天麻（Gastrodia elata）、灵芝（Ganoderma lucidum）、杜仲（Eucommiae ulmoides）是贵州道地的药食同源植物，因其品质上乘，历史悠久，又被誉为“贵州三宝”。天麻是兰科属植物，富含酚类物质、天麻素、天麻多糖、蛋白质、多种氨基酸、维生素A等多种活性成分和微量元素，具有镇静催眠、抗炎、抗衰老、改善记忆、免疫调节等功效[1-3]。灵芝是我国名贵的中药材，其药用价值很高，含有灵芝三萜、灵芝多糖、多种蛋白质和氨基酸。灵芝具有促进消除自由基、调节代谢平衡、增强免疫/延缓衰老等作用，在保健食品以及化妆品领域得到广泛的运用[4-5]。杜仲含有丰富的木质类素、酚类、黄酮类等化合物[6]，其中香豆酸、原儿茶酸、绿原酸、阿魏酸和咖啡酸等具有较强的抗氧化作用[7]。酒中的乙醇为多种抗氧化物质的最佳溶剂，非常有利于抗氧化活性物质的溶出、保存和在体内的吸收。贵州三宝酒含有丰富的植物多糖、总黄酮类化合物、氨基酸以及维生素等功能成分，而这些活性成分都具有较好的抗氧化、延缓衰老以及增强免疫等功效[8]。因此，研究贵州三宝酒的抗氧化、抗衰老等功效作用具有重要的意义。
采用D-半乳糖制备亚急性衰老模型是一种较为快速、成熟的方法[9-10]。D-半乳糖可直接导致小鼠肝细胞衰老，致使肝功能损伤，如坏死细胞增多、凋亡细胞、炎症细胞浸润等从而使得肝功能减退[11]。超氧化物岐化酶（superoxide dismutase，SOD）是影响人体氧化和抗氧化均衡的关键，它可以清除超氧阴离子自由基，降低具有毒性的羟基自由基，保护细胞和组织[12]。谷胱甘肽过氧化物酶（glutathione peroxidase，GSH-Px）在人体中具有催化过氧化氢，起到分解的主要作用，通过除去脂质过氧化氢，以保护细胞膜的结构与功能[13]。谷胱甘肽（glutataione，GSH）是一种重要的抗氧化和自由基清除剂，能够清除细胞内自发或酶促反应而引起的自由基，减少体内氧化应激物质的堆积，能够有效地防止人体受到活性氧的损害[14]。丙二醛（malondialdehyde，MDA）实质上是脂质过氧化作用所产生的产物，测定MDA含量常常会反映人体的体内脂质过氧化作用，表达出人体的细胞受自由基攻击的严重性，间接地反映出细胞的损害性程度[15]；肿瘤坏死因子-α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）是一种重要的生物活性炎症因子，它可以参与炎症反应、细胞活性、细胞凋亡等多种活动，反映肝细胞和炎症损伤程度[16]。白细胞介素-4（interleukin-4，IL-4）、白细胞介素-6（interleukin 6，IL-6）等炎症因子的活化增强了氧化应激反应和炎症反应，增强了D-半乳糖对人体的损害。
本研究通过D-半乳糖构建衰老小鼠的氧化损伤模型，研究贵州三宝酒对D-半乳糖所致亚急性衰老模型小鼠体质量、脏器指数、血清以及脑组织SOD、MDA、GSH、GSH-Px等指标的影响，对贵州三宝酒的抗氧化、延缓衰老作用进行验证；同时检测肝组织的炎症因子，并采用苏木精-伊红染色（hematoxylin-eosin staining，HE）法对肝组织进行观察，分析贵州三宝酒对肝组织的保护作用，以期为同类药食同源植物类配制酒的开发与利用提供新的思路。
1 材料与方法
1.1 材料与试剂
1.1.1 材料与动物
天麻：大方县九龙天麻开发有限公司；灵芝：贵州万众康源家庭农场有限公司；杜仲：贵州省遵义市桐梓县官仓镇朱天村；酱香型基酒（酒精度为53%vol）：贵州省仁怀市贵州窖中藏酒业销售有限公司。
60只无特定病原体（specific pathogen free，SPF）级雄性KM小鼠（生产许可证号：SCXK京2019-0010，体质量（20±2）g，饲养条件：温度（22±2）℃、相对湿度（55±5）%、照明时间每天12 h、自由饮水和进食）：重庆腾鑫生物技术有限公司。
1.1.2 试剂
D-半乳糖（纯度≥99%）：美国Sigma公司；GSH-Px、SOD、MDA、GSH检测试剂盒：南京建成生物工程研究所；IL-4、IL-6、TNF-α酶联免疫吸附测定（enzyme-linked immuno sorbent assay，ELISA）试剂盒：上海索莱宝生物技术有限公司；4%多聚甲醛、磷酸缓冲盐溶液（phosphate buffer saline，PBS）：美国BOSTER公司；乙醇、二甲苯（均为分析纯）、切片石蜡：上海国药集团化学试剂有限公司。其他试剂均为国产分析纯。
1.2 仪器与设备
BS-210S型电子天平：北京赛多利斯仪器有限公司；TG-18W离心机：赛默飞世尔科技有限公司；VICTOR Nivo酶标仪：珀金埃尔默企业管理有限公司；SPX-100生化培养箱：上海博讯实业有限公司；Histocore BIOCUT切片机：德国leica公司；JT-12脱水机、JB-L5包埋机：武汉俊杰电子有限公司；SX-BHC-1000A2生物安全柜：苏信环境科技有限公司。
1.3 方法
1.3.1 贵州三宝酒的制备工艺流程[17]
操作要点：
原材料预处理：选用无霉变、干净、质量上乘的天麻、灵芝、杜仲，将其切片、粉碎，备用。
天麻浸提液、杜仲浸提液、灵芝浸提液制备：分别称取100 g天麻粉、灵芝粉、杜仲粉，按照1∶10（g∶mL）的料液比例加入酱香型基酒（酒精度53%vol），将其搅匀封口，进行超声处理，超声时间为30 min，超声功率为220 W，放置在阴凉干燥处，每日摇动1次，过滤得到浸提液。
调配：采用D-最优混料设计法，以γ-氨基丁酸（γ-aminobutyric acid，GABA）、总抗氧化能力（total antioxidant capacity，T-AOC）和感官评分为评价指标，得到最佳配方为天麻浸提液49%、灵芝浸提液30%、杜仲浸提液21%。混合酒液颜色透明，无沉淀物，酱香和酒香协调。
调味、降度：加入适量的蜂蜜，调整酒精度为37%vol，即得贵州三宝酒成品。
1.3.2 实验分组及给药
KM小鼠适应环境1周后，随机分为6个组，见表1。除空白对照组腹腔注射等剂量的生理盐水外，其他各组小鼠腹腔注射剂量为300 mg/kg体质量的D-半乳糖溶液，连续注射6周进行亚急性衰老小鼠造模。根据《中国居民营养与慢性病状况报告（2020）》[18]以及《中国居民膳食指南》[19]，每人每日酒精摄入量≤25 g，贵州三宝酒的人体日推荐量为≤1.1 mL/kg，因此，设定低、中、高剂量组小鼠灌胃剂量分别为5 mL/（kg·d）、10 mL/（kg·d）、15 mL/（kg·d），其他组小鼠灌胃剂量均为10 mL/（kg·d），每日灌胃1次，连续灌胃6周，测定体质量。末次灌胃2 h后，进行眼球采血，收集血清，取小鼠脑、心、肝、脾脏、肾等组织，保存于-80 ℃超低温冰箱，备用。
表1 实验分组及给药方案
Table 1 Experimental grouping and administration scheme
组别 动物数量/只 造模 灌胃剂量 饲养方式空白对照组（K）基酒对照组（B）模型对照组（M）低剂量组（D）中剂量组（Z）高剂量组（G）10 10 10 10 10 10注射生理盐水注射300 mg/kg D-半乳糖溶液注射300 mg/kg D-半乳糖溶液注射300 mg/kg D-半乳糖溶液注射300 mg/kg D-半乳糖溶液注射300 mg/kg D-半乳糖溶液生理盐水10 mL/（kg·d）酱香基酒（酒精度53%vol）10 mL/（kg·d）生理盐水10 mL/（kg·d）贵州三宝酒5 mL/（kg·d）贵州三宝酒10 mL/（kg·d）贵州三宝酒15 mL/（kg·d）自由进食自由进食自由进食自由进食自由进食自由进食
1.3.3 小鼠脏器指数测定
参照文献[20]计算小鼠心脏、肝脏、脾脏、肾脏的脏器指数，其计算公式如下：
1.3.4 小鼠血清及脑组织SOD、GSH-Px活性及MDA、GSH含量的测定
末次灌胃2 h后用眼眶采血法，收集血清，在4 ℃、3 500 r/min条件下离心10 min，取上清液。取脑组织0.1 g，加0.9 mL冰生理盐水，制成10%脑组织匀浆，在4 ℃、3 500 r/min条件下离心10 min后取上清液。按照试剂盒说明书方法测定各组小鼠血清及脑组织中的GSH-Px、SOD活力及GSH、MDA含量。
1.3.5 小鼠肝组织IL-4、IL-6及TNF-α含量的测定
取肝组织0.1 g，加0.9 mL冰生理盐水，制成10%肝组织匀浆，在4 ℃、3 500 r/min条件下离心10 min后，取上清液，利用试剂盒测定IL-4、IL-6及TNF-α含量。
1.3.6 小鼠肝组织病理形态的观察
采用HE法对肝组织进行染色，并采用光学显微镜观察肝组织的病理学形态[21]。
1.3.7 数据处理及统计分析
使用Excel 2018及SPSS20.0软件对实验数据进行处理，结果以“平均数±标准差”表示，组间均数比较采用t检验；采用Origin 2018绘制图表。
2 结果与分析
2.1 贵州三宝酒对小鼠体质量的影响
由图1可知，模型对照组小鼠体质量较空白对照组显著下降，同时，经观察可知，模型对照组小鼠出现了动作迟缓、进食量减少、机械性反应慢等衰老症状[22]，说明造模成功。基酒对照组及贵州三宝酒低、中、高剂量组小鼠的体质量均高于模型对照组。同时，经观察可知，给药组小鼠在给药之后，进食量增加，食欲恢复，表明贵州三宝酒剂量组对衰老小鼠所伴随的体质量下降、食欲减退等症状具有缓解作用。
图1 贵州三宝酒对D-半乳糖所致衰老小鼠体质量的影响
Fig.1 Effect of Guizhou Sanbao wine on body mass of aging mice induced by D-galactose
2.2 贵州三宝酒对小鼠脏器指数的影响
由表2可知，模型对照组小鼠肝脏、肾脏、脾脏的脏器指数均显著低于空白对照组（P＜0.05），而贵州三宝酒低、中、高剂量组小鼠的脏器指数均高于模型对照组（P＞0.05），说明贵州三宝酒能够在一定程度上缓解小鼠脏器指数的下降情况，不会对小鼠器官造成损伤。
表2 贵州三宝酒对D-半乳糖致衰老小鼠脏器指数的影响
Table 2 Effect of Guizhou Sanbao wine on organ index of aging mice induced by D-galactose
注：与空白对照组比较，“*”表示差异显著（P＜0.05），“**”表示差异极显著（P＜0.01）。
组别空白对照组基酒对照组模型对照组低剂量组中剂量组高剂量组脏器指数/（mg·g-1）肝脏 心脏 脾脏 肾脏56.51±2.61 46.75±5.34 48.50±3.91**48.63±3.53 49.82±4.10 50.11±3.13 7.00±1.10 5.92±1.03 5.56±0.80 5.63±0.54 6.25±0.70 5.28±0.73 4.47±1.11 3.80±0.80 3.72±1.71*4.87±1.88 4.10±0.40 4.24±1.70 16.41±2.12 14.27±0.61 13.97±1.67**14.63±2.01 15.39±3.78 15.01±1.35
2.3 贵州三宝酒对小鼠血清中SOD、GSH-Px活力及GSH、MDA含量的影响
据研究表明，D-半乳糖诱导的小鼠衰老模型可促使小鼠体内产生大量的自由基，致使小鼠体内的脂质过氧化物丙二醛水平上升，超氧化物歧化酶、过氧化氢酶、谷胱甘肽过氧化物酶等机体内抗氧化酶水平下降[23]。
由图2可知，与空白对照组相比，模型对照组小鼠血清中SOD、GSH-Px活力及GSH含量极显著降低（P＜0.01），而MDA含量则极显著增加（P＜0.01），说明衰老小鼠模型造模成功。与模型对照组相比，贵州三宝酒的低、中、高剂量组的SOD、GSH-Px活性及GSH含量均显著或极显著提高（P＜0.05，P＜0.01），而MDA含量则显著或极显著下降（P＜0.05，P＜0.01）；基酒对照组小鼠的SOD、GSH-Px活性及GSH含量与模型对照组无显著差异（P＞0.05），但MDA含量显著下降（P＜0.05），这表明贵州三宝酒能够有效提高衰老小鼠血清中的SOD、GSH-Px活力及GSH含量，降低MDA含量，抑制衰老小鼠症状的发展，且作用效果要优于酱香型基酒。
图2 贵州三宝酒对小鼠血清中SOD（A）及GSH-Px（B）活力，GSH（C）及MDA（D）含量的影响
Fig.2 Effect of Guizhou Sanbao liquor on SOD (A) and GSH-Px (B) activities, GSH (C) and MDA (B) contents in serum of mice
与空白对照组比较，“*”表示差异显著（P＜0.05），“**”表示差异极显著（P＜0.01）；
与模型对照组比较，“#”表示差异显著（P＜0.05），“##”表示差异极显著（P＜0.01）。下同。
2.4 贵州三宝酒对小鼠脑组织中SOD、GSH-Px活力及GSH、MDA含量的影响
由图3可知，与空白对照组比较，模型对照组小鼠脑组织中的SOD、GSH-Px活性及GSH含量均极显著降低（P＜0.01），MDA含量极显著升高（P＜0.01）。与模型对照组比较，贵州三宝酒低剂量组小鼠脑组织中的SOD活性及GSH含量升高（P＞0.05），GSH-Px活性显著升高（P＜0.05），而MDA含显著下降（P＜0.05）；贵州三宝酒中、高剂量组小鼠脑组织中的SOD活性、GSH-Px活性及GSH含量显著升高（P＜0.05，P＜0.01），而MDA含量极显著下降（P＜0.01）；而基酒对照组小鼠除GSH-Px活力显著升高外（P＜0.05），其他指标无显著差异（P＞0.05）。这说明贵州三宝酒可提高衰老小鼠脑组织的SOD、GSH-Px活性及GSH含量，降低MDA含量，减轻氧化反应对脑组织的损伤，从而达到抗衰老的效果，且作用效果优于酱香型基酒。
图3 贵州三宝酒对小鼠脑组织SOD（A）及GSH-Px（B）活力，GSH（C）及MDA（D）含量的影响
Fig.3 Effect of Guizhou Sanbao liquor on SOD (A) and GSH-Px (B) activities, GSH (C) and MDA (B) contents in brain tissue of mice
2.5 贵州三宝酒对小鼠肝组织中IL-4、IL-6及TNF-α水平的影响
据研究表明，D-半乳糖导致衰老小鼠的免疫器官退化、免疫功能降低、促炎症因子如IL-4、IL-6、TNF-α分泌增加，机体转变成一种慢性炎症状态，从而促进细胞和机体老化[24-25]。
由表3可知，与空白对照组相比，模型对照组以及基酒对照组肝组织的IL-4、IL-6、TNF-α水平均极显著升高（P＜0.01），说明D-半乳糖和基酒可破坏机体的酶防御系统，上调炎症因子IL-4、IL-6及TNF-α的表达，造成对机体的损伤，加速衰老。与模型对照组相比，贵州三宝酒各个剂量组肝组织的IL-4、IL-6及TNF-α的水平显著或极显著降低（P＜0.05，P＜0.01），这说明贵州三宝酒不仅可以增加机体抗氧化物质的活性和含量，同时还能降低炎症因子的表达，延缓机体老化。
表3 贵州三宝酒对小鼠肝组织IL-4、IL-6及TNF-α水平的影响
Table 3 Effects of Guizhou Sanbao wine on the levels of IL-4, IL-6 and TNF-α in liver tissue of mice
组别 IL-4含量/（pg·mL-1）IL-6含量/（pg·mL-1）TNF-α含量/（pg·mL-1）组别 IL-4含量/（pg·mL-1）IL-6含量/（pg·mL-1）TNF-α含量/（pg·mL-1）空白对照组基酒对照组模型对照组22.05±3.37 36.66±11.21**45.68±6.32**31.09±7.85 47.98±7.72**43.22±10.90*44.76±11.77 94.84±16.30**76.52±11.95**低剂量组中剂量组高剂量组22.20±6.24##27.17±8.25##31.04±7.86#28.32±5.12#30.26±6.24##31.89±6.22#49.64±13.13#53.16±9.56#56.28±13.68#
2.6 贵州三宝酒对小鼠肝组织病理形态的影响
抗氧化防御系统是预防氧和代谢产品的毒性反应，保持细胞的均衡是维持细胞生存状况的一个重要原因[26-27]。由图4可知，空白对照组小鼠的肝组织清晰，呈放射状排列，排列整齐，无明显空泡，细胞核周围的空隙均匀；模型对照组小鼠肝组织的细胞排列混乱，大部分肝细胞出现水肿现象、炎症细胞浸润、肝细胞纤维化；基酒对照组小鼠肝组织结构出现大小不一的脂肪滴空泡，肝细胞模糊，排列紊乱。与模型对照组以及基酒对照组比较，贵州三宝酒低、中、高剂量组小鼠的肝组织结构清晰、肝细胞排列整齐，而细胞空泡等现象有明显减轻。这说明贵州三宝酒在一定程度上可减轻基酒和D-半乳糖对小鼠肝组织的损伤。
图4 各组小鼠肝组织形态观察结果（20×20）
Fig.4 Morphological observation results of the liver tissue of mice in each group (20×20)
3 结论
本实验采用D-半乳糖来构建亚急性衰老动物模型，采用贵州三宝酒灌胃小鼠，结果发现，贵州三宝酒能够缓解模型组小鼠的食欲下降、体质量减少、脏器指数下降的状况，提高D-半乳糖所致衰老小鼠血清及脑组织中的SOD、GSH-Px活力及GSH含量，降低MDA含量，降低脂质过氧化引起的细胞损害，并下调肝组织中TNF-α、IL-4、IL-6炎症因子的表达，降低肝脏的氧化损伤；同时减轻D-半乳糖和酒精对肝组织损伤。该研究表明，贵州三宝酒具有较强体内的抗氧化活性，保持机体正常的防御能力，从而达到延缓衰老的目的，为促进“贵州三宝”多元化的发展提供理论基础。
[1]安中原，钟斌.天麻的化学成分与药理活性研究概况[J].海峡药学，2017，29（6）：22-24.
[2]赵敏，王瑜，李立郎，等.天麻酵素化过程中风味物质及抗氧化活性动态变化[J].食品与发酵工业，2021，47（22）：92-98.
[3]陈岗，李红，王勇德，等.炮制加工对天麻化学成分影响的研究进展[J].天然产物研究与开发，2023，35（3）：539-549.
[4]李天依，林江，闫强强，等.灵芝的现代应用研究进展[J].临床医药文献电子杂志，2019，6（A2）：152，193.
[5]谢怡琼，王琪瑞，孙思雅，等.灵芝的药理作用和临床应用研究进展[J].临床医学研究与实践，2020，5（10）：191-193.
[6]高宏伟，李玉萍，李守超.杜仲的化学成分及药理作用研究进展[J].中医药信息，2021，38（6）：73-81.
[7]屠万倩，张留记，夏曼玉，等.杜仲叶清除DPPH自由基动力学特性及抗氧化活性成分筛选[J].中国药学杂志，2022，57（4）：264-268.
[8]GAO X D,WANG Z G,XIONG L J,et al.The bs-YHEDA peptide protects the brains of senile mice and thus recovers intelligence by reducing iron and free radicals[J].Free Radic Biol Med,2022,190:216-225.
[9]魏玉婷，朱田田，苏明莉，等.D-半乳糖法制备AD动物模型的分类总结与初步评价[J].中国实验动物学报，2022，30（6）：846-856.
[10] HASHEMI S M B, JAFARPOUR D, JOUKI M.Improving bioactive properties of peach juice using Lactobacillus strains fermentation: Antagonistic and anti-adhesion effects, anti-inflammatory and antioxidant properties,and Maillard reaction inhibition[J].Food Chem,2021,365:130501.
[11]邓潇潇，周雅琳，冯霞，等.Lactobacillus delbrueckii subsp.bulgaricus KSFY07对D-半乳糖诱导的氧化衰老小鼠运动能力的提升作用[J].食品与发酵工业，2023，49（7）：49-58.
[12]杨善岚，吴磊，涂嘉欣，等.自由基致衰老的研究进展[J].中华疾病控制杂志，2022，26（5）：589-594.
[13]YOON G A,PARK S.Antioxidant action of soy isoflavones on oxidative stress and antioxidant enzyme activities in exercised rats[J].Nutr Res Pract,2014,8(6):618-624.
[14] CUI Y T, ZHAO N N, WANG C, et al.Acute ammonia stress-induced oxidative and heat shock responses modulated by transcription factors in Litopenaeus vannamei[J].Fish Shellfish Immunol,2022,128:181-187.
[15]宁鹏.中药复方对衰老模型小鼠部分组织中GSH-Px活性的影响[J].动物医学进展，2012，33（9）：92-94.
[16]俞诗源，孟茹，李重阳，等.当归多糖对麻黄素小鼠肝组织抗氧化酶活性和NF-κB、TNF-α表达的影响[J].西北师范大学学报（自然科学版），2015，51（1）：75-81.
[17]李雪，李立郎，王瑜，等.D-最优混料设计优化“贵州三宝酒”配方及品质分析[J].食品与发酵科技，2023，59（1）：89-97.
[18]中国居民营养与慢性病状况报告（2020年）[J].营养学报，2020，42（6）：521.
[19]曹清明，王蔚婕，张琳，等.中国居民平衡膳食模式的践行——《中国居民膳食指南（2022）》解读[J].食品与机械，2022，38（6）：22-29.
[20]李建平，张跃文，王静，等.淫羊藿不同提取物对D-半乳糖致衰老小鼠行为学及脏器指数的影响[J].中药药理与临床，2010，26（2）：46-49.
[21]刘畅，丁晶鑫，周英，等.基于网络药理学的金银花对大鼠急性酒精性肝损伤的保护作用研究[J].中国中药杂志，2021，46（17）：4531-4540.
[22]YUAN Y,LI Y C,LU L,et al.Acrylamide induces ferroptosis in HSC-T6 cells by causing antioxidant imbalance of the XCT-GSH-GPX4 signaling and mitochondrial dysfunction[J].Toxicol Lett,2022,368:24-32.
[23] ASCHNER M, NGUYEN T T, SINITSKII A I, et al.Isolevuglandins(isoLGs) as toxic lipid peroxidation byproducts and their pathogenetic role in human diseases[J].Free Radic Biol Med,2021,162:266-273.
[24]WILLE C M,LENHART R L,WANG S,et al.Ability of sagittal kinematic variables to estimate ground reaction forces and joint kinetics in running[J].J Orthop Sports Phys Ther,2014,44(10):825-830.
[25]MACHADO K N,DE PAULA BARBOSA A,DE FREITAS A A,et al.TNF-alpha inhibition, antioxidant effects and chemical analysis of extracts and fraction from Brazilian guarana seed powder[J].Food Chem,2021,355:129563.
[26]ONIKANNI A S,LAWAL B,OYINLOYE B E,et al.Therapeutic efficacy of Clompanus pubescens leaves fractions via downregulation of neuronal cholinesterases/Na(+)-K(+)ATPase/IL-1 beta, and improving the neurocognitive and antioxidants status of streptozotocin-induced diabetic rats[J].Biomed Pharmacother,2022,148:112730.
[27]ZHONG T,LI M C,WU H S,et al.Novel Flavan-3,4-diol vernicidin B from Toxicodendron vernicifluum (Anacardiaceae) as potent antioxidant via IL-6/Nrf2 cross-talks pathways[J].Phytomedicine,2022,100:154041.