红树莓（Rubus idaeus L.）为蔷薇科悬钩子属浆果植物，含有多种对人体有益的功能性成分，包括必需氨基酸，树莓酮等黄酮类，鞣花酸、花青素、黄烷-3-醇衍生物等多酚类，有机酸，超氧化物歧化酶等[1-3]。由于其味道鲜美、营养价值高，已成为当代饮食中的新宠，同时其功能活性也是国内外学者研究的热点。如红树莓具有抗氧化和抗炎特性，从而起到保护皮肤免受中波紫外线（ultraviolet radiation B，UVB）引起的损伤[4]，具有保护肝脏[5]、抑制多种类型肿瘤生长的作用[6]，防止体质量增加的作用等[7]。山楂（Crataegus pinnatifida Bunge）为蔷薇科山楂属仁果植物，含有原花色素等多酚类化合物、果胶、黄酮类化合物、三萜酸等多种生物活性成分[8-10]，是我国特有的药食兼用树种，具有调节免疫力[11]、降血糖[12]、抗肿瘤、抗氧化、减少黑色素生成[13]及健脾开胃、消食化滞、活血化瘀等作用。红树莓多以鲜食或鲜果速冻后出口，不耐储运、附加值低，而国内对于红树莓的加工又相对滞后，制约红树莓产业发展。山楂加工产业虽然起步早，但多年来发展缓慢，仍然以糖葫芦、蜜饯为主，同样制约着山楂产业的发展。
益生菌发酵果蔬汁不仅可以增加其有机酸、香气物质等功能性成分的种类及含量、改善风味，而且可以提高降血糖、抗氧化、抗肿瘤等保健功效，是近年来功能性食品研究的热点之一[14-15]。綦菲等[16]以新鲜红树莓为原料，研究了红树莓酵素的最佳发酵工艺；刘丽娜等[17]以红树莓、牛奶为主要原料，研究了红树莓发酵乳饮料的最佳配方；常曼曼等[18]采用保加利亚乳杆菌（Lactobacillus bulgaricus）发酵红树莓果汁，并测定了其总酚和黄酮含量。黄豪等[19]选用6种乳酸菌发酵山楂汁，并研究了发酵对山楂汁理化性质、酚类物质、体外抗氧化性、色值和风味物质的影响。张巧等[20]以大果山楂和红糖为主要原料制备酵素，并测定了自然发酵过程中pH值、总糖、总酚含量及抗氧化活性的变化。目前，红树莓、山楂多采用酵母菌和醋酸菌发酵或添加牛奶用以乳酸发酵，且多研究其发酵配方及工艺，而采用复合乳酸菌发酵红树莓山楂纯果汁（即不添加含乳成分，包括动物蛋白、植物蛋白等）并研究其功能活性成分及理化指标的研究鲜有报道。
本研究利用红树莓和山楂混合果汁为原料，采用植物乳杆菌（Lactobacillus plantarum）、鼠李糖乳杆菌（Lactobacillus rhamnosus）、副干酪乳杆菌（Lactobacillus paracasei）三种乳酸菌按照1∶1∶1的比例混合发酵制备红树莓山楂复合果汁，分析发酵前后的成分变化，并进行感官分析，以期为红树莓和山楂的综合加工利用、品质分析提供理论依据。
1 材料与方法
1.1 材料与试剂
红树莓、山楂：均采摘于山西农业大学果树所资源圃；植物乳杆菌（Lactobacillus plantarum）300B、鼠李糖乳杆菌（Lactobacillus rhamnosus）500B、副干酪乳杆菌（Lactobacillus paracasei）500B（均为直投式）：北京和益源生物技术有限公司；丙酮、浓硫酸、氯化锂、碳酸钠、钨酸钠、磷钼酸（均为分析纯）：国药集团化学试剂有限公司；有机酸标准品、氨基酸标准品、维生素C（vitamin C，VC）标准品（纯度均＞98%）：上海源叶生物有限公司；葡萄糖、小苏打粉、果葡糖浆（均为分析纯）、果胶酶（10 000 U/g）：烟台帝伯仕自酿机有限公司。
1.2 仪器与设备
930 Compact IC Flex智能集成型离子色谱：瑞士万通有限公司；S-433全自动氨基酸分析仪：德国Sykam公司；QP2010Plus气相色谱-质谱联用（gas chromatography-mass spectrometer，GC-MS）仪：日本岛津公司；UV-752型紫外分光光度计：上海元析仪器有限公司；ZYZ-V11原汁机：九阳股份有限公司；HG-400V实验室高速均质机：德国WIGGENS公司；XK97-A菌落计数器：杭州齐威仪器有限公司；C18SPE固相萃取柱（十八烷基硅胶填充物500 mg）：北京吉瑞森科技有限责任公司；FE28 pH计：梅特勒-托利多仪器（上海）有限公司。
1.3 试验方法
1.3.1 红树莓山楂复合发酵饮料的加工工艺流程及操作要点
红树莓、山楂→筛选→清洗→山楂去籽→称取质量比为1∶1的红树莓和山楂果肉→加入红树莓和山楂果肉3倍质量的纯净水→打浆→过滤备用→酶解（果胶酶添加量0.1 g/100 g）→过滤→调配（加入红树莓山楂果肉质量25%的葡萄糖）→灭菌（85 ℃、18 min）→冷却（冷却后的红树莓山楂汁即为发酵原液）→接种（接种比例为植物乳杆菌∶鼠李糖乳杆菌∶副干酪乳杆菌为1∶1∶1，接种量为1%）→发酵（37 ℃恒温发酵36 h）→调配→复合发酵饮料成品
1.3.2 理化指标分析检测
总酚含量：采用福林-酚法[21]测定；氨基酸含量：采用GB 5009.124—2016《食品中氨基酸的测定》规定的方法测定；活菌数：参照GB 4789.35—2016《食品微生物学检验乳酸菌检验》规定的方法测定；pH值：采用酸度计测定；维生素C含量：采用离子色谱法测定。
挥发性风味物质含量测定：采用顶空固相微萃取（headspace solid-phase microextraction，HS-SPME）结合气相色谱-质谱联用（GC-MS）技术。将10 mL样品加入20 mL顶空瓶中，在60 ℃条件下平衡30 min，吸附45 min后进行GC-MS分析。气相色谱条件：进样口温度240 ℃；柱温起始温度35 ℃，保持3 min，升温程序：以10 ℃/min升至75 ℃，再以5 ℃/min升至200 ℃，再以8 ℃/min升至240 ℃，保持10 min，载气为氦气（He），流速2.0 mL/min。质谱条件：电子电离（electronic ionization，EI）源，电子能量70 eV，接口温度250 ℃，离子源温度220 ℃，质量扫描范围40～500 m/z。定性定量分析：通过与美国国家标准与技术研究院（national institute of standards and technology，NIST）及匹配度的分析，并结合已报道的国内外文献对其进行分析比较，采用峰面积归一化法计算各组成分相对含量。
有机酸含量测定：采用离子色谱法，Metrosep Organic Acids-250/7.8有机酸柱和电导检测器，50 mmol/L的氯化锂再生液，含有15%丙酮的2 mmol/L硫酸淋洗液，测定有机酸种类与含量[22]。
1.3.3 感官分析
感官评分标准的制定参考白桂英等[23]的方法及轻工行业标准QB/T 5323—2018《植物酵素》及企业标准Q/RHJS 0003S—2022《果蔬酵素饮》，评定小组由10名（5名女性，5名男性，不同年龄段）受过感官评定培训的人员组成，从色泽与状态、香气、口感3个方面对红树莓山楂复合发酵饮料进行感官评分，满分100分，取平均分，感官评分标准见表1。
表1 红树莓山楂复合发酵饮料的感官评定标准
Table 1 Sensory evaluation standards of red raspberry and hawthorn compound fermented beverage
2 结果与分析
2.1 氨基酸组成及含量分析
红树莓山楂复合发酵饮料游离氨基酸含量见表2。由表2可知，红树莓山楂复合发酵饮料中游离基酸的总量为732.68 mg/kg，符合QB/T 5323—2018《植物酵素》中游离氨基酸含量≥33 mg/100 g 的要求。除胱氨酸外，红树莓山楂复合发酵饮料含有16种氨基酸，包括人体8种必需氨基酸，由此可见，红树莓山楂复合发酵饮料中氨基酸种类丰富。由于发酵时间较短，发酵前后游离氨基酸的总量相差不大，但酸味氨基酸含量差异明显，其中天冬氨酸含量由发酵前的81.11 mg/kg增至143.78 mg/kg，谷氨酸由发酵前的118.69 mg/kg增至139.57 mg/kg，谷氨酸和天冬氨酸是发酵液中含量最高的两种氨基酸，是酸味氨基酸，同时也是鲜味物质形成的前提，由此可见经过发酵后，发酵液酸味、鲜味等风味更加浓郁。
表2 红树莓山楂复合发酵饮料游离氨基酸的测定结果
Table 2 Determination results of free amino acids in red raspberry and hawthorn compound fermented beverage
注：“-”表示未检出。下同。
2.2 挥发性风味成分的组成及含量分析
由表3可知，红树莓山楂发酵原液中共检测出挥发性风味物质44种，主要包括醇类、酯类、酮类以及酚类化合物等，发酵后共检出挥发性风味物质40种，主要包括酯类、酸类、酮类以及酚类化合物等。红树莓山楂发酵原液主要挥发性成分包括苯乙醇、α-松油醇、甲基丙酸-1-苯乙酯、α-紫罗兰酮、β-紫罗兰酮、δ-十一烷酸内酯等，与张强等[24]的研究结果相一致。发酵后的红树莓山楂复合发酵饮料中风味物质主要为丁香酚、异甲基紫罗兰酮、α-紫罗兰酮、β-紫罗兰酮、δ-十一烷酸内酯、2,4-二（1,1-二甲基）苯酚、邻苯二甲酸二丁酯，这些物质构成了红树莓山楂复合发酵饮料的主要风味。其中丁香酚、异甲基紫罗兰酮、α-紫罗兰酮、β-紫罗兰酮、δ-十一烷酸内酯、2,4-二（1,1-二甲基）苯酚、邻苯二甲酸二丁酯等挥发性成分均在发酵后有所增加，此外经过发酵，还增加了乙酸、苯甲酸、γ-癸内酯、辛二烯、邻苯二甲酸异丁基辛酯、乙酰柠檬酸三丁酯等风味物质，其中丁香酚有甘甜的花香和辛香，异甲基紫罗兰酮有紫罗兰香气，α-紫罗兰酮有甜香、果香、木香，β-紫罗兰酮有果香、木香，δ-十一烷酸内酯有奶油香味、椰子及桃子样的果香香气。说明乳酸菌发酵能产生多种新的风味物质，另外一些原有的香气物质也有增加，使得红树莓山楂复合发酵饮料风味浓郁。
表3 红树莓山楂复合发酵饮料挥发性风味成分的测定结果
Table 3 Determination results of volatile flavor components in red raspberry and hawthorn compound fermented beverage
2.3 有机酸组成及含量分析
红树莓山楂复合发酵饮料发酵前后有机酸的种类及含量见表4。由表4可知，发酵后红树莓山楂复合发酵饮料主要含有7种有机酸，柠檬酸含量降低，乳酸和乙酸含量增加。乳酸菌能够利用葡萄糖，代谢产生乳酸、乙酸，从而导致发酵后乳酸和乙酸含量增加；柠檬酸可能作为碳源被微生物消耗[25]，从而导致发酵后柠檬酸含量降低。发酵后乳酸含量为3 215.24 mg/L，符合QB/T 5323—2018《植物酵素》中乳酸含量≥660 mg/kg的要求。乳酸口感相较于柠檬酸更为柔和，略带乳香味，经过发酵后红树莓山楂复合发酵饮料口感柔和。
表4 红树莓山楂复合发酵饮料有机酸含量测定结果
Table 4 Determination results of organic acid contents in red raspberry and hawthorn compound fermented beverage
2.4 其他指标的测定结果
红树莓山楂复合发酵饮料其他指标测定结果见表5。
表5 红树莓山楂复合发酵饮料其他指标测定结果
Table 5 Determination results of other indexes in red raspberry and hawthorn compound fermented beverage
由表5可以看出，红树莓山楂复合发酵饮料的pH为3.47、活菌数含量为2.2×107 CFU/mL。酚类物质和维生素C是红树莓和山楂中最为重要的抗氧化物质，能起到抗氧化、预防肿瘤等作用，是评价果汁饮料品质和功能的重要指标[26]。由表5可以看出，红树莓山楂复合发酵饮料中总酚含量略有下降，这一结果与赵男等[27]的研究结果一致。不同乳酸菌发酵不同果蔬汁对酚类物质含量影响不同，ESCUDERO-LOPEZ B等[28]研究发现，乳酸菌发酵橙汁后总酚含量基本不变；卢嘉懿等[29]研究发现，芒果、青瓜汁的总酚含量有较明显上升，西瓜、番茄、蜜柚和脐橙基本持平，苹果和蜜梨的总酚含量则稍有降低。导致发酵前后酚类物质含量变化的原因可能是乳酸菌能够代谢果蔬汁中的酚类物质，使其转化为具有较高的生物可利用性和生物活性的小分子酚类化合物[30]，从而导致发酵前后果蔬汁中总酚含量变化。此外酚类物质在发酵过程中容易被氧化导致含量降低，而酸性环境又能够减缓酚类物质的氧化[31]。红树莓山楂复合发酵饮料维生素C的含量降低，可能是由于维生素C本身极容易被氧化而导致维生素C降低。
2.5 感官评价结果
将发酵36 h后的红树莓山楂复合发酵饮料，放入4 ℃冰箱中冷藏24 h，进行感官评价，结果见表6。
表6 红树莓山楂复合发酵饮料的感官评价
Table 6 Sensory evaluation of red raspberry and hawthorn compound fermented beverage
由表6可以看出，红树莓山楂复合发酵饮料的感官评分为86.25分。红树莓山楂复合发酵饮料呈粉红色，均匀稳定，无明显沉淀物、悬浮物和浑浊现象，具有红树莓、山楂及发酵的香气，香味浓郁，口感纯正细腻，爽口，微酸，有回味。
3 结论
本研究采用植物乳杆菌、鼠李糖乳杆菌、副干酪乳杆菌三种乳酸菌复合发酵红树莓山楂纯果汁，开发出红树莓山楂复合发酵饮料。采用氨基酸分析仪、气质联用仪、离子色谱等分析测定，比较发酵前后的氨基酸、风味物质、有机酸、pH值、总酚和维生素C等种类与含量的变化，结果表明，红树莓山楂复合发酵饮料中氨基酸种类丰富，含有16种氨基酸，包括人体8种必需氨基酸；共检出40种挥发性风味物质，主要为一些酯类、酮类、酸类以及酚类化合物等，其中含量较高的丁香酚、异甲基紫罗兰酮、α-紫罗兰酮、β-紫罗兰酮等都赋予发酵液甜香、果香、木香、奶油香味；发酵后有机酸含量增加，特别是乳酸含量显著升高，活菌数达到2.2×107CFU/mL，总酚和维生素C略有降低。通过感官分析，红树莓山楂复合发酵饮料感官评分为86分，乳酸菌发酵能提升原果汁的风味，保护色泽，使得发酵后的果汁果香味浓郁，口感微酸爽口，较原果汁更容易被人所接受，是一款营养、健康的乳酸发酵饮料。本研究结果为纯果汁乳酸发酵饮料的开发提供一定理论依据和技术支持，同时也可为红树莓和山楂的加工利用、系列产品的开发提供参考。
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