辣椒为茄科类植物，又名海椒、番椒、秦椒，原产于南美洲，现已在世界各地广泛种植，成为世界性的蔬菜和加工调味品[1-2]。目前，我国是世界的辣椒生产和消费大国。辣椒营养丰富，具有保健功能，是一种药食同源植物，被广泛应用于食品各个领域，目前关于辣椒及其制品高达上千种，其副产物辣椒籽较多，应用研究较少[3]。辣椒籽主要含膳食纤维、蛋白质和脂肪，还含有氨基酸、维生素、黄酮、多酚、辣椒碱、微量元素等活性成分[4-5]。目前辣椒籽大部分直接售卖给饲料厂，少部分用于提取精油并研究其抗氧化性[6]、抗肥胖活性[7]、抑菌活性[8]等，还有一些用辣椒籽提取蛋白[9]、提取膳食纤维[10]、提取辣椒碱[11]等研究。
辣椒籽油国内外研究较多，董殊廷等[12]采用热油浸提辣椒籽并采用气相色谱-质谱（gas chromatography-mass spectrometer，GC-MS）测定其香气成分，结果表明，浸提温度180 ℃、料液比1∶4（g∶mL），其主要香气物质为己醛（10.97%）、（CH3）2CCHCN（6.07%）、戊烷（4.91%）、辛烷（3.32%）、2-庚烯醛（2.16%）、（E）-2-戊烯醛（2.13%）等，提取的辣椒籽油颜色浅红，熟香风味较重且含有糊香，不能代表辣椒籽真实的香气；毛永杨等[13]采用酶解-乙醇辅助提取辣椒籽油并进行工艺优化，结果表明：最佳工艺参数为辣椒籽粒度80目、料液比1∶6（g∶mL）、复合酶为0.8%的中性蛋白酶和1.0%的果胶酶；最佳酶解条件为：酶解pH 5.5、酶解温度50 ℃、酶解时间5.5 h。该法提取的辣椒籽油得率较高，颜色浅黄，但采用中性蛋白酶和果胶酶酶解后导致油有苦味，同时含有溶剂乙醇的残留，并且乙醇易使精油变色；卢可可等[14]采用亚临界丁烷对炒制一定时间的辣椒籽进行提取且进行香气分析，结果表明，在炒制时间为5 min，炒制温度＜140 ℃时，芳樟醇、月桂烯、双戊烯是辣椒籽油的主要香气物质，当温度＞140 ℃时，吡嗪类化合物和2-戊基呋喃是辣椒籽油的主要香气物质。亚临界提取温度较低，对辣椒籽香气保留较好，且能萃取出辣椒籽部分有效成分，但是含有溶剂丁烷，易造成残留；迟明梅等[15]采石油醚按固液比1∶50（g∶mL）在80 ℃对辣椒籽油提取3 h，其得率为21.26%，后期去除溶剂较麻烦且易造成残留。
目前，关于香辛料的提取方法主要有水蒸气蒸馏法[16]、超临界CO2萃取法[17]、压榨法[18]、溶剂提取法[13]、亚临界萃取法[19]及一些辅助方法（超声波[20]、微波[21]、酶解[22]等）。水蒸气蒸馏法温度较高，对精油活性成分有破坏作用，提取的精油含有的滋味物质较少且得率较低；压榨法操作简便，提取的油脂营养成分保护较好，但是对油脂的利用率不高；溶剂提取法精油颜色较好，得率较高，但是后期去除溶剂较麻烦且产品易残留溶剂；亚临界萃取法是一种新型的提取技术，提取得率较高，精油活性成分保护更好，且成本较低，但脱除溶剂成为必要工序，有食品安全隐患；而超临界CO2提取法[23]操作温度较低，可防止热敏性物质被破坏，能最大限度保留精油香气和滋味成分，且无溶剂残留。本研究为了提升辣椒籽综合利用价值，采用单因素试验及正交试验优化超临界CO2提取辣椒籽精油生产工艺，并采用气质联用（GC-MS）技术分析其挥发性香气成分组成，以期为辣椒籽精油生产提供理论支撑。
1 材料与方法
1.1 材料与试剂
内黄新一代辣椒籽：四川味觉食品有限公司；CO2和氦气（纯度均＞99.99%）：徐州路友气体有限公司。其他试剂均为国产分析纯。
1.2 仪器与设备
GAR单层网链式热风烘干设备：河南旭通智能科技有限公司；QWJ-800大型食品粉碎机：江阴市惠宗机械有限公司；HA420-40-96（400L×3）型超临界萃取装置：贵州航天乌江机电设备有限责任公司；Agilent 9000气相色谱仪-5977B质谱仪：美国安捷伦公司。
1.3 方法
1.3.1 辣椒籽预处理
干内黄辣椒籽置于单层网链式热风烘干设备，设置温度60 ℃连续干燥，调节水分约至10%。干燥好的辣椒籽用大型食品粉碎机粉碎，过60目筛。制得辣椒籽粉于常温25 ℃干燥储藏。
1.3.2 超临界CO2提取辣椒籽精油
称取200 kg粉碎后的辣椒籽，装入萃取罐中，在萃取温度55 ℃、萃取时间2.5 h、CO2流量28 L/h条件下得到辣椒籽精油，平行试验3次，精油得率计算公式如下：
1.3.3 辣椒籽精油萃取工艺优化单因素试验
称取200 kg粉碎辣椒籽，装入萃取罐中，分别考察萃取压力（20 MPa、25 MPa、30 MPa、35 MPa、40 MPa）、萃取温度（35 ℃、40 ℃、45 ℃、50 ℃、55 ℃）、萃取时间（2.5 h、3.0 h、3.5 h、4.0 h、4.5 h）、CO2流量（22 L/h、24 L/h、26 L/h、28 L/h、30 L/h）对精油得率的影响，解吸压力6 MPa，解吸温度65 ℃。
1.3.4 辣椒籽精油萃取工艺优化正交试验
在单因素试验的基础上，以萃取压力（A）、萃取温度（B）、萃取时间（C）、CO2流量（D）为影响因素，以辣椒籽精油得率为评价指标，设置L9（34）试验进行4因素3水平正交试验。正交试验因素与水平见表1。
表1 超临界CO2萃取工艺优化正交试验因素与水平
Table 1 Factors and levels of orthogonal tests for supercritical CO2 extraction process optimization
1.3.5 辣椒籽精油挥发性香气成分GC-MS分析
样品预处理：量取辣椒籽精油样品3 mL加入10 mL顶空瓶中，将已经活化二乙烯基苯/羧基/聚二甲基硅氧烷萃取头插入萃取瓶中顶空吸附30 min后取下萃取头，在GC仪进样口240 ℃条件下解吸5 min，每个样品重复萃取3次。
GC条件：色谱柱为DB-WAX型毛细管柱（30 m×0.25 mm×0.25 m）；载气为高纯氦气（He）；进样口温度250 ℃；流速1.4 mL/min；分流比33∶1；气化室温度250 ℃；升温程序：起始温度40 ℃，保持3 min，升温速率5 ℃/min，升温到250 ℃，保持20 min。
MS条件：电子电离（electron ionization，EI）源；离子源温度230 ℃，接口温度280 ℃，扫描速度769/s；质量扫描范围40～400 m/z；
定性定量方法：利用Mass Hunter工作站，美国国家标准技术研究院（national institute of standards and technology，NIST）17质谱库检索鉴定各种化学成分，按峰面积归一化法确定各组分的相对含量。
1.3.6 数据处理
正交试验采用SPSS20.0软件设计分析。差异显著性分析采用数据处理系统（data processing system，DPS）7.5，P＜0.05认为差异显著。试验样品均有3次独立重复。
2 结果与分析
2.1 辣椒籽精油萃取工艺优化单因素试验
2.1.1 萃取压力对辣椒籽精油得率的影响
CO2超临界萃取压力对辣椒籽精油得率的影响见图1。由图1可知，随着萃取压力在20～40 MPa范围内的增加，辣椒籽精油得率呈先上升后趋于平稳趋势。当萃取压力在20～30 MPa时，辣椒籽精油得率随萃取压力的增加而显著增加（P＜0.05）；当萃取压力为30 MPa时，辣椒籽精油得率为6.87%；当萃取压力＞30 MPa之后，辣椒籽精油得率增加不显著（P＞0.05），且增加设备耐压程度、操作难度、设备投资费用等。因此，选择最佳萃取压力为30 MPa。
图1 萃取压力对精油得率的影响
Fig.1 Effect of extraction pressure on the yield of essential oil
2.1.2 萃取温度对辣椒籽精油得率的影响
CO2超临界萃取温度对辣椒籽精油得率的影响见图2。
图2 萃取温度对精油得率的影响
Fig.2 Effect of extraction temperature on the yield of essential oil
由图2可知，随着萃取温度在35～55 ℃范围的增加，辣椒籽精油得率总体呈先上升后下降的趋势。当萃取温度在35～45 ℃时，辣椒籽精油得率随萃取温度增加呈显著增加（P＜0.05）；当萃取温度在45 ℃时，辣椒籽精油得率最高，为6.88%；当萃取温度在45～55 ℃时，辣椒籽精油得率连续显著降低（P＜0.05）。因此，选择最佳萃取温度为45 ℃。
2.1.3 萃取时间对辣椒籽精油得率的影响
CO2超临界萃取时间对辣椒籽精油得率的影响见图3。
图3 萃取时间对精油得率的影响
Fig.3 Effect of extraction time on the yield of essential oil
由图3可知，随着萃取时间在2.5～4.5 h范围内的增加，辣椒籽精油得率呈先上升后趋于平缓的趋势。当萃取时间在2.5～3.5 h时，辣椒籽精油得率随萃取时间增加而显著增加（P＜0.05）；当萃取时间在3.5 h时，辣椒籽精油得率为6.77%；当萃取时间在4.0～4.5 h时，辣椒籽精油得率不再有显著变化（P＞0.05）。因此，选择最佳萃取时间为3.5 h。
2.1.4 CO2流量对辣椒籽精油得率的影响
流量是萃取过程中的一个经济型指标，也是影响得率的重要因素之一。流量的变化对萃取率的影响应从两方面考虑，即流量对传质速率的影响和流量对萃取时间的影响。流量的增加导致萃取器内流速增加，萃取时间减少，不利于萃取；随着流量的增加，与物质间的传质速率提高，从而使萃取速率增大[24]。CO2超临界萃取流量对辣椒籽精油得率的影响见图4。
图4 CO2流量对精油得率的影响
Fig.4 Effect of CO2 flow rate on the yield of essential oil
由图4可知，随着萃取流量在22～30 L/h范围内的增加，辣椒籽精油得率呈先上升后趋于平稳的趋势。当萃取流量在22～28 L/h时，辣椒籽精油得率随萃取流量的增加而显著增加（P＜0.05）；当萃取流量由28 L/h上升到30 L/h时，辣椒籽精油得率无显著性变化（P＞0.05）。因此，选择最适CO2流量为28 L/h。
2.2 辣椒籽精油萃取工艺优化正交试验
在单因素试验的基础上，以精油萃取得率为评价指标，考察萃取压力（A）、萃取温度（B）、萃取时间（C）和CO2流量（D）对辣椒籽精油得率的影响，设置L9（34）正交试验进行4因素3水平正交试验，正交试验结果与分析见表2，方差分析结果见表3。
由表2可知，对结果影响由大到小顺序为萃取压力＞萃取温度＞萃取时间＞CO2流量，最优组合为A2B2C3D3，即萃取压力30 MPa、萃取温度45 ℃、萃取时间4.0 h、CO2流量30 L/h。在此最佳萃取工艺条件下进行3次平行验证试验，3次萃取平均辣椒籽精油得率为7.04%，且在此条件下辣椒籽精油的得率高于正交试验方案中的最高值6.91%，说明该优化方案是可行的。由表3可知，萃取压力对结果影响显著（P＜0.05），萃取温度、CO2流量及萃取时间对结果影响不显著（P＞0.05），这与相关研究报道结果一致[23-24]。
表2 超临界CO2萃取工艺优化正交试验结果与分析
Table 2 Results and analysis of orthogonal tests for supercritical CO2 extraction process optimization
表3 正交试验结果方差分析
Table 3 Variance analysis of orthogonal tests results
注：“*”表示对结果影响显著（P＜0.05）。
2.3 辣椒籽精油挥发性香气成分分析
辣椒籽精油挥发性香气成分GC-MS分析总离子流色谱图见图5，辣椒籽精油挥发性香气成分测定结果见表4。
图5 超临界CO2萃取辣椒籽精油挥发性香气成分GC-MS分析总离子流色谱图
Fig.5 Total ion chromatogram of volatile aroma components in pepper seed essential oil extracted by supercritical CO2 analysis by GC-MS
由表4可知，辣椒籽精油中共检出挥发性香气化合物54种，其中种类最多、含量最丰富的为烯烃类（16种，53.04%），其次为醇类（15种，29.83%），酯类（9种，9.95%）、酮类（4种，2.5%）、酚类（2种，0.37%）、醛类（2种，0.25%）、酸类（2种，0.18%）、烷烃类（2种，0.11%）、芳香烃类（1种、0.25%）、萜类（1种，2.54%）。CO2超临界萃取辣椒籽精油中相对含量＞1%的16种主要挥发性香气化合物，依次为：芳樟醇（23.74%）、D-柠檬烯（17.26%）、桧烯（10.78%）、β-蒎烯（7.67%）、乙酸芳樟酯（7.06%）、3-蒈烯（4.78%）、3-异丙基-6-亚甲基-1-环己烯（3.57%）、α-异松油烯（2.72%）、桉叶油醇（2.54%）、（1S,4R,5R）-3-崔柏酮（2.35%）、萜品油烯（2.18%）、乙醇（1.46%）、（1R,4E,9R）-4,11,11-三甲基-8-甲基-双环[7.2.0]4-十-烯（1.32%）、β-侧柏烯（1.28%）、4-萜烯醇（1.14%）、乙酸香叶酯（1.11%）。
表4 辣椒籽精油挥发性香气成分GC-MS分析结果
Table 4 Results of volatile aroma components in pepper seed essential oil analysis by GC-MS
续表
萃取的辣椒籽精油色泽浅红，具有辣椒的特征风味：清新香甜。醇类、烃类化合物大多气味清新，如芳樟醇具有浓郁青香带甜的木青气息，D-柠檬烯具有新鲜橙子香气及柠檬样香气，桧烯具有水果风味的甜香，β-蒎烯具有特有的松节油香气，干燥木材和松脂气味。卢可可等[14]通过亚临界萃取技术辣椒籽进行萃取制备得到辣椒籽油，采用同时蒸馏结合GC-MS法，鉴定出辣椒籽油中芳樟醇、月桂烯、双戊烯为其主要香气物质，与本研究结果相似。甄润英等[25]利用固相微萃取对乙醇常温提取与酶解-乙醇辅助法提取的辣椒籽油进行风味测定，其结果表明：酶解-乙醇辅助法提取的辣椒籽油主要为烃类14种、醇类7种、酯类12种，乙醇常温提取主要为烃类15种、醇类7种、酯类6种，与本研究结果一致。
3 结论
采用单因素试验和正交试验对超临界CO2萃取辣椒籽精油工艺进行了优化，结果表明，当萃取压力30 MPa、萃取温度45 ℃、萃取时间4 h、CO2流量30 L/h时，辣椒籽精油得率为7.04%。辣椒籽精油中共鉴定出54种挥发性香气成分，主要含有烯烃类（16种，53.04%），醇类（15种，29.83%）、酯类（9种，9.95%），其中相对丰度含量较高的化合物为芳樟醇（23.74%）、D-柠檬烯（17.26%）、桧烯（10.78%）、β-蒎烯（7.67%）、乙酸芳樟酯（7.06%）等，其共同赋予辣椒籽精油清新香甜风味。CO2超临界萃取法应用于辣椒籽精油提取，效果较优，为辣椒籽的进一步开发利用提供了研究基础。
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