酵子由小麦粉、水自然发酵制成，是由多种能产气产香的活性微生物组成的发酵剂和生物疏松剂[1-3]。作为传统发酵剂，酵子发酵后的面食咀嚼性较高，具有质地松软、香气丰富等特点[4]。但是酵子中微生物组成不稳定[5]，易受外界环境的影响，且各地使用酵子发酵制成的面食的香气物质具有区域性和局限性，因此使得传统发酵剂逐渐被干粉发酵剂所取代。酵子中的优势菌种是酵母菌[6]，酵母菌可将面粉中的糖类物质转化为醇类、酯类以及其他芳香气味物质[7]。研究发现，酵子中的产香酵母可以改善面团的发酵、馒头风味和滋味[8]，馒头挥发性风味成分的种类和含量均有所增长[9]。添加产香酵母发酵的面团，挥发性风味成分明显提高，醇类和酯类增幅明显[10]。其中的乙醇、乙酸乙酯、乙酸异戊酯、异戊醇等都是发酵面食中常见的挥发性风味成分。应用酵子中优势酵母发酵面团，其面团比容得到优化且高于国标要求[11-12]。综上所述，目前研究逐渐偏向酵子中优良发酵性能酵母资源的开发。
我国发酵面食的主产地分布在各小麦产区，但目前传统面食发酵剂的研究主要集中在内蒙古及河南地区[13]，而对山东地区酵子的研究较少，山东酵子馒头与普通酵母馒头相比，香气具有明显差异[14]。因此，本研究选择酵子中优良代表性菌株分析其生长和发酵特性，将酵母菌接种到面团中培养不同时间，结合感官评价和气相色谱-质谱（gas chromatography-mass spectrometry，GC-MS）联用技术分析其风味代谢特征，以期为发酵面食生产提供参考。
1 材料与方法
1.1 材料与试剂
酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）：本实验室从山东德州手工酵子中分离纯化得到，保存于中国肉类食品综合研究中心，保藏号CGMCC NO.24005。
面粉：益海嘉里金龙鱼粮油食品有限公司；酵母浸出粉胨葡萄糖（yeast extract peptone glucose，YPD）培养基、YPD肉汤培养基：北京奥博星生物技术股份有限责任公司；脱脂乳粉：美国BDifco/BBL公司；2-甲基-3-庚酮标准品（色谱纯）、C8～C20系列正构烷烃：美国Sigma公司；氦气（He）（纯度＞99.999%）：北京氦普北方气体工业有限公司。
1.2 仪器与设备
动态顶空制样瓶：自制；TSQ8000气相色谱-质谱（GC-MS）联用仪、TG-Wax MS极性色谱柱（30 m×0.25 mm，0.25 μm）：美国赛默飞世尔科技（中国）有限公司；Centrifuge 5417R冷冻离心机：德国Eppendorf公司；Synergy H4 型酶标仪：德国BioTek公司；2-6D LSC plus真空冷冻干燥机：德国CHRIST冻干机有限公司；AC2-4S1生物安全柜：新加坡艺思高公司；LHS-100CL恒温恒湿培养箱：上海一恒仪器设备有限公司；GI54DWS高压灭菌锅：美国zealway公司；DZKW-4电子恒温水浴锅：北京中兴伟业仪器有限公司；WBL-MS503M揉面机：惠而浦（中国）股份有限公司。
1.3 实验方法
1.3.1 菌株的活化及发酵剂的制备
菌株活化：将酵母菌接种于YPD液体培养基中，28 ℃恒温培养24 h，传代活化2次。
脱脂乳粉保护剂的制备：将100 mL水在121 ℃条件下灭菌15 min后，添加10 g脱脂乳粉，巴氏杀菌后作为保护剂。
酵母菌发酵剂的制备：将活化后进入稳定期的产香酵母发酵液按照25%的添加量加入保护剂中混匀后，分装于无菌冻干瓶中，预冻后冻干，制成干粉发酵剂。
1.3.2 发酵面团的制作
在200.0 g面粉中加入0.2 g的干粉发酵剂，加入90 mL无菌水用揉面机迅速搅拌成面团状，置于28℃条件下培养24h。
1.3.3 菌株生长特性
最适pH：将活化好的菌株以1%接种量接种到15 mL YPD肉汤培养基中，调节培养基的pH分别为3.0、4.0、5.0、6.0、7.0、8.0、9.0、10.0，28 ℃条件下120 r/min培养24 h。利用酶标仪在波长600 nm处测定其OD600nm值。
最适温度：将活化后的菌株按1%接种量接种在pH自然（pH6）的培养基中，26 ℃、28 ℃、30 ℃、32 ℃、34 ℃、36 ℃条件下120 r/min培养24 h，测定方法同最适pH。
1.3.4 测定方法
（1）菌株发酵力：参照MICHELA P等[15]的方法并适当修改，将5 g面团置于20 mL有刻度的量筒中，每隔4 h记录面团体积情况。
（2）感官评价：采用定量描述分析（quantitaive descriptive analysis，QDA）法对酵母菌发酵面团的香气特征进行评价。QDA法是一种综合性的感官评定方法，不仅能描述样品感官特征，而且可以清晰的展现样品间差异。香气特征的描述词由10名训练有素的食品感官品评员依照文献[16]、GB 7099—2015《食品安全国家标准 糕点、面包》[17]和GB/T 21118—2007《小麦粉馒头》[18]并参考文献[18]，最终将香气特征词确定为水果香、花香、酒香、脂肪香、麦香、坚果香、酯香和整体香气。发酵面团香气强度感官评分标准见表1。
表1 发酵面团香气强度感官强度评分标准
Table 1 Sensory evaluation standards of aroma intensity of fermented dough
（3）挥发性风味化合物提取与测定：参照潘晓倩等[19]的方法并适当修改。将15 g发酵面团加入顶空瓶中并迅速在其中加入1 μL 2-甲基-3-庚酮（内标，0.816 μg/μL）在45 ℃水浴中平衡10 min，将老化后的萃取头在45 ℃吸附40 min后，插入GC-MS仪进样口分析。
GC条件：TG-WaxMS极性色谱柱（30 m×0.25 mm，0.25 μm）；采用不分流模式；载气为高纯氦气（He）；流速1.0 mL/min，保持2 min；进样口温度250 ℃。升温程序：柱温40 ℃维持3 min；以5 ℃/min升至200 ℃，维持1 min；再以8 ℃/min升至220 ℃维持3 min。
MS条件：电子电离（electron ionization，EI）源；电子能量70 eV，离子源温度280 ℃；接口温度260 ℃；传输线温度230℃；采用全扫描模式，质量扫描范围40～400m/z，扫描2s。
定性分析：谱库检索鉴定根据待测化合物质谱图，与美国国家标准与技术研究院（national institute of standards and technology，NIST）和Wiley数据库进行比对，计算反相似度指数（reverse similarity index，RSI）和正相似度指数（similarity index，SI）均大于750的化合物的保留指数（retention index，RI）值并与数据库（http：//www.flavornet.org/）比对，从而对面团中的挥发性风味物质进行定性分析。RI计算公式如下：
式中：N代表低碳原子数正构烷烃碳原子数；n代表高低原子数正构烷烃碳原子数差；tx、tN+n、tN分别为待测化合物、高碳原子数正构烷烃和低碳原子数正构烷烃在相同条件下的保留时间，min。
半定量分析：根据已知内标的含量计算待测风味化合物相对于内标物的含量，挥发性风味成分含量计算公式如下：
1.3.5 数据统计与分析
采用SPSS Statistics 20.0对数据进行显著性差异分析和相关性分析。利用Origin Pro 2021软件进行主成分分析（principal component analysis，PCA）和绘图。
2 结果与分析
2.1 菌株生长特性
2.1.1 菌株生长的最适pH和温度
环境的pH变化会影响酵母原生质膜所带电荷改变，导致原生质膜渗透性变化，进而影响菌体吸收营养物质、酶活、代谢途径[20]。温度是影响酵母菌生长的重要因素，在最适温度条件下细胞内生化和酶反应速率达到最大[20]。酵母菌最适生长pH及最适生长温度见图1。由图1可知，在不同pH和温度条件下，OD600nm值均呈现先上升后下降的趋势。由图1（a）可知，酵母在pH3～10的条件下均能生长，有较好的pH适应性；该酵母菌的最适生长pH为6（自然pH），这与文献[10]结果类似。发酵过程中产生的酸类物质[18]使培养基体系中氢离子增加，pH降低。此酵母最适生长pH比一般酵母（4.0～5.5）高。从图1（b）可知，酵母在26～35 ℃条件下均能生长，最适生长温度为28 ℃。当温度高于28 ℃时，随温度的升高，生存力逐渐减弱，当温度高于32 ℃时，酵母生长被明显抑制，该结果与大多数酵母生长最适生长温度习性相符合。
图1 酵母菌生长最适pH（a）及最适温度（b）测定结果
Fig.1 Determination results of the optimal pH (a) and temperature (b) of the yeast growth
2.1.2 菌株的发酵力
发酵力可展现为酵母的产气量及添加酵母的面团体积变化量。二氧化碳足量时能保证面团结构的充分延伸和膨胀。酵母发酵时会发生一系列的生化反应，在此过程中产生的CO2能保留在发酵面团内部使面团膨胀，使面筋得到充分延展，从而赋予面食松软的特性。在最适生长环境下，酵母菌自身活性是决定面团膨胀能力的重要指标。
由图2可知，发酵0～4 h时酵母在细胞内积累所需酶等物质，导致产气速度较慢。发酵8～16 h时酵母产气较快，面团体积迅速增大，8 h面团体积已增加至初始时的2倍。发酵一段时间后，酵母进入生长稳定期，面团体积不再增加。发酵16 h后出现塌陷现象，这可能是由于发酵前期产气速度快，面团内CO2量达到顶峰导致内部形成高压，而过量的CO2超过面筋的弹性极限，气体溢出时使面筋网络断裂，导致面团体积减小[21]。
图2 酵母菌发酵力测定结果
Fig.2 Determination results of the yeast fermentation capacity
2.2 酵母菌株发酵不同时间面团呈香差异分析
由图3可知，与未发酵组（0 h）相比，发酵组面团的香气强度有明显增强，且随发酵时间的延长，香气特征逐渐明显，其中发酵24 h组的香气特征最明显。花香、水果香、酯香均明显增加。但随着发酵时间的延长产生的醇类物质增加，导致酒香味评分也逐渐增高，过重的酒味会对面团产生消极影响。5组面团中，整体香气强度评价最高的是发酵24 h组，发酵18 h组次之。
图3 不同发酵时间面团的香气强度感官评价结果
Fig.3 Aroma intensity sensory evaluation results of dough with different fermentation time
2.3 酵母菌株发酵面团的挥发性香气物质分析
通过SPME-GC-MS测定共检测到挥发性香气物质44种，包括酯类14种，醇类12种、醛类6种、酸类5种及其他化合物7种。和0 h（未发酵组）相比，发酵面团中主要的香气来源—醇类、酯类等含量均大幅增加。
2.3.1 醇类化合物分析
由表2可知，未发酵面团检出3种醇类物质，总含量为2.07 μg/kg；发酵6 h面团检出7种醇类物质，总含量为9.60 μg/kg；发酵12 h面团检出7种醇类物质，总含量为66.51 μg/kg；发酵18 h面团检出8种醇类物质，总含量为108.86 μg/kg；发酵24 h面团检出10种醇类物质，总含量为113.21 μg/kg。发酵0 h（未发酵）组中乙醇呈甜味，正己醇呈树脂、花等气味，正辛醇呈玫瑰、青香味。24 h组检出乙醇、丙醇、异丁醇、异戊醇、正戊醇、1-辛烯-3-醇、2-癸烯-1-醇、糠醇、苯甲醇、苯乙醇。与未发酵面团组相比，发酵组面团的醇类化合物种类与含量均显著性上升（P＜0.05）。正己醇是面粉中由脂肪氧化产生的醇类，已被证实是普通小麦面粉中的主要醇类物质[22]，同时也是面包中的一种常见挥发性风味成分。在酵子面团中，发酵初期检测到了正辛醇的存在，同邢小龙[23]研究结果，正辛醇还是紫糯配粉馒头特殊香气的来源[24]。乙醇在发酵后期含量最高，6 h起显著上升（P＜0.05），24 h组中乙醇的含量是0 h组中乙醇含量的160倍。在发酵面团中检测到正戊醇、1-辛烯-3-醇，这一结果与KIM Y等[25]的研究结果相似。在发酵24 h组检测到1-辛烯-3-醇可能与发酵时间过长有关[26]。在面团中检测到苯乙醇，可能是由于酵母细胞中由面粉缬氨酸和苯丙氨酸的降解形成苯乙醇[27]，同理缬氨酸降解可能导致异丁醇的产生。异戊醇是酵母发酵面团中含量排第二的醇，是酵母将面团中亮基酸通过Ehrlich途径分解代谢的发酵产物[28-29]，是一种被发现有助于促进花香和果香的化合物[30]，并且它与酒精和麦芽风味呈正相关[5]。己醇具有强烈的草和花的香味。酿酒酵母可以高效将L-苯丙氨酸转化为β-苯乙醇。随着发酵时间的增加，苯乙醇含量逐渐增高[31]。该菌株产苯乙醇能力较强，苯乙醇为发酵面团提供具有新鲜面包的气味和甜玫瑰般的花的气味，这是通过经由Ehrlich途径还原由α-酮酸脱羧产生的醛而生成的[32]。此外，之前有报道称，异戊醇和苯乙醇是发面馒头和面包中最丰富的化合物[33-34]。
表2 不同发酵时间面团中醇类物质测定结果
Table 2 Determination results of alcohol components in dough with different fermentation time
注：“-”表示未检出，同行间不同字母表示差异显著（P＜0.05）。下同。
2.3.2 醛类化合物分析
醛类物质通常阈值较低，在面团混合和发酵过程中，亚油酸通过Ehrlich途径被酶氧化，同时降解了一些氨基酸，最终产生了醛类物质[2]，如苯乙醛[27]。通常情况下，醛类物质在低浓度时对气味起积极促进作用，而浓度较高时则变为异味的主要来源。由表3可知，未发酵面团检出4种醛类物质，总含量为0.64 μg/kg；发酵6 h面团检出1种醛类物质，总含量为0.04 μg/kg；发酵12 h面团检出1种醛类物质，总含量为0.06 μg/kg；发酵18 h面团检出2种醛类物质，总含量为0.61 μg/kg；发酵24 h面团检出2种醛类物质，总含量为0.09 μg/kg。未发酵组中检测出己醛、壬醛、癸醛、十二醛。24 h组检出苯乙醛和椰子醛。根据文献[21]报道，酵母中脱氢酶导致后期发酵面团中苯乙醛含量降低而苯乙醇含量明显增加，苯乙醛可在醇脱氢酶作用下还原形成苯乙醇[35]，结果表明该酵母可能对此过程促进作用显著。0h（未发酵组）中面团检测到的己醛和壬醛，通常被认为是面粉中的异味化合物。后续发酵过程中，壬醛和己醛浓度降低，最终未检测到这3种醛类，此结果同XI J等[36]的研究结果相同，在发酵过程中，造成壬醛和己醛含量降低的原因是发酵过程中脂质氧化[37]。证明产香酵母对面食风味的改善有积极作用。
表3 不同发酵时间面团中醛类物质测定结果
Table 3 Determination results of aldehyde components in dough with different fermentation time
2.3.3 酸类化合物分析
由表4可知，未发酵面团检出2种酸类物质，总含量为0.31 μg/kg；发酵6 h面团检出2种酸类物质，总含量为0.50 μg/kg；发酵12 h面团检出3种酸类物质，总含量为1.27 μg/kg；发酵18 h面团检出3种酸类物质，总含量为2.17 μg/kg；发酵24 h面团检出5种酸类物质，总含量为5.21 μg/kg。未发酵组中仅检测的乙酸和正己酸。24 h组检出乙酸、异丁酸、正己酸、2-甲基己酸和正壬酸。有机酸在发酵面食中起着重要的作用，不仅能产生酸的气味，还能提供其他香味物质的前体。面团中检测到的异丁酸、正己酸和正壬酸，为后续酯类的产生提供了前体物质。乙酸导致面团的酸味和酸气。此外，乙酸是影响酸面团面包感官品质的最重要化合物之一，其在面包中的含量的变化表明了发酵剂发酵面团中微生物的差异。具有汗臭味的正己酸与不良风味物质形成有关[38]，发酵时间在12～18 h未检测到正己酸。在生产中，有必要添加食用碱来中和面食中的酸味。
表4 不同发酵时间面团中酸类物质测定结果
Table 4 Determination results of acid components in dough with different fermentation time
2.3.4 酯类化合物分析
由表5可知，未发酵面团检出3种酯类物质，总含量为0.09 μg/kg；发酵6 h面团检出10种酯类物质，总含量为1.12 μg/kg；发酵12 h面团检出11种酯类物质，总含量为4.04 μg/kg；发酵18 h面团检出10种酯类物质，总含量为8.12 μg/kg；发酵24 h面团检出12种酯类物质，总含量为12.35 μg/kg。0 h组（未发酵组）检测到少量酯类，发酵可以使面团中酯类含量显著上升。24 h时达到最大，有持续增加的趋势，这主要由占比最高的苯甲酸乙酯所主导，为花果味。酯类通常认为主要是由酸和醇的酯化反应产生[39]，能够赋予面团特殊的果味和甜味。酯类是面食香气的主要贡献成分。乙酸苯乙酯由前体苯乙醇产生。经报道，正己酸乙酯经常在储藏水果中被检测到[40-41]，是一种具有果香的物质，为面团提供水果香气。另外乙酸异戊酯、正己酸乙酯、辛酸乙酯、癸酸乙酯、苯甲酸乙酯、苯乙酸乙酯、乙酸2-苯乙酯均为果香气，不同类型的果香丰富了发酵面团的风味。
表5 不同发酵时间面团中酯类物质测定结果
Table 5 Determination results of ester components in dough with different fermentation time
续表
2.3.5 其他类化合物分析
由表6可知，在不同发酵时间的面团中还检测出烃类物质、酮类物质、醚类物质等其他类化合物。其中烷烃类化合物主要来源于脂质分解，十四烷烃、十五烷烃此类正构烷烃由面团中的脂肪产生。发酵过程中检出的烯烃类物质有（E）-5-癸烯，烃类物质的阈值较高[42]，且大多烃类化合物香气较弱或无味，但可能作为芳香类化合物的中间体，对风味的后续形成起基底作用。酮类通常是不饱和脂肪酸氧化而成[15]，其中甲基庚烯酮具有柠檬草和水果香气[43]，香叶基丙酮具有甜木兰花香[44]，对面团风味影响具有重要作用。烯烃类化合物可作为醛、酮类物质的前体物质对风味形成具有潜在作用[16]。发酵过程中还检出少量环类物质，面团中含苯环类、杂环类化合物的相对含量较高，呈现出更浓郁的醇香、果香和坚果香味[45]。
表6 不同发酵时间面团中其他类物质测定结果
Table 6 Determination results of other components in dough with different fermentation time
2.4 主成分分析
采用主成分分析法可以提取主要信息，直观地反映5个样本之间的8种含量＞1 μg/kg的化合物（乙醇、乙酸异戊酯、异戊醇、乙酸、辛酸乙酯、苯乙醇、异丁酸和苯甲酸乙酯）的特征，结果见图4。由图4a可知，前两个主成分中PC1的方差贡献率为91.2%，PC2的方差贡献率为5.8%，PC1和PC2的累计方差贡献率为97%，可以很好地反映5个样品中主要风味物质的全部信息。未发酵组与发酵组样品在产香上存在差异。未发酵组中含量＞1μg/kg的香气物质较少。发酵0h（未发酵）、6 h和12 h组位于PC1的负半轴，PC1与发酵18 h和24 h组样品呈正相关，与其他3个样品呈负相关。PC2与发酵0 h（未发酵）、6 h和24 h组样品呈负相关，与其他2个样品呈正相关。由图4（b）可知，发酵18 h组样品位于第一象限，与乙醇、异戊醇、辛酸乙酯和苯甲酸乙酯的关联紧密，异戊醇和乙醇是面包风味中的基本化合物。发酵24 h组位于第四象限，与苯乙醇、异丁醇、乙酸异戊酯、乙酸联系紧密。在发酵后期乙醇含量较高可能与菌种有关。辛酸乙酯具有与白兰地相似的风味，此类风味物质的检出与文献[42]结果类似。
图4 不同发酵时间面团挥发性香气化合物的主成分分析得分图（a）和载荷图（b）
Fig.4 Principle components analysis score plot (a) and loading plot(b) of volatile aroma compounds in dough with different fermentation time
3 结论
在本研究中，产香酵母CGMCC NO.24005表现出良好的发酵能力和对温度、pH的适应性。在不同发酵阶段面团中总共发现了44种挥发性成分，其中8种挥发性香气化合物的含量＞1 μg/kg。此酵母发酵面团的产物整体香气较强，呈现出花果甜味；发酵组中酯类与醇类的多样性及相对含量显著高于0 h（未发酵）组（P＜0.05）。试验结果表明，酵母菌株发酵24 h的面团，呈现果香、花香、酒香、甜香等特征明显，其中乙醇、乙酸异戊酯、异戊醇、乙酸、辛酸乙酯、苯乙醇、异丁酸和苯甲酸乙酯是导致不同发酵时间产物呈现不同香气特征的关键物质。在发酵面食中，酵母产生了与面食香味正相关的化合物，如异戊醇和苯乙醇。同时，降低了不良风味物质己醛。其余挥发性香气物质增加了面团香气的复杂性与独特性。试验研究结果表明，本实验室保藏的酵母菌株可以提升传统面食的风味品质，对实现面食的标准化生产，具有推广应用潜力。
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