柑橘（Citrus reticulata Blanco）是世界上第一大水果，富含水分、糖类、蛋白质、有机酸、维生素、矿物质、膳食纤维及多种生物活性成分，如类黄酮、类胡萝卜素、单萜、类丙醇、香豆素、甘油糖脂质、吖啶酮等，具有扩张冠状动脉，增加冠状动脉血流量的作用，也可通过抗氧化和清除自由基作用，抑制癌细胞的基因表达及增殖，诱导癌细胞凋亡等实现抗癌作用[1-3]。桑葚（Fructus mori）又名桑果、桑枣、葚子等，味甜汁多，成熟的桑葚质地油润，酸甜适口，是人们常食的水果之一。桑葚营养价值较高，富含水分、蛋白质、转化糖、游离酸、粗纤维、维生素、芦丁、矿物质、桑色素、花青素（主要为矢车菊素）、芸香苷、鞣质、挥发油、磷脂、白藜芦醇等，是“药食同源”的农产品之一[4-6]。
南充市素有“果城”之称，盛产柑橘和桑葚，主要以鲜售为主，深加工的产品少，造成较大的经济损失。果酒历史悠久，深受广大消费者的喜爱，其酿造品质不仅和所选水果原料有关，同时在很大程度上与发酵酵母的特性有关，不同酵母菌株的发酵速率、产酒精能力和对发酵环境的适应性不同，所得的发酵果酒品质和风味也不同[7-8]。市场上的酵母菌种质量参差不齐，实际工业酿酒会出现如高温高酸、高浓度乙醇等不利于正常菌株发酵的胁迫环境，抑制酵母的发酵活性和增殖能力[9]，因此，发酵能力和产香气能力都强且适应性广的菌种较少。
本研究着眼于南充市本地所产柑橘和桑葚，从其自然发酵果肉汁液中筛选具有高发酵产酒精和产酯性能的优质酵母，对菌株生长性能及耐受性进行分析，并通过生理生化试验及分子生物学技术对其进行菌种鉴定，以期为发酵柑橘桑葚复合果酒以及其他果酒提供优良菌种。
1 材料与方法
1.1 材料与试剂
1.1.1 材料
柑橘：购于南充市高坪区小龙镇农贸市场。
桑葚：新鲜完好、无腐烂碰伤的成熟桑葚，购于四川省南充启康食品有限公司，于4 ℃保存24 h待用。
1.1.2 培养基
孟加拉红固体培养基[10]：蛋白胨5 g/L、葡萄糖10 g/L、磷酸二氢钾1 g/L、硫酸镁0.5 g/L、琼脂15 g/L、孟加拉红0.03g/L、氯霉素0.1g/L，pH值7.2，121℃高压蒸汽灭菌20min。
酵母浸出粉胨葡萄糖（yeast extract peptone dextrose，YPD）液体培养基[11]：蛋白胨20 g/L、酵母提取物10 g/L、葡萄糖20 g/L，自然pH值，121 ℃高压蒸汽灭菌20 min。
发酵培养基[11]：柑橘汁和葡萄汁按1∶1（V/V）混合，3 000 r/min离心10 min，用葡萄糖调节含糖量至30%，其中的糖含量近似为可溶性固形物，121 ℃高压蒸汽灭菌20 min。
1.1.3 主要试剂
盐酸、氢氧化钠、无水乙醇、硝酸钾、硫酸铵等（均为分析纯）：成都市科隆化学品有限公司；脱氧核糖核酸（deoxy-ribonucleic acid，DNA）凝胶回收试剂盒、引物、TSINGKE高纯度低电渗琼脂糖：北京擎科生物科技有限公司。其他试剂均为分析纯或生化试剂。
1.2 仪器与设备
L6S紫外可见分光光度计：上海仪电分析仪器有限公司；SW-CJ-2FD超净工作台：苏州安泰空气技术有限公司；SHP-180生化培养箱：金坛市杰瑞尔电器有限公司；UPY-111-102优普超纯水制造系统：四川优普超纯科技有限公司；2720 thermal cycler聚合酶链式反应（polymerase chain reaction，PCR）仪：德国Applied Biosystems公司；JY04S-3C凝胶成像仪：北京君意东方电泳设备有限公司。
1.3 方法
1.3.1 原料预处理
分别称取柑橘、桑葚各100 g，用无菌水清洗，加入无菌水250 mL，用高速组织捣碎机破碎2 min，将果肉汁液放入500 mL无菌的锥形瓶密封自然发酵。
1.3.2 酵母菌菌株的分离
当锥形瓶中柑橘桑葚中发酵产生的酒精气味浓郁时，振荡混匀，取汁液1 mL进行10倍梯度系列稀释，稀释至10-5，取原液和稀释度为10-1、10-2、10-3、10-4、10-5的稀释液各100 μL分别涂布于孟加拉红固体培养基中，于28 ℃条件下倒置培养，待平板上长出菌落，挑选具有典型酵母菌特性的单菌落进行划线分离纯化。
1.3.3 酵母菌菌株筛选
产酒精性能测试：将分离得到的酵母菌菌株接于YPD液体培养基，28 ℃、100 r/min条件下活化36 h后，吸取5 mL于45 mL发酵培养基中，先在28 ℃、100 r/min的条件下发酵24 h，然后在28 ℃静置发酵至72 h[11]，依据GB 5009.225—2016《食品安全国家标准酒中乙醇浓度》测定发酵液中的乙醇含量[12]。
产酯能力测试：将28 ℃、100 r/min条件下活化36 h后的酵母菌菌株以2%（V/V）的接种量接种到YPD液体培养基中，初始糖度调整为12%，pH值为6，28 ℃、150 r/min条件下摇瓶培养5 d，采用皂化回流法测定其总酯含量[13-14]。
1.3.4 酵母菌菌株生长特性及耐受性能测试
（1）生长曲线的测定
将筛选的酵母菌接于YPD液体培养基中，28 ℃静置培养36 h后，再将酵母菌培养液按3%（V/V）的接种量接种于YPD液体培养基中，28 ℃静置培养72 h，在培养0 h、4 h、8 h、16 h、24 h、36 h、48 h、60 h、72 h时取样，在波长560 nm处测定酵母菌发酵液的吸光度值，每个菌株重复测定3次[15]。以培养时间（x）为横坐标，吸光度值（y）为纵坐标，采用Microsoft Excel 2016绘制生长曲线。
（2）耐受性的测定
糖耐受性：将筛选的酵母菌接于YPD液体培养基中，28 ℃静置培养36 h后，分别接种100 μL酵母菌培养液至葡萄糖质量分数分别为20%、30%、40%、50%、60%、70%的YPD液体培养基，28 ℃静置培养72 h，做3组平行实验，在波长560 nm处测定吸光度值，并记录[16]。
酸耐受性：将筛选的酵母菌接于YPD液体培养基中，28 ℃静置培养36 h后，分别接种100 μL酵母菌培养液至pH值分别为2.0、3.0、4.0、5.0的YPD液体培养基，28℃静置培养72 h，做3组平行实验，在波长560 nm处测定吸光度值，并记录[16]。
乙醇耐受性：将筛选的酵母菌接于YPD液体培养基中，28 ℃静置培养36 h后，分别接种100 μL酵母菌培养液至乙醇体积分数分别为10%、14%、18%、22%的YPD液体培养基，摇匀，28 ℃静置培养72 h，做3组平行实验，在波长560 nm处测定吸光度值，并记录[16]。
1.3.5 酵母菌菌种的鉴定
形态学观察及生理生化鉴定：参照《酵母菌的特征与鉴定手册》[17]及《微生物学实验技术》[18]，分别对筛选所得酵母菌株进行形态观察、糖发酵、碳源同化、氮源同化等生理生化试验。
分子生物学鉴定：使用TSINGKE植物DNA提取试剂盒（通用型）提取酵母菌的基因组DNA，以其为模板，采用真菌鉴定通用引物ITS1（5'-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3'）和ITS4序列（5'-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3'）进行PCR扩增。委托北京擎科生物科技有限公司成都分公司对PCR扩增产物进行测序，采用ContigExpress拼接测序结果，将拼接好的序列提交至美国国立生物技术信息中心（national center for biotechnology information，NCBI）的GenBank数据库中，采用基本局部比对搜索工具（basic local alignment search tool，BLAST）进行比对分析，选取同源性较高的模式菌株的ITS rDNA基因序列，采用MEGA11中的邻接（neighbor-joining，NJ）法构建系统发育树，确定筛选所得的目标酵母菌种。
2 结果与分析
2.1 酵母菌菌株的分离
采用孟加拉红培养基从自然发酵的柑橘、桑葚混合果肉汁中共分离挑选出32株具有典型酵母菌菌落特征的单菌落，编号分别为S1～S32，其菌落形态主要呈现椭圆形或圆形，乳白色及白色，质地均匀，表面光滑湿润，易挑起，符合酵母菌的基本特征。
2.2 优良酵母菌菌株的筛选
2.2.1 产酒精能力测试结果
32株酵母菌菌株发酵后，测定发酵液的酒精度，其中酒精浓度最高的10株酵母菌株见图1。
图1 酵母菌菌株酒精产量测定结果
Fig.1 Determination results of ethanol production of yeast strains
由图1可知，不同酵母菌株发酵产酒精的能力不同，10株酵母菌株发酵液的酒精度均＞6.00%vol，其中菌株S24产酒精能力最强，酒精度可达10.74%vol，产酒精能力的强弱是评价优质酵母的重要性能指标，酵母利用糖发酵产乙醇含量高，这对果酒的发酵品质有积极作用[19]。
2.2.2 产酯能力测试结果
32株酵母菌菌株发酵后，测定发酵液的总酯产量，其中总酯产量最高的10株酵母菌株见图2。
图2 酵母菌菌株总酯产量测定结果
Fig.2 Determination results of total ester yield of yeast strains
由图2可知，不同的酵母菌菌株生香产酯的能力不同，10株酵母菌菌株的总酯产量均＞1.46 g/L，具有明显的香气。综合产酒精和产酯的能力，确定酵母菌株S4、S15、S18、S24为目标菌株。
2.3 生长曲线
4株酵母菌株在YPD液体培养基中的生长曲线见图3。由图3可知，菌株S4、S15、S18、S24的迟滞期较短，在4 h之后进入对数期，24 h后进入稳定期，且适应性良好。
图3 酵母菌菌株S4、S5、S18、S24的生长曲线
Fig.3 Growth curve of yeast strains S4,S5,S18 and S24
2.4 耐受性分析结果
2.4.1 糖耐受性测试结果
4株酵母菌菌株的糖耐受性见表1。
表1 酵母菌菌株的糖耐受性测定结果
Table 1 Determination results of glucose resistance of yeast strains
注：OD560nm值≥1.00，用“+++”表示大量生长；0.50≤OD560nm值＜1.00，用“++”表示明显生长；0.2≤OD560nm值＜0.5，用“+”表示生长，0.05≤OD560nm值＜0.2，用“*”表示微量生长；OD560nm值＜0.05，用“-”表示不生长。下同。
由表1可知，随着葡萄糖质量分数的升高，酵母的耐受性逐渐降低，4株酵母菌菌株均能耐受60%的葡萄糖含量，其中菌株S24在70%葡萄糖含量的培养基中能微量生长，其余3株不生长。酵母在生长过程中会利用糖作为碳源进行有氧呼吸，进而发酵产酒精，当糖含量较低时，酵母生长都较好，当糖含量过高，高渗透压会导致酵母细胞失水从而质壁分离，从而抑制其生长繁殖，因此，随着葡萄糖含量的增加，4株酵母的生长逐渐受到抑制。
2.4.2 酸耐受性测试结果
4株酵母菌菌株的酸耐受性见表2。
由表2可知，在弱酸性条件下，4株酵母菌菌株的长势较好，酸性越弱，长势越好，酸性越强，酵母菌的生长受到抑制。当pH值为2.0时，4株酵母菌菌株均可以生长，具有较强的耐酸性能，且菌株S15、S24呈现生长的状态。
表2 酵母菌菌株的酸耐受性测定结果
Table 2 Determination results of acid resistance of yeast strains
2.4.3 乙醇耐受性能测试结果
4株酵母菌菌株对乙醇的耐受性见表3。
表3 酵母菌菌株的乙醇耐受性测定结果
Table 3 Determination results of alcohol resistance of yeast strains
由表3可知，4株酵母菌菌株随着乙醇体积分数的增加，生长逐渐受到抑制，其中菌株S24乙醇耐受能力最强，在乙醇体积分数为22%时依然能够生长。我国果酒的酒精度要求范围在7%vol～18%vol[20]，菌株S4、S24可在乙醇体积分数18%条件下明显生长。
综上，酵母菌株S24的糖、酸、乙醇耐受性较好，起酵时间短，环境适应性强，为优质酵母菌。
2.5 酵母菌S24的鉴定结果
2.5.1 生理生化鉴定结果
酵母菌菌株S24的生理生化实验结果见表4。
表4 菌株S24的生理生化实验结果
Table 4 Physiological and biochemical test results of strain S24
注：“+”表示结果呈阳性。
由表4可知，酵母菌菌株S24能发酵并同化葡萄糖、蔗糖、麦芽糖和乳糖，能同化硝酸钾、硫酸铵，能同化肌醇、乙醇、甘油和山梨醇，同时能产酸、产酯，参照《酵母菌的特征与鉴定手册》[17]，初步鉴定菌株S24为毕赤酵母属（Pichia sp.）
2.5.2 分子生物学鉴定结果
基于ITS序列构建菌株S24的系统发育树，结果见图4。
图4 基于ITS序列菌株S24的系统发育树
Fig.4 Phylogenetic tree of strain S24 based on ITS sequence
由图4可知，菌株S24与Pichia kluyveri strain AUMC 11238在同一分支上，说明与Pichia kluyveri具有比较近的同源性，结合生理生化实验结果，确定该菌株为克鲁维毕赤酵母（Pichia kluyveri）。克鲁维毕赤酵母属于非酿酒酵母，在产酯生香方面具有积极作用，同时也具有较强的发酵能力[21]。研究发现，克鲁维毕赤酵母发酵果酒会增加果香硫醇、乙酸乙酯、乙酸异戊酯的含量，产生更多的花香、果香等复合香气，这和克鲁维毕赤酵母的基因组控制的酿造学特性也有关系[22-23]，因此，克鲁维毕赤酵母对果酒的发酵，特别是复合果酒的发酵至关重要，在果酒的生产中也越来越被重视[24-26]。
3 结论
以自然发酵的柑橘和桑葚混合果肉汁为材料，利用孟加拉红固体培养基分离获得32株酵母菌，其中菌株S4、S15、S18和S24产酒精和产酯能力较高，且菌株S24生长性能和耐受性较好，其发酵液酒精度为10.74%vol，总酯产量为2.05 g/L，生长适应性强，可耐受70%的葡萄糖含量、pH值2.0的强酸环境和体积分数22%的乙醇。经形态学观察、生理生化实验以及分子生物学鉴定，该菌株被鉴定为克鲁维毕赤酵母（Pichia kluyveri）。本研究筛选得到的性能优良的克鲁维毕赤酵母菌种，来自于自然发酵的柑橘和桑葚混合果肉汁液，提高了柑橘、桑葚复合果酒菌种的安全性和适应性，同时也有利于保证复合果酒的品质和风味，对柑橘和桑葚产业的发展具有促进作用。
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