百香果学名西番莲，是西番莲科（Passifloraceae）西番莲属（Passiflora）多年生热带生常绿藤本植物[1-2]，在我国广西、江西和云南等地均有种植[3]。百香果果肉中富含多酚、黄酮、类胡萝卜素等生物活性物质，具有抗氧化、降糖、降血压、降血脂等功效[4-5]。百香果香味浓郁，蕴含多种水果的香气[6-7]，可被加工成浓缩汁、饮料、果脯、果醋等[4，8-9]。百香果属于呼吸跃变型果实，采后易皱缩腐烂[10]，大幅扩种后容易造成因旺产滞销[10-11]。不同火龙果品种分属于仙人掌科（Cactaceae）量天尺属（Hylocereus）或蛇鞭柱属（Seleniereus），分为红皮白肉（Hylocereus undatus）、红皮红肉（Hylocereus polyrhizus）、黄皮白肉（Hylocereus megalanthus）[12]，在我国在两广、云贵等地广泛种植[13]。其中，红心火龙果富含甜菜红素、花青素、黄酮等活性物质[14-16]，具有减肥、抗衰老、降血糖等功效[17-19]。火龙果虽不是呼吸跃变型果实，但采收后呼吸代谢旺盛，也易腐烂变质[20]。火龙果可被加工成果汁、果酒、果酱、果醋等[21-22]。
果酒营养丰富、果香纯正、外观清亮、口感清新，受到广大中青年尤其是女性消费者的青睐，符合新时代饮酒需求[23]。利用百香果和火龙果单独酿酒的研究报道较多，研究集中在不同品种酿造性能的差异比较[21]、酿造工艺优化[3，10]、酵母菌种的优选[21，24]、果酒香气成分的解析[10]、色泽特性[25]和抗氧化性[3，25]等方面。复合果酒能够很好地弥补单一果酒在口感、风味以及营养等方面的不足，已成为当今果酒研究的热点[26]。目前，火龙果、百香果与其他原料制备的复合果酒的报道越来越多，如猕猴桃与百香果果酒[26]、荞麦与百香果果酒[27]、葡萄与香果果酒[28]、龙眼与红心火龙果果酒[29]、水蜜桃与火龙果果酒[30]等，但尚未见将二者直接复合进行果酒研发的报道。鉴于百香果的香气浓郁独特但过酸[2，31]、红心火龙果颜色鲜艳但无明显果香[14，20]的缺陷，结合两种水果原料可供给性强的实际，拟开发一款营养丰富、色泽鲜红的复合果酒。
本研究以红心火龙果和百香果为主要原料探讨复合果酒的制备，以感官评分为评价指标，利用单因素试验及响应面法对其发酵工艺进行优化，并对其发酵过程中颜色参数、甜菜红素含量及1,1-二苯基-2-三硝基苯肼（1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl，DPPH）自由基清除率进行检测，以期为火龙果百香果复合果酒的工业化生产提供工艺技术支持，拓宽火龙果和百香果的深加工形式，降低这两种水果推广扩种并丰产后的滞销风险。
1 材料与方法
1.1 材料与试剂
桂热1号红心火龙果、台农一号紫皮百香果：广西钦州钦南区；果酒专用酵母（SY型）：宜昌安琪酵母股份有限公司；复合果胶酶X（20万U/g）：云南睿丹生物科技有限公司；DPPH（分析纯）：武汉卡诺斯科技有限公司；焦亚硫酸钾（食品级）：河南中辰生物科技有限公司；硫酸铵、碳酸钙、柠檬酸、蔗糖（均为食品级）：河南万邦试业有限公司。
1.2 仪器与设备
DK-98-II型电热恒温水浴锅：天津市泰斯特仪器有限公司；PAL-36S型酒精计：ATAGO（爱拓）中国分公司；ST3100型pH计：北京赛百奥科技有限公司；WYT-J型糖度计：成都豪创光电仪器有限公司；INNOVA 43R型低温培养箱：Eppendorf 中国有限公司；UV-1800型紫外分光光度计：岛津仪器（苏州）有限公司。
1.3 方法
1.3.1 红心火龙果百香果复合果酒加工工艺流程及操作要点
操作要点：
原料处理：选取成熟度高、无虫害、果体均匀的百香果和红心火龙果，将火龙果进行清洗、去皮后破碎，百香果清洗后切开挖瓤备用。
酶解：将打浆后的火龙果果肉和百香果瓤肉按质量比100∶10的比例，混合置于灭菌的三角锥形瓶中，混合果肉中加入100 mg/kg焦亚硫酸钾进行护色和抑菌，加入0.03%复合果胶酶X于45 ℃条件下酶解3 h。
成分调整：通过添加白砂糖来调整发酵液初始糖度至22%，添加柠檬酸调整初始pH值为3.7，并添加100 mg/L硫酸铵。
酵母活化：在20 mL 5%灭菌蔗糖溶液中接入4 g的干粉酵母，于36 ℃水浴活化30 min。
发酵：待发酵液降温至24 ℃，接种0.04%（V/V）的活化酵母液，用6层纱布覆盖罐口后振荡10 min进行充氧，然后放入22 ℃培养箱进行4 d主发酵；通过虹吸将发酵液进行倒罐，分离果渣、沉降酵母分离，在预设温度22 ℃的新发酵罐中后发酵4 d，此时果酒的酒精度基本保持不变。
过滤：发酵完成的果酒通过虹吸进行发酵液和果渣的分离。
陈酿：发酵液添加100 mg/kg焦亚硫酸钾后，在8 ℃条件下冷贮21 d。
调配、灌装：添加蔗糖将果酒调成含糖量为55 g/L的复合果酒，补充40 mg/kg焦亚硫酸钾后灌装果酒于500 mL的玻璃瓶中压盖密闭。
杀菌：80 ℃灭菌20 min，即得红心火龙果百香果复合果酒成品。
1.3.2 红心火龙果百香果复合果酒发酵工艺优化
（1）单因素试验
分别取1 000 g调整后的果浆，在初始糖度22%、火龙果浆：百香果肉质量比100∶10.0、硫酸铵100 mg/L的条件下，分别考察发酵温度（18 ℃、20 ℃、22 ℃、24 ℃、26 ℃）、初始糖度（18%、20%、22%、24%、26%）、火龙果与百香果果浆质量比（100∶5.0、100∶7.5、100∶10.0、100∶12.5、100∶15.0）、硫酸铵添加量（0、50 mg/L、100 mg/L、150 mg/L、200 mg/L）对红心火龙果百香果复合果酒酒精度及感官评分的影响。
（2）响应面优化试验
根据单因素试验结果，将固定硫酸铵添加量为100mg/L，以火龙果与百香果质量比（A）、初始糖度（B）、发酵温度（C）为自变量，以感官评分（Y）为响应值进行响应面试验优化。
表1 发酵工艺优化响应面试验设计因素与水平
Table 1 Factors and levels of response surface tests design for fermentation process optimization
1.3.3 常规理化指标
酒精度、甲醇、总酸、总糖的测定：参照GB/T 15038—2006《葡萄酒、果酒通用分析方法》；氨基酸态氮的测定：参照GB/T 12143—2008《饮料通用分析方法》；pH的测定：采用pH计；含糖量（可溶性固形物）的测定：采用手持糖度计；颜色参数的测定：参考文献[32]。
1.3.4 甜菜红素的含量测定
将果酒以9000r/min离心15min，取上清液在波长537nm、600 nm条件下进行吸光度值测定，以蒸馏水作参比[33]。甜菜红素含量计算公式如下：
式中，Aω：样品在波长537 nm和600 nm处吸光度值的差值；DF：样品稀释倍数；MF：甜菜红素的摩尔分子质量，550 g/mol；ε：标准甜菜苷摩尔消光系数60 000 L/（mol·cm）；L：比色皿光路的长度，1 cm。
1.3.5 DPPH自由基清除率的测定[24]
吸取以3 500 r/min，离心20 min后的果酒样品溶液0.2 mL至于10 mL试管中，加入0.1 mol/L的DPPH乙醇溶液2.8 mL，再加入3 mL体积分数95%的乙醇溶液，摇匀后置于室温、避光处反应30 min，于波长517 nm处测定其吸光值，记为Ai；以2.8 mL的乙醇溶液代替上述DPPH乙醇溶液，记为Aj；再以0.2 mL的蒸馏水代替上述样品，记为Ac，以体积分数为95%的乙醇溶液作参比调零。DPPH自由基清除率计算公式如下：
1.3.6 感官评价
由15名经过培训、具有相关经验的评分员参照NY/T 1508—2017《绿色食品果酒》对红心火龙果百香果复合果酒的色泽、气味、口感、典型性进行感官评价，满分100分。红心火龙果百香果复合果酒的感官评价标准见表2。
表2 红心火龙果百香果复合果酒感官评分标准
Table 2 Sensory score standards of compound fruit wine of red pitaya and passion fruit
续表
1.3.7 数据处理
采用Origin2018软件进行数据分析和作图，采用Design Expert 10.0.8软件进行响应面试验设计和结果分析。
2 结果与分析
2.1 单因素试验结果
2.1.1 发酵温度的确定
发酵温度对红心火龙果百香果复合果酒品质的影响见图1。由图1可知，随着发酵温度在18～26 ℃范围内的增加，酒精度呈上升趋势。感官评分受温度影响较大，随着发酵温度在18～22 ℃范围内的增加，感官评分逐渐增加；当发酵温度为22 ℃时，感官评分达到最高值，为83.0分，酒精度为11.7%vol；当发酵温度＞22 ℃之后，感官评分逐渐下降。其原因可能是温度通过调整酶促反应速率影响风味物质的形成，随着温度升高，酵母生长旺盛，代谢活动越强，发酵更彻底，但温度过高不利于果酒的口感和风味[34]。因此，选取最佳发酵温度为22 ℃。
图1 发酵温度对红心火龙果百香果复合果酒品质的影响
Fig.1 Effect of fermentation temperature on the quality of compound fruit wine of red pitaya and passion fruit
2.1.2 初始糖度的确定
初始糖度对红心火龙果百香果复合果酒品质的影响见图2。由图2可知，随着初始糖度在18%～26%范围内的增加，酒精度呈上升趋势。初始糖度在18%～22%的范围内增加，感官评分呈上升趋势；当初始糖度为22%时，感官评分达到最高值82.5分，酒精度为11.5%vol；当初始糖度＞24%之后，感官评分呈下降趋势。此时，复合果酒的百香果果香不突出，可能与糖度增加引起主酵剧烈从而引发果香物质挥发加剧有关[35]。因此，选取最佳初始糖度为22%。
图2 初始糖度对红心火龙果百香果复合果酒品质的影响
Fig.2 Effect of initial sugar contents on the quality of compound fruit wine of red pitaya and passion fruit
2.1.3 红心火龙果和百香果质量比的确定
红心火龙果和百香果质量比对红心火龙果百香果复合果酒品质的影响见图3。由图3可知，当红心火龙果和百香果的质量比为100∶5.0、100∶7.5、100∶10.0时，感官评分及酒精度均逐渐增加；当红心火龙果和百香果的质量比为100∶10.0时，感官评分达到最大值84.0分，此时，酒精度为11.8%vol；当红心火龙果和百香果的质量比为100∶12.5、100∶15.0时，感官评分逐渐下降，酒精度的变化逐渐平稳。百香果酸高糖低[31]，火龙果糖多酸少[14]，二者比例的改变对酒精度影响不大，但对终产品风味影响较大。百香果过少，果香薄弱；百香果偏多，酸高致使果酒口感酸涩。因此，选取最佳火龙果∶百香果质量比为100∶10.0。
图3 红心火龙果和百香果质量比对红心火龙果百香果复合果酒品质的影响
Fig.3 Effect of mass ratio of red pitaya and passion fruit on the quality of compound fruit wine of red pitaya and passion fruit
2.1.4 硫酸铵添加量的确定
酿酒酵母正常生长代谢所需要的最低可同化氮浓度为140～150 mg/L，不同酵母最适可同化氮素含量不同（200～500 mg/L），且果酒香气的形成与初始氨基酸态氮含量相关[36]。
硫酸铵添加量对红心火龙果百香果复合果酒品质的影响见图4。由图4可知，随着硫酸铵添加量在0～100 mg/L范围内的增加，酒精度及感官评分均逐渐增加；硫酸铵添加量为100 mg/L时，酒精度及感官评分均达到最高值，分别为12%vol、83.6分；当硫酸铵添加量＞100 mg/L之后，酒精度和感官评分均下降。因此，选取最佳硫酸铵添加量为100 mg/L。
图4 硫酸铵添加量对红心火龙果百香果复合果酒品质的影响
Fig.4 Effect of ammonium sulfate addition on the quality of compound fruit wine of red pitaya and passion fruit
2.2 响应面优化试验结果
在单因素试验结果的基础上，以感官评分（Y）为响应值，以红心火龙果与百香果质量比（A）、初始糖度（B）、发酵温度（C）为自变量，进行响应面试验优化。3因素3水平的Box-Behnken中心组合试验设计及结果见表3，方差分析见表4。
表3 Box-Behnken试验设计及结果
Table 3 Design and results of Box-Behnken tests
续表
表4 回归模型方差分析
Table 4 Variance analysis of regression model
注：“**”表示对结果影响极显著（P＜0.01），“*”表示对结果影响显著（P＜0.05）。
利用Design Expert 10.0.8软件对表3的试验结果进行二次多项回归拟合，获得复合果酒感官评分与各因素间的二次多项回归方程为：
由表4可知，模型极显著（P值＜0.01），失拟项不显著（P值=0.156 7＞0.05），决定系数R2为0.983 9，调整决定系数R2Adj为0.963 1，说明所拟合方程可靠性较高；感官评分的变异系数（coefficient of variation，CV）为0.75%，说明该模型重现性较好。由P值可知，一次项C、二次项A2、B2、C2对感官评分影响极显著（P＜0.01），一次项A、交互项BC对感官评分影响显著（P＜0.05）。由F值可知，影响复合果酒感官评分的主次次序为发酵温度（C）＞火龙果与百香果质量比（A）＞初始糖度（B）。
通过响应曲面的陡峭性状和等高线的形状及稀疏程度，可反映各因素间交互作用对感官评分的影响。各因素间交互作用对复合果酒感官品评得分影响的响应曲面图见图5。由图5可知，初始糖度（B）与发酵温度（C）交互作用的响应面曲面坡面陡峭，等高线图接近椭圆形，对感官评分有极显著的影响，说明二者交互作用显著（P＜0.05），这与方差分析结果一致。
图5 各因素间交互作用对红心火龙果百香果复合果酒感官评分影响的响应曲面和等高线
Fig.5 Response surface plots and contour lines of effects of interaction between each factor on sensory score of compound wine of red pitaya and passion fruit
通过DesignExpert10.0.8软件分析出最优的发酵条件为：红心火龙果与百香果的质量比100∶10.2、初始糖度21.806%、发酵温度21.721 ℃，在该条件下复合果酒感官评分预测值为84.76分。考虑到试验可操作性，将优化发酵条件修正为：红心火龙果百香果复合果浆的质量比100∶10、初始糖度22.0%、发酵温度22 ℃，按照修正后的发酵条件进行3次平行验证试验，得到红心火龙果百香果复合果酒感官评分实际值为84.72分，与预测值接近，表明此模型可用于红心火龙果百香果复合果酒发酵条件优化。
2.3 红心火龙果百香果复合果酒的品质指标
红心火龙果百香果复合果酒的酒精度为11.87%vol，pH值为3.8，总糖含量为54.94 g/L，总酸含量为3.73 g/L，甲醇含量为102.17 mg/L，均符合农业行业标准NY/T 1508—2017《绿色食品果酒》的标准要求；其颜色鲜艳、果香馥郁，口感爽甜，感官评分为84.72分；另外，复合果酒的L*值为24.07，a*值为51.77，b*值为26.78，甜菜红素含量值105.98 mg/L，DPPH清除率达61.03%。
2.4 复合果酒发酵过程中色泽、甜菜红素含量和DPPH自由基清除率的变化
2.4.1 复合果酒发酵过程中颜色参数的变化
发酵过程中红心火龙果百香果复合果酒颜色参数的变化见图6。
图6 发酵过程中红心火龙果百香果复合果酒颜色参数的变化
Fig.6 Changes of color parameters of compound wine of red pitaya and passion fruit during fermentation process
由图6可知，在整个发酵过程中，L*值相对平稳、变化不明显，a*值、b*值总体上均呈下降趋势；当发酵时间为8 d时，酒液的L*值为21.674，a*值为55.232，b*值为25.376。a*值在发酵过程中的下降可能与花色苷、甜菜红素等色素的损失相关，而b*值的下降可能与影响黄色的酚类物质被氧化有关[24，32]。
2.4.2 发酵过程中甜菜红素含量和DPPH自由基清除率的变化
发酵过程甜菜红素含量和DPPH自由基清除率的变化见图7。
图7 发酵过程中红心火龙果百香果复合果酒DPPH自由基清除率和甜菜红素含量的变化
Fig.7 Changes of DPPH radical scavenging rate and betacyanin content of compound wine of red pitaya and passion fruit during fermentation process
由图7可知，在发酵过程中甜菜红素一直呈现下降趋势，这可能与甜菜红素不稳定，易受热、氧、光线和pH等因素影响以及发酵过程存在酵母吸附、聚合沉降等有关[24-25]；DPPH自由基清除率在主发酵阶段（发酵1～4 d）明显下降，在后发酵阶段（发酵5～8 d）基本趋于平缓；当发酵时间为8 d时，酒液的甜菜红素含量值130.315 mg/L，DPPH自由基清除率达68.91%。DPPH自由基清除率的降低，可能与发酵液中的甜菜红素、多酚和黄酮等抗氧化性物质的损失有关，尤其是甜菜红素[35]。
3 结论
本研究以红心火龙果和百香果为主要原料进行红心火龙果百香果复合果酒酿造工艺的优化，得到复合果酒最佳发酵工艺条件为：硫酸铵添加量100 mg/L，发酵温度22 ℃，火龙果和百香果质量比100∶10，初始糖度22%。在此优化条件下，复合果酒的酒精度为11.87%vol，酒体颜色鲜艳、果香馥郁，感官评分为84.72分；其总糖含量为54.94 g/L，总酸含量为3.73 g/L，甲醇含量为102.17 mg/L，甜菜红素含量为105.98 mg/L，DPPH自由基清除率达61.03%。在发酵过程中，甜菜红素含量、a*值、b*值及DPPH自由基清除率均呈下降趋势，而L*值在发酵过程中变化不明显。本研究为红心火龙果和百香果的深加工提供了一定的数据支持，而该复合果酒色泽和风味稳定性有待进一步研究。
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