镇江香醋产自江苏镇江，是受原产地域保护的产品[1]，镇江香醋以糯米为主料，经过糖化、酒精发酵、醋酸发酵、炒米色、淋醋、陈酿等多道工序制作而成[2-3]，具有酸而不涩、香而微甜、色浓味鲜、愈存愈醇、久存不变质、营养丰富、能入药七大特点，享誉国内外[4-5]。
刚淋出来的新醋口感发涩，需要经过陈酿来提升品质[6]，国标GB/T 18623—2011《地理标志产品镇江香醋》中规定镇江香醋的陈酿时间要超过6个月，新淋的镇江香醋通常装在陶坛里，置于光照、通风好的地方进行陈酿[7-9]。陈酿过程中，由于挥发浓缩作用，一些具有刺激性的挥发性成分含量下降，随着陈酿的进行，发生的一系列理化反应，导致食醋中的成分分解、转化、合成，其理化、风味和功能随之发生改变[10-11]。由于物料配比、酿造工艺、生态环境、酿造气候、陈酿时间等因素的差异，镇江香醋各种指标、成分、风味及功能也会产生很大变化[12]。刘源等[13]运用气质联用（gas chromatography-mass spectrometry，GC-MS）技术对不同工艺和醋龄的镇江香醋中的挥发性成分进行了检测，结果表明，随着醋龄增加，各类别的挥发性成分均有显著变化。强敏等[14]选取了100个生产和贮藏条件不同的镇江香醋样品，结果发现生产时间和贮藏条件不同醋的总酸、可溶性无盐固形物、不挥发性酸、还原糖和氨基酸态氮含量差异明显，且5种指标之间的变化存在一定联系。郑吴伟等[15]利用电子鼻对陈酿中的镇江香醋的风味进行比较测定，结果发现，电子鼻检测技术可以逐步取代工人经验对不同阶段食醋风味差异的区分。目前，学者多针对镇江香醋的某一指标、特性、技术进行研究，缺乏对镇江香醋品质指标和功能成分的系统比较。本研究对不同陈酿年份市售镇江香醋的的基础理化指标、风味及功能成分含量进行测定，比较不同陈酿年份市售镇江香醋样品间品质及功能成分的差异，旨在对不同陈酿年份镇江香醋品质评判及提升提供科学依据。
1 材料与方法
1.1 材料与试剂
陈酿3年镇江香醋（编号为ZV3-1、ZV3-2、ZV3-3）、陈酿5年镇江香醋（编号为ZV5-1、ZV5-2、ZV5-3）、陈酿8年镇江香醋（编号为ZV8-1、ZV8-2、ZV8-3）：市售。
柠檬酸钠、柠檬酸、盐酸、硫酸（均为分析纯）：上海波尔化学试剂有限公司；草酸、酒石酸、丙酮酸、苹果酸、乳酸、乙酸、柠檬酸、琥珀酸、川芎嗪标准品（纯度均＞98%）：江苏博泉生物科技有限公司。
1.2 仪器与设备
U3000高效液相色谱（high performance liquid chromatography，HPLC）仪、Biochrom 30+氨基酸自动分析仪：赛默飞世尔科技（中国）有限公司。
1.3 实验方法
1.3.1 理化指标测定
pH、总酸、还原糖、可溶性固形物、总酯含量：参照国标GB 18187—2000《酿造食醋》中的方法进行测定。
1.3.2 有机酸含量测定
有机酸含量测定采用高效液相色谱（HPLC）法[16]。取镇江香醋样品1 mL，超纯水定容至10 mL，用0.22 μm微孔的滤膜过滤，进样检测。高效液相色谱条件如下：Venusil MP C18色谱柱（4.6 mm×150 mm×5 μm）；20 mmol/L NaH2PO4作为流动相；进样量20 μL；流动速度0.8 mL/min；波长为210 nm；柱温30 ℃。
1.3.3 氨基酸含量测定
氨基酸含量采用氨基酸自动分析仪测定[17]。取样品1mL，参照文献[17]配制不同pH的缓冲溶液，将样品与稀释液（柠檬酸钠11.8 g，柠檬酸6 g，37%的HCl溶液10.4 mL，加水定容至1 L，用NaOH溶液调整pH值为2.2）以1∶15的比例混合，过膜进样。HPLC色谱条件：流动相为不同pH的缓冲溶液和茚三酮溶液，其流速分别为25.0 mL/h和35.0 mL/h；柱温135 ℃。
1.3.4 功能成分测定
总多酚含量的测定：采用Folin-Ciocalteu比色法；总黄酮含量的测定：采用亚硝酸钠-硝酸铝-氢氧化钠比色法；乙偶姻含量的测定：采用肌酸比色法。
川芎嗪含量的测定：采用高效液相色谱法[18]。取50 mL醋液用NaOH溶液调整pH值至8～10，用25 mL 氯仿（CHCl3）混和萃取，7 000 r/min离心15 min，转移CHCl3，再重复一次，用0.2 mol/L HCl萃取，超纯水定容至50 mL。HPLC条件：Venusil MP C18色谱柱（4.6 mm×150 mm×5 μm）；0.2 mmol/L NH4H2PO4与甲醇（48∶52，V/V）水溶液为流动相；进样量20 μL；流动速度1 mL/min；柱温：室温。
2 结果与分析
2.1 不同陈酿年份镇江香醋理化指标
pH值和总酸是衡量食醋酸度的重要指标，总酸含量在一定范围内时，pH值越高，表明食醋酸味越绵柔[19]。由图1a可知，不同陈酿年份的镇江香醋样品的pH值为3.07～3.87，总酸含量为5.08～8.10 g/100 mL。陈酿8年的样品的pH值和总酸含量最高，其平均值分别为3.71和7.43 g/100 mL，比陈酿3年的样品分别提高了0.51和1.71 g/100 mL。
图1 不同陈酿年份镇江香醋样品理化指标检测结果
Fig.1 Determination results of physiochemical indexes of Zhenjiang aromatic vinegar samples with different aging years
食醋中的还原糖和可溶性固形物不仅能够调节食醋的滋味，还是生成风味物质、功能物质的重要底物[20]，由图1b可知，陈酿5年的样品中还原糖和可溶性固形物的平均含量分别为0.93 g/100 mL、10.85 g/100 mL，低于其他年份，陈酿8年的醋的还原糖和可溶性固形物的平均含量最高，分别为2.96 g/100 mL、16.34 g/100 mL，陈酿过程中，食醋中的还原糖变化的主要原因是其与氨基酸态氮产生美拉德反应[21-22]，陈酿后期主要经醋液浓缩，含量上升。
食醋的香气主要源于酯类物质，食醋中的丰富的酯类物质可为食醋带来香蕉香、清甜果香、苹果香、椰子香味等复杂香味[23]。陈酿前期，镇江香醋中的丁酸甲酯、乙酸异戊酯香气强度较高，随着陈酿进行，葫芦巴内酯成为主要的酯类呈香物质[24]。由图1c可知，陈酿年份越高，镇江香醋中的总酯含量越高，陈酿8年的样品的总酯平均含量最高，为2.92 g/100 mL，比陈酿3年的样品高了0.67 g/100 mL，总酯含量随陈酿年份增加而升高的原因主要是陈酿过程中的酯化反应和水分的蒸发。
结果表明，陈酿8年的镇江香醋的总酸、pH值、还原糖、可溶性固形物、总酯含量均优于其他年份。
2.2 不同陈酿年份镇江香醋有机酸
有机酸是食醋的主要风味物质，其含量高、种类多，各类有机酸杂糅在一起，是食醋区别于其他调味品的独有特色。食醋的刺激性酸味主要源自乙酸，其含量是食醋品质的关键，乳酸、苹果酸、柠檬酸、琥珀酸等有机酸酸味柔和，通过协同作用可对乙酸的刺激口感缓解，使食醋的口感变得柔和、醇厚[11，25-26]。
利用高效液相色谱法对9个镇江香醋样品的有机酸含量测定，结果见表1。根据有机酸的含量和种类制作热图，结果见图2。由表1可知，9个镇江香醋样品检出草酸、酒石酸、丙酮酸、苹果酸、乳酸、乙酸、柠檬酸、琥珀酸共8种有机酸，其中，乙酸含量最高，含量范围2.022 4～3.272 7 g/100 mL；琥珀酸含量最低，含量范围为0.000 2～0.049 6 g/100 mL。陈酿年份越高，镇江香醋中的有机酸总量越高，样品ZV8-1的有机酸总量最高，为5.579 0 g/100 mL。在检测的8种有机酸中，乙酸和乳酸含量明显高于其他有机酸，其平均含量分别占总量的57.65%和25.82%，陈酿8年的镇江香醋的酒石酸、乙酸平均含量较高，分别为0.568 7 g/100 mL、3.2174g/100mL，比陈酿3年的样品分别高了51.55%和49.76%。由图2可知，不同年份的市售镇江香醋样品聚为两支，ZV8-1、ZV8-2、ZV8-3、ZV3-2、ZV3-3聚为一支，ZV5-1、ZV5-2、ZV5-3、ZV3-1聚为另一支，说明陈酿8年的市售样品有机酸谱系相似，陈酿5年市售样品有机酸谱系相似，陈酿3年的市售镇江香醋的有机酸含量不稳定。
表1 不同陈酿年份镇江香醋样品中有机酸含量测定结果
Table 1 Determination results of organic acids contents of Zhenjiang aromatic vinegar samples with different aging years
图2 不同陈酿年份镇江香醋样品有机酸含量聚类分析热图
Fig.2 Heat map of clustering analysis of organic acids contents in Zhenjiang aromatic vinegar samples with different aging years
颜色由蓝到红代表不同有机酸在样品中的含量，颜色越红，含量越高。
结果表明，陈酿8年镇江香醋的有机酸含量优于其他年份。
2.3 不同陈酿年份镇江香醋氨基酸
氨基酸使食醋具有一定的营养价值，同时，氨基酸具有独特的滋味，可作为风味物质，使得食醋鲜香绵酸[27]。本研究对9个镇江香醋样品中的氨基酸进行检测，结果见表2。并根据氨基酸含量和种类制作聚类分析热图，结果见图3。由表2可知，9个镇江香醋样品共检出17种氨基酸，其中有7种必需氨基酸。陈酿8年的样品的大部分氨基酸含量明显多于其他年份，陈酿8年的镇江香的氨基酸平均总量最高，为8.756 7 mg/mL。不同年份的9个样品中含量最高的氨基酸均为丙氨酸，其平均含量为1.024 1 mg/mL。陈酿3年的镇江香醋醋中，仅有呈甜味的丙氨酸的平均含量超过0.5 mg/mL；陈酿5年的镇江香醋醋中，有5种氨基酸的平均含量超过0.5 mg/mL，丙氨酸和亮氨酸高于其他氨基酸，分别为0.864 8 mg/mL和0.862 4 mg/mL；陈酿8年的镇江香醋醋中，有7种氨基酸的平均含量超过0.5 mg/mL，丙氨酸、亮氨酸和缬氨酸高于其他氨基酸，分别为1.4416mg/mL、1.2903mg/mL和0.855 0 mg/mL。食醋中的氨基酸含量随陈酿年份增加而增加的原因主要是陈酿过程中蛋白质的降解，产生大量氨基酸。郑梦林等[28]对不同陈酿时间的镇江香醋中的氨基酸进行了测定，其氨基酸含量在1.5～2.5 g/L，且氨基酸含量随陈酿时间增加而增加。由图3可知，样品ZV8-1、ZV8-2、ZV8-3、ZV3-1、ZV3-2、ZV3-3聚为一支，样品ZV5-1、ZV5-2、ZV5-3聚为另一支，表明陈酿8年样品和陈酿3年样品的氨基酸谱系相似，陈酿5年的3个样品氨基酸谱系相似。
表2 不同陈酿年份镇江香醋样品中氨基酸含量测定结果
Table 2 Determination results of amino acid contents in Zhenjiang aromatic vinegar samples with different aging years
注：“*”表示必需氨基酸。
图3 不同陈酿年份镇江香醋氨基酸含量聚类分析热图
Fig.3 Heat map of clustering analysis of amino acid contents of Zhenjiang aromatic vinegar with different aging years
图中的颜色由蓝到红代表不同氨基酸在样品中的含量，颜色越红，含量越高。
结果表明，陈酿8年镇江香醋的氨基酸含量高于其他年份。
2.4 不同陈酿年份镇江香醋功能成分
2.4.1 不同陈酿年份镇江香醋总多酚和总黄酮
不同陈酿年份镇江香醋样品中总多酚和总黄酮含量测定结果见图4。由图4a可知，随着陈酿年份增加，镇江香醋样品中的总多酚含量整体增加，与陈酿3年的样品相比，陈酿8年的镇江香醋的平均总多酚含量比陈酿3年的镇江香醋高87.54 mg/100 mL，其中，样品ZV8-1含量最高，为179.83 mg/100 mL。这是因为陈酿前期，部分酚类物质会发生水解，但随着陈酿的进行，生成多酚的前体物质不断氧化、络合，导致总多酚含量增加。由图4b可知，随着陈酿年份增加，镇江香醋中的总黄酮含量整体增加，陈酿8年的镇江香醋的平均黄酮含量最高，为85.49 mg/100 mL。ZV8-1和ZV5-2的黄酮含量分别为117.39 mg/100 mL和86.25 mg/100 mL，高于其他样品，这是主要是由于陈酿过程中，黄酮与糖苷结合，形成黄酮醇配糖体，而后水解又得到黄酮，造成了黄酮的波动变化。李丹亚[29]对陈酿过程中的镇江香醋进行了研究，发现在陈酿初期，镇江香醋中的总多酚、总黄酮含量稍有下降，陈酿后期，由于多种物理、化学反应，二者含量随陈酿时间增加而增加。
图4 不同陈酿年份镇江香醋样品总多酚（a）和总黄酮（b）含量测定结果
Fig.4 Determination results of total polyphenols (a) and total flavonoids (b) contents in Zhenjiang vinegar samples with different aging years
结果表明，陈酿8年的总多酚和总黄酮含量镇江香醋优于其他年份。
2.4.2 不同陈酿年份镇江香醋乙偶姻和川芎嗪
乙偶姻具有奶油香气，不仅是影响食醋风味的物质，更是生成重要功能物质川芎嗪的前体物质[30]。不同陈酿年份镇江香醋乙偶姻和川芎嗪含量测定结果见图5。由图5a可知，随着陈酿年份增加，镇江香醋中的乙偶姻含量整体下降，陈酿8年的镇江香醋样品中乙偶姻平均含量比陈酿3年的低5.26 mg/mL，这是因为在陈酿过程中，乙偶姻会与NH4+等进一步反应生成川芎嗪。川芎嗪是重要的功能活性成分，对抑制心脑血管疾病、中枢神经系统等方面的疾病都有一定的功效[31]，食醋中的川芎嗪主要在醋酸发酵和煎煮过程中生成，经过陈酿后在食醋中大量累积。由图5b可知，随着陈酿年份增加，镇江香醋中的川芎嗪含量整体增加，陈酿8年的镇江香醋样品川芎嗪平均含量比陈酿3年的高52.88 mg/L，其中，样品ZV8-1含量最高，为108.09 mg/L。
图5 不同陈酿年份镇江香醋样品中乙偶姻（a）及川芎嗪（b）含量测定结果
Fig.5 Determination results of acetoin (a) and ligustrazine (b) contents in Zhenjiang vinegar samples with different aging years
乙偶姻含量结果表明，镇江香醋陈酿3年为宜；川芎嗪含量结果表明，镇江香醋陈酿8年为宜。
3 结论
本研究对不同陈酿年份镇江香醋样品的基础理化指标、有机酸、氨基酸及功能成分进行检测。结果表明，镇江香醋中的pH值、总酸、总酯、还原糖、可溶性固形物、有机酸、大部分氨基酸及多酚、总黄酮和川芎嗪含量随年份增加而增高。镇江香醋中主要有机酸是乙酸和乳酸，主要氨基酸是丙氨酸、亮氨酸和缬氨酸。陈酿8年样品的pH值、总酸、总酯、还原糖及可溶性固形物、总多酚、总黄酮、川芎嗪含量最高，分别为3.71、7.43g/100mL、2.91g/100mL、2.96g/100mL、16.34g/100mL、151.83mg/100mL、84.49mg/100mL、94.87mg/L。其有机酸和氨基酸的平均总量也高于其他年份，分别为5.371 1 g/100 mL、8.756 7 mg/mL，且有7种氨基酸的平均含量超过0.5 mg/mL。由于美拉德反应，陈酿过程中的乙偶姻含量下降，陈酿8年的样品的乙偶姻含量最低，为9.07 mg/mL。综上，陈酿时间为8年的镇江香醋品质较好，后续需要继续增加样品的种类和数量，探究比较传统和现代陈酿技术、工艺间的差异，以期为镇江香醋的陈酿工艺优化和市场规范提供一定参考。
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