]，SDF在许多方面比IDF有更强的生理功能，如控制血糖、降低胆固醇，预防心脏病、肠胃病及糖尿病[10-11]，而IDF则主要改善肠道功能。因此，通过提高膳食纤维中SDF含量，就可以提高膳食纤维品质，增加膳食纤维的功能活性和应用价值。
麦糟是啤酒生产的主要副产物[12]，含有丰富的非淀粉多糖[13-15]，是宝贵的膳食纤维资源，但麦糟中SDF含量不足，大约只占3%左右[16]，其生理活性低，应用价值不高。我国是啤酒生产大国，麦糟产量巨大，据统计，2020年啤酒产量达3 411万m3，产生湿麦糟约6.8亿t[17]，多年来啤酒厂多以粗饲料出售，部分以废弃物排放，不仅造成了环境污染，也是资源的极大浪费[18]，因此，对麦糟进行开发应用研究势在必行。国内外已有研究表明，麦糟是一种可以为人体利用的良好膳食纤维来源，尝试采用不同的提取和改性方法提高SDF比例，提高麦糟膳食纤维的功能特性[19]。NAIBAHO J等[20]用高压釜对麦糟进行改性处理，改善了麦糟SDF与IDF的组成比例、水化性能和持油能力。HE Y H等[21]用氢氧化钠和碱性蛋白酶处理麦糟，得到高膳食纤维产品和高蛋白产品。卜雯丽等[22]采用出芽短梗霉发酵麦糟制备膳食纤维，使SDF占总膳食纤维含量23.76%。
灵芝是公认的药食两用的安全生产菌株，具有降解和转化植物细胞壁纤维组分的酶系[23]，通过对木质素、纤维素等IDF的降解和生物转化，使麦糟中SDF含量增加，同时生成的菌体多糖和菌体纤维素进一步提高麦糟膳食纤维生理活性[24-25]。目前灵芝在膳食纤维生产中已有使用，而用灵芝发酵麦糟制备膳食纤维尚未见报道，因此有必要对此进行研究。
本试验采用灵芝对麦糟进行固态发酵，研究发酵过程中料水比、接种量、发酵温度、发酵时间对麦糟SDF含量的影响，采用响应面法优化其发酵条件，以获得高品质膳食纤维，并对发酵前后麦糟膳食纤维的理化特性进行对比，为灵芝固态发酵制取麦糟膳食纤维的应用提供理论基础。
1 材料与方法
1.1 材料与试剂
1.1.1 供试菌种灵芝（Ganoderma lucidum）：河南省工业微生物资源与发酵技术重点实验室提供。
1.1.2 材料与试剂
麦糟：南阳市京德啤酒技术开发有限公司（干燥，粉碎过60目筛）；葡萄糖、磷酸二氢钾、硫酸镁（均分析纯）：天津市科密欧化学试剂有限公司；琼脂粉（生化试剂）：北京澳博星生物技术有限责任公司；马铃薯：市售。
1.1.3 培养基
马铃薯葡萄糖琼脂（potato dextrose agar，PDA）培养基[26]：马铃薯200 g，葡萄糖20 g，琼脂20 g，加蒸馏水1 L。种子培养基：马铃薯200 g，葡萄糖20 g，加蒸馏水1 L。发酵培养基：麦糟5 g，葡萄糖0.13 g，磷酸二氢钾0.018 g，硫酸镁0.013 g，根据不同的料水比添加水。
以上培养基均在115 ℃高压蒸汽灭菌30 min。
1.2 仪器与设备
LDZW型立式压力蒸汽灭菌锅：上海申安医疗器械厂；SW-CJ-2G型双人净化工作台：苏州净化设备有限公司；SPX-300-Ⅲ型生化培养箱：上海跃进医疗器械有限公司；TDL·40C型离心机：上海安亭科学仪器总厂；DHG-9146A型电热恒温鼓风干燥箱：上海精宏实验设备有限公司；MQD-A3型三层叠加式振荡培养箱：上海旻泉仪器有限公司。
1.3 试验方法
1.3.1 菌种活化及平板培养
将配好的PDA培养基制成试管斜面和平板，在无菌条件下，用接种铲将保藏灵芝菌种接种到试管斜面，25 ℃培养7 d进行活化，可重复2～3次。然后将活化的试管菌种转接至平板上，在25 ℃恒温培养至菌丝长满平板，作为下一步供试菌种。
1.3.2 种子液制备
将配好的种子培养基分装于250 mL三角瓶中，每瓶装120 mL培养基和6粒玻璃珠，封口膜封口，121 ℃灭菌20 min，备用。取出平板菌种，在无菌环境下，用Φ12 mm打孔器取出3块灵芝菌块接入三角瓶中，150 r/min、25 ℃摇床培养4 d，获得种子液，供麦糟发酵使用。
1.3.3 麦糟膳食纤维发酵试验
称取麦糟5.0 g置于250 mL三角瓶中，包扎，121 ℃灭菌20 min；另取一50 mL三角瓶，加入拌料所需水量，将葡萄糖、磷酸二氢钾、硫酸镁按比例加入溶解，包扎灭菌，取出冷却至室温，加入所需量的种子液，混匀，制成含菌拌料溶液，加到已灭菌的固体麦糟中，完成拌料和接种，于培养箱中恒温培养，结束后干燥至质量恒定，即得麦糟膳食纤维产品。
1.3.4 发酵麦糟膳食纤维中SDF的测定[27-28]
将膳食纤维发酵样品研碎，过60目筛，准确称取2.00 g，加入60 mL蒸馏水，在90 ℃水浴振荡浸提30 min，冷却至室温，4 000 r/min离心20 min，得上清液，加入4倍体积的无水乙醇，4 ℃静置沉淀过夜，沉淀用无水乙醇洗涤离心2次，再加丙酮洗涤离心1次，干燥至质量恒定即为SDF。SDF含量计算公式如下：
1.3.5 发酵工艺优化单因素试验设计
麦糟发酵以料水比1∶1.8（g∶mL）、接种量20%（种子液体积占麦糟质量的百分含量）、发酵温度25 ℃、发酵时间10 d为基础条件，以SDF含量为考察指标，分别通过改变料水比（1∶1.0、1∶1.4、1∶1.8、1∶2.2、1∶2.6（g∶mL））、接种量（5%、10%、15%、20%、25%）、发酵温度（21 ℃、23 ℃、25 ℃、27 ℃、29 ℃），和发酵时间（8 d、9 d、10 d、11 d、12 d），考察不同条件对发酵麦糟膳食纤维中SDF含量的影响。
1.3.6 发酵工艺优化响应面试验设计
应用Minitab软件中的Box-Behnken设计构建模型[29]，通过响应曲面法寻找最优发酵条件。以接种量、料水比、发酵温度3个因素为自变量，以SDF含量为响应值，进行3因素3水平响应面试验，各因素及水平见表1。
表1 麦糟发酵条件优化响应面试验因素与水平
Table 1 Factors and levels of response surface tests for fermentation conditions optimization of brewer's spent grains
因素A 接种量/%B 料水比（g∶mL）C 发酵温度/℃-1水平0+1 15 1∶1.4 23 20 1∶1.8 25 25 1∶2.2 27
1.3.7 持水力、持油力及膨胀力的测定
按照文献[30]所述方法进行测定。
1.3.8 数据处理
每个试验重复3次，利用Excel 2007进行绘图，用SPSS 18.0对单因素试验数据进行方差分析，用Minitab15.1.0.0和Design Expert 12软件进行响应面试验设计及数据分析。
2 结果与分析
2.1 发酵工艺优化单因素试验
2.1.1 料水比对麦糟膳食纤维含量的影响
由图1可知，不同料水比对SDF含量有明显影响，随着加水量的增加，发酵麦糟膳食纤维中SDF含量呈现先上升后下降趋势，当料水比为1∶1.8（g∶mL）时，SDF含量最高，这与余有贵等[31]研究的结果（灵芝发酵基质水含量为63.13%）基本一致。当含水量低时，培养基干燥，物料吸水不足，灵芝的正常生长和产酶受到影响。当含水量过高时，培养物透气性差，影响溶氧和CO2的排出，也不利于菌体的生长。因此，选择料水比1∶1.4～1∶2.2（g∶mL）进行后续响应面试验。
图1 不同料水比对可溶性膳食纤维含量的影响
Fig.1 Effect of different solid-liquid ratios on the content of soluble dietary fiber in brewer's spent grains
不同字母表示差异显著（P＜0.05）。下同。
2.1.2 接种量对麦糟膳食纤维含量的影响
由图2可知，随着接种量的增加，SDF含量呈先上升后下降趋势，当接种量＜20%时，菌体生长总量少，菌体分泌水解酶的量少，不能充分降解植物细胞壁，SDF产生少。当接种量为20%时，SDF含量最高；但当接种量＞20%时，培养基中有限的营养物质不能满足微生物的大量繁殖和产酶，SDF产生少甚至会被消耗[22]。因此，选择接种量15%～25%进行后续响应面试验。
图2 不同接种量对可溶性膳食纤维含量的影响
Fig.2 Effect of different inoculum on the content of soluble dietary fiber in brewer's spent grains
2.1.3 发酵温度对麦糟膳食纤维含量的影响由图3可知，在发酵温度21～25 ℃时随着发酵温度的上升，SDF含量呈增加的趋势，25 ℃时SDF含量达到最大值，超过25 ℃时SDF含量下降。温度是影响微生物繁殖和产酶的重要因素，同时也影响酶的活性和酶促反应的进行，温度较低会抑制灵芝生长速度、产酶速度和酶活，过高的温度会减缓灵芝生长，加速菌种老化死亡，发酵周期缩短，使SDF含量显著降低。韦玉芳等[32]研究发现，灵芝菌在25 ℃时生长速度最快，20～28 ℃分解纤维素效果最好，发酵温度25 ℃时纤维素降解率最高，这与本试验结果一致。因此，选择发酵温度23～27 ℃进行响应面试验。
图3 不同发酵温度对可溶性膳食纤维含量的影响
Fig.3 Effect of different fermentation temperature on the content of soluble dietary fiber in brewer's spent grains
2.1.4 发酵时间对麦糟膳食纤维含量的影响
由图4可知，随着发酵时间的增加，SDF含量呈先升后降趋势。当发酵时间小于11 d时，由于发酵时间过短菌体繁殖不充分，酶产生及酶降解反应受限，SDF产生少，发酵时间为11 d时，发酵物中SDF含量最高。但发酵时间过长时，菌体衰老，酶活降低，培养基中积累的代谢产物会影响SDF产生，同时培养基中的营养物质缺乏，SDF被分解利用，使SDF含量下降。考虑到发酵时间对SDF含量变化整体影响较小，因此后续优化试验固定发酵时间为11 d。
图4 不同发酵时间对可溶性膳食纤维含量的影响
Fig.4 Effect of different fermentation time on the content of soluble dietary fiber in brewer's spent grains
2.2 发酵工艺优化响应面试验
基于表1响应面试验设计方案进行试验，以接种量（A）、料水比（B）、发酵温度（C）3个因素为自变量，以SDF含量（Y）为响应值进行优化试验，响应面试验结果见表2。对试验数据进行分析，回归模型的方差分析结果见表3。
表2 麦糟发酵条件优化响应面试验设计与结果
Table 2 Design and results of Box-Behnken tests for fermentation conditions optimization of brewer's spent grains
试验号 A B C Y SDF含量/%1234567891 0-1 1-1 1-1 1-1-1-1 110000-0000-1-1 11-1-1 11 12 13 14 15 10000000 11-11000 11000 7.62 6.92 8.12 7.36 6.05 6.13 8.01 6.41 6.56 6.91 7.58 8.37 8.76 8.87 8.83
表3 回归模型方差分析
Table 3 Variance analysis of regression model
注：“**”表示对结果影响极显著（P＜0.01）；“*”表示对结果影响显著
（P＜0.05）。
来源 平方和 自由度 均方 F 值 P 值 显著性模型ABCA B********AC BC A2 B2 C2残差误差失拟纯误差合计91111111115321 4 13.39 1.11 0.540 8 2.780 0 0.000 9 0.705 6 0.048 4 3.77 0.343 5 4.97 0.018 8 0.012 7 0.006 2 13.41 1.49 1.11 0.540 8 2.78 0.000 9 0.705 6 0.048 4 3.77 0.343 5 4.97 0.003 77 0.004 22 0.003 10 394.69 294.44 143.45 738.67 0.2387 187.16 12.84 999.08 91.11 1 317.87＜0.000 1＜0.000 1＜0.000 1＜0.000 1 0.645 8＜0.000 1 0.015 8＜0.000 1 0.000 2＜0.000 1*********1.36 0.450 2
经Design-Expert 12软件进行响应面回归分析，拟合得到以灵芝发酵麦糟中SDF含量为响应值的回归方程为：
由表3可知，接种量、料液比和发酵温度三因素对发酵麦糟膳食纤维中SDF含量影响强弱关系为：发酵温度＞接种量＞料水比。其中，一次项A、B、C和二次项A2、B2、C2及交互项AC对结果影响极显著（P＜0.01），交互项BC对结果影响显著（P＜0.05），交互项AB对结果影响不显著（P＞0.05）。
模型方差分析结果显示，模型P＜0.01，表明该二次方程模型具有高度的显著性；失拟项P值为0.450 2，大于0.05，表示失拟不显著；决定系数R2=0.998 8，调整决定系数R2Adj=0.996 6，表明该模型充分拟合试验数据，可以用该模型预测灵芝发酵麦糟制备高品质麦糟膳食纤维在不同参数条件下的SDF含量的高低，确定出最佳工艺条件。
根据回归方程得出不同因子间交互作用的响应面和等高线图见图5。曲面坡度越陡，等密度线越密，表明响应值对工艺操作条件的改变越敏感，两因素交互作用越显著。由图5可知，A与C交互作用的响应图最陡峭、等密度线密度最大，说明其对SDF含量的影响最显著，其次是B与C交互作用影响较大，这与表3回归模型方差分析结果一致。
图5 各因素间交互作用对可溶性膳食纤维含量影响的响应面和等高线
Fig.5 Response surface plots and contour lines of effects of interaction between various factors on the contents of soluble dietary fiber
用Design-Expert 12软件对二次回归方程中的响应值求最大值，得到极值点为：A=-0.252 5，B=0.494 9，C=0.333 3，计算得出接种量为18.74%、料水比为1∶1.99（g∶mL）、发酵温度为25.67 ℃，预测发酵麦糟SDF含量为9.027%。为了实际操作可控，将发酵条件修正为：接种量19%、料水比1∶2（g∶mL）、发酵温度26 ℃，在此条件下发酵11 d，试验重复3次，测定发酵后麦糟膳食纤维中SDF含量分别为8.98%、9.01%、8.96%，平均实际值为8.98%，相对于理论值相对误差为0.52%，说明该模型可较好地预测实际发酵情况。
2.3 发酵前后麦糟膳食纤维理化性质比较
对发酵前和发酵后麦糟膳食纤维持水力、持油力及膨胀力进行测定，其结果见表4。
表4 麦糟膳食纤维理化性质
Table 4 Physicochemical properties of dietary fiber of brewer's spent grains
样品 持水力/（g·g-1）持油力/（g·g-1）膨胀力/（mL·g-1）发酵前发酵后1.88 2.67 0.87 2.03 1.85 4.69
麦糟经灵芝菌发酵后，其膳食纤维的结构和成分组成均会发生变化，膳食纤维中的SDF比例大大增加，显示出较好理化性质。由表4可知，发酵后的膳食纤维理化特性指标均优于未发酵原料，其持水力、持油力和膨胀力都获得了显著的提高，比发酵前分别提高了42.02%、133.33%与153.51%，这是由于菌体代谢使麦糟原有的致密结构遭到降解破环，结构疏松，油水更容易进入，其膨胀性增大，持水力和持油力增加。麦糟膳食纤维理化特性的提升，使其具备更强的生理功能和用途，可作为稳定剂、增稠剂、膨松剂和功能性添加剂应用于食品行业中。
3 结论
本试验利用灵芝菌固态发酵麦糟提高SDF含量，增加麦糟膳食纤维的应用价值。以单因素试验结果为基础，利用Box-Behnken设计响应面试验分析得到灵芝发酵制备麦糟膳食纤维的最佳发酵工艺条件为：接种量19%、料水比1∶2（g∶mL）、发酵温度26 ℃、发酵时间11 d，该条件下麦糟膳食纤维中SDF含量达8.98%。分析发酵前后膳食纤维理化性质的变化，发现经过发酵处理其理化性质明显改善，持水力、持油力和膨胀力比发酵前分别提高了42.02%、133.33%与153.51%。实验结果说明，运用灵芝固态发酵制备麦糟膳食纤维方法可行，SDF含量提高，功能特性改善，结果为麦糟膳食纤维的工业化生产提供了理论依据，也减少了污染和资源浪费。
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