玫瑰果（Rosa canina L.）是蔷薇属植物的果实，在许多地区被用作药物或者药物补充剂。例如，罗马尼亚人将其当作是维生素A和维生素C的辅助食品[1]；土耳其人也将其当作是主要的草本植物[2]；我国关于玫瑰果药效的记载最早出现在距今两千多年的《神农本草经》中[3]。玫瑰果的颜色呈鲜红色，是玫瑰花凋谢之后由花托发育而成的肉质浆果[4]，是公认的富含维生素C的植物[5]。不仅如此，玫瑰果中的酚类化合物和矿物质含量都很高，这也使得玫瑰果成为了良好的保健品原料。
格瓦斯（Kvass）是东欧的一种传统饮料，通常由黑麦或者黑麦面包通过自然发酵而成[6]。该饮料通过未完成酒精和乳酸混合发酵获得。它是一种无酒精或低酒精的饮料，其酒精度一般不超过1.5%vol[7]，但大部分文献报道说不能超1.2%vol[8]。格瓦斯富含人体所需的多种营养成分[9-10]，格瓦斯中含有钙、磷、镁、铁、锌、高钾、低钠、和硒等矿物质。作为发酵产品，格瓦斯还富含大量酚类化合物，这些酚类和黄酮类化合物具有抗氧化剂和自由基清除剂的作用，也被认为能够预防癌症、肿瘤、糖尿病、衰老和神经系统疾病[11]。同时，格瓦斯也是生物活性肽的来源，通过蛋白水解培养物发酵释放。因此格瓦斯也是潜在的保健食品，它能改善消化、内分泌、心血管、免疫和神经系统疾病[12]。最近有研究表明，格瓦斯对于脾胃虚寒型胃溃疡导致的胃粘膜损伤有一定的拮抗作用，能有效修复胃部损伤，缓解胃溃疡现象[13]。此外，作为一种乳酸菌发酵产物，格瓦斯也具有调节肠道，防止病原菌繁殖和改善新陈代谢的作用[14]。
近年来，由于消费者口味的变化和对新品发酵饮料感官的寻求，越来越多的人喜欢饮用低醇饮料。研究表明，低醇饮料不仅不会造成酒精的摄入过量，还可以促进营养成分（B族维生素、矿物质和酚类物质）的吸收[15]。因此国内外开始对混菌发酵低醇饮料进行了大量的研究，尤其是酵母行业。一些研究表明，使用非酿酒酵母混合酿酒酵母发酵不仅有助于降低乙醇含量，而且它能产生更佳复杂的“风味表型”，据报道，非酿酒酵母能够产生超过1 300种挥发性化合物[16-17]。因此非酿酒酵母对产品来说非常重要，这些独特感官就是每种产品的典型特征[18-19]。目前，使用单一酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）接种发酵已经成为现代酿造业的普遍做法，这样做虽然保证了快速可靠的发酵过程，但是这也导致了发酵产品风味单一缺点[20]。研究表明，如果在酿造过程中引入非酿酒酵母可能会对格瓦斯的风味产生一些积极的影响[21]。
本试验以玫瑰果和两种麦芽为主要原料，接入库德里阿兹威毕赤酵母、酿酒酵母和植物乳杆菌进行发酵。采用单因素及响应面试验设计，以酒精度和总酸含量为评价指标，进行发酵工艺优化。为玫瑰果格瓦斯产业化生产提供理论依据。
1 材料与方法
1.1 材料与试剂
大麦芽、焦香麦芽：淄博塔斯曼酿酒原料有限公司；玫瑰果：济南紫金玫瑰有限公司；α-淀粉酶（3 700 U/g）、正丁醇标准品（纯度99%）：北京索莱宝科技有限公司；糖化酶（10万U/g）：阿拉丁生物试剂有限公司；氯化钠（分析纯）：国药集团化学试剂有限公司；蔗糖：市售；酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）（SC）、植物乳杆菌（Lactobacillus plantarum）（LP）、库德里阿兹威毕赤酵母（Pichia kudriavzevii）（PK）：临沂大学生命科学学院食品实验室菌种库。
1.2 仪器与设备
LC-1L拍打式无菌均质机：青岛英瑞斯特实验仪器有限公司；Therom TSQ 8000EVO气质联用仪：赛默飞世尔科技公司；固相微萃取手柄、固相微萃取装置、65 μm PDMS/DVB手动固相微萃取头、7890B气相色谱仪配有氢火焰离子化检测器（flame ionization detector，FID）：安捷伦科技有限公司；HWS-24电热恒温水浴锅：上海一恒科学仪器有限公司；LDZX-50KBS高压蒸汽灭菌锅：上海申安医疗器械厂；WAY（2WAJ）阿贝折光仪：上海仪电物光有限公司；PHS-3CINESApH计：上海仪电科学仪器股份有限公司；LC-LX-H185C 台式高速离心：上海力辰邦西仪器科技有限公司。
1.3 方法
1.3.1 玫瑰果格瓦斯加工工艺流程与操作要点
麦汁的制备：将研磨过筛的大麦芽粉和焦香麦芽粉按7∶3的质量比混合并加入适量的水，然后加入α-淀粉酶进行60 ℃液化30 min，之后加入糖化酶60 ℃糖化30 min。过滤后采用121 ℃，15 min高压灭菌处理。这样不仅能够杀灭其中的细菌还能使麦汁中的部分蛋白发生变性，从而有利于麦汁蛋白以可溶性的形式保留在麦汁中[22]。
玫瑰果果汁的制备：将清洗干净的玫瑰果去蒂去籽，与水按1∶5（g∶mL）的比例，放入均质机均质10 min。
玫瑰果格瓦斯的制备：取150 mL麦汁，加入20%的玫瑰果果汁和3%的蔗糖。62 ℃巴氏杀菌30 min，制作成发酵原液。冷却后将菌株按比例和用量接入发酵原液，放入26 ℃恒温培养箱中进行发酵20 h，得到玫瑰果格瓦斯。
1.3.2 理化指标的测定
可溶性固形物：采用阿贝折光仪进行测定。
总酸：参考GB/T 12456—2008《食品安全国家标准食品中总酸的测定》中pH电位滴定法测定[23]。
酒精度：参考GB5009.225—2016《食品安全国家标准酒中乙醇浓度的测定》中气相色谱法测定[24]。
1.3.3 发酵工艺优化单因素试验
采用单因素试验，初步探究原料液初始可溶性固形物含量（5°Bx、7°Bx、9°Bx、11°Bx、13°Bx），发酵温度（20 ℃、24 ℃、28 ℃、32 ℃、36 ℃），发酵时间（16 h、18 h、20 h、22 h、24 h），接种量（2%、4%、6%、8%、10%）和菌株LP∶SC∶PK的接种比（1∶1∶1、1.50∶0.75∶0.75、0.75∶1.50∶0.75、0.75∶0.75∶1.50、1.2∶1.2∶0.6、0.6∶1.2∶1.2、1.2∶0.6∶1.2）对玫瑰果格瓦斯酒精度和总酸含量的影响。
1.3.4 发酵工艺优化响应面法
（1）Plackett-Burman试验设计
基于单因素试验确定5个影响因素（初始可溶性固形物含量、发酵温度、发酵时间、接种量、接种比）的Plackett-Burman试验的最高水平和最低水平。设计N=12的Plackett-Burman试验设计，响应值为酒精度和总酸含量。此外还包括6个虚拟变量（F、G、H、J、K、L），主要用于计算随机测量误差。通过使用Design-Expert 11.1.0.1软件计算P值，使用随机测量误差来确定实际值的显著性。添加两个连续因子作为中心点，以评估系数的标准误差。Plackett-Burman试验因素与水平见表1。
表1 玫瑰果格瓦斯发酵工艺优化Plackett-Burman试验设计结果
Table 1 Results of Plackett-Burman experimental design for rosehip Kvass fermentation technology optimization
（2）Box-Behnken试验设计
在Plackett-Burman试验的基础上，以初始可溶性固形物含量、发酵温度和发酵时间为考察因素，根据Box-Behnken试验设计原理，进行3因素3水平的响应面分析试验。自变量取值及其编码见表2。
表2 玫瑰果格瓦斯工艺优化Box-Benhnken试验设计因素与水平
Table 2 Factors and levels of Box-Benhnken experiments design for rosehip Kvass fermentation process optimization
1.3.5 数据处理
所有试验做三次平行，数据以“平均值±标准差”表示；使用Microsoft Excel 2019和SPSS Statistics 26.0进行单因素试验的方差分析和差异性分析；使用Design-ExpertVersion 11.1.0.1软件进行Plackett-Burman和Box-Behnken试验结果的分析；使用Graph Pad Prism 8.4.3制图。
2 结果与分析
2.1 发酵工艺优化单因素试验结果
2.1.1 初始可溶性固形物含量对玫瑰果格瓦斯总酸含量和酒精度的影响
初始可溶性固形物含量会影响格瓦斯的总酸含量和酒精度[25]。因此，固定发酵温度28 ℃，发酵时间24 h，接种量2%和接种比（LP∶SC∶PK）1∶1∶1，观察不同初始可溶性固形物含量对发酵的影响，结果见图1。由图1可知，酒精度随初始可溶性固形物含量的增加呈现先增加后下降到趋势。当初始可溶性固形物含量达到11°Bx时，酒精度达到最大，此时酒精度为1.28%vol。这说明初始可溶性固形物含量过大会抑制酵母的生长，这与前人得出的结论一致[6]。总酸含量没有明显的变化趋势，所有试验组的总酸在5.84～6.29 g/L的范围内。格瓦斯酒精度一般小于1.5%vol，但由于酒精度低于1%vol造成了发酵不充分，产生了浓烈的不良麦汁气味。因此，选取7°Bx和11°Bx为Plackett-Burman试验的高低水平。
图1 初始可溶性固形物含量对玫瑰果格瓦斯总酸含量和酒精度的影响
Fig.1 Effects of initial soluble solid contents on total acid contents and alcohol contents of rosehip Kvass
2.1.2 发酵温度对玫瑰果格瓦斯总酸含量和酒精度的影响
温度是影响发酵制品感官评价的重要指标，一般情况，发酵温度控制在25～35 ℃。温度过低，发酵时间会延长；温度过高会缩短发酵时间，但是会降低发酵酒品质，影响其口感[26]。基于初始可溶性固形物含量9°Bx，其他条件不变进行发酵，考察不同发酵温度对发酵的影响，结果见图2。由图2可知，总酸含量和酒精含量随温度的增加而继续增加。当温度超过28 ℃之后，酒精度会超过1.5%vol，引起格瓦斯变质。因此，选择20 ℃和28 ℃为Plackett-Burman试验的高低水平。
图2 发酵温度对玫瑰果格瓦斯总酸含量和酒精度的影响
Fig.2 Effects of fermentation temperature on total acid contents and alcohol contents of rosehip Kvass
2.1.3 发酵时间对玫瑰果格瓦斯总酸含量和酒精度的影响
确定初始可溶性固形物含量9°Bx，发酵温度28 ℃，考察不同发酵时间对发酵结果的影响，结果见图3。由图3可知，总酸含量和酒精度都呈上升趋势，从16 h到24 h，总酸含量和酒精度分别增加39.4%和11.1%。整体上看温度对这两个影响因素影响较大。因此，选取16 h和24 h为Plackett-Burman试验的高低水平。
图3 发酵时间对玫瑰果格瓦斯总酸含量和酒精度的影响
Fig.3 Effects of fermentation time on total acid contents and alcohol contents of rosehip Kvass
2.1.4 接种量对玫瑰果格瓦斯总酸含量和酒精度的影响
其他条件不变，固定发酵时间为24 h，分别按不同的接种量进行接种，考察接种量对试验结果的影响，结果见图4。由图4可知，随着接种量增加，总酸含量和酒精度变化不大，并且没有明显的变化趋势。综合总酸含量和酒精度，选取接种量为2%和8%为Plackett-Burman试验的高低水平。
图4 发酵时间对玫瑰果格瓦斯总酸含量和酒精度的影响
Fig.4 Effects of inoculum on total acid contents and alcohol contents of rosehip Kvass
2.1.5 接种比对玫瑰果格瓦斯总酸含量和酒精度的影响
按照LP∶SC∶PK不同的接种比例进行发酵，确定接种量为6%，其他条件不变，考察接种比对发酵结果的影响，结果见图5。由图5可知，当接种比为1∶1∶1时，总酸含量达到最大，为6.12 g/L。此时酒精度较低为1.19%vol；当接种比为0.75∶1.50∶0.75时，总酸含量最小，为4.76 g/L。此时，酒精度大于1.5%vol，格瓦斯变质。接种比为0.6∶1.2∶1.2的组的酒精度仅次于0.75∶1.50∶0.75，此比例时总酸含量较低为4.777 g/L，仅次于接种比0.75∶1.50∶0.75的组。因此，最终选取1∶1∶1和1.2∶0.6∶1.2为Plackett-Burman试验的高低水平。
图5 接种比对玫瑰果格瓦斯总酸含量和酒精度的影响
Fig.5 Effects of inoculation ratio on total acid content and alcohol content of rosehip Kvass
2.2 发酵工艺优化响应面试验结果
2.2.1 Plackett-Burman试验结果分析
Plackett-Burman试验结果见表3。利用Design-Expert 11.1.0.1软件分别对酒精度和总酸含量进行响应面回归模型方差分析，结果见表4。
表3 Plackett-Burman试验设计结果
Table 3 Results of Plackett-Burman experimental design
注：A初始可溶性固形物；B发酵温度；C发酵时间；D接种量；E接种比；F、G、H、J、K、L虚拟因素。
由表4可知，以酒精度为评价指标，该模型极显著（P值=0.000 1＜0.001），失拟项不显著（P值=0.187 0＞0.05），该模型决定系数R2=97.22%，调整决定系数R2adj=94.90%，说明该模型的的拟合度较好。根据F值和P值可知，初始可溶性固形物含量、发酵温度和时间为影响格瓦斯酒精度的显著因素。以总酸为评价指标，该模型极非常显著（P值=0.003 1＜0.01），失拟项不显著（P值=0.078 9＞0.05），该模型决定系数R2=91.97%，调整决定系数R2adj=85.28%。可知此模型有意义，可以用此模型对格瓦斯发酵条件进行分析。根据F值和P值可知，影响格瓦斯总酸含量的主因素为发酵温度和时间。综上所述，初始可溶性固形物含量，发酵温度和时间为此次试验研究的主要影响因素，为下一步Box-Behnken试验优化建立了基础。
表4 Plackett-Burman试验结果方差分析
Table 4 Analysis of variance of Plackett-Burman experiments results
注：“*”表示对结果影响显著，P＜0.05；“**”表示对结果影响非常显著，P＜0.01；“***”表示对结果影响极显著，P＜0.001。下同。
2.2.2 Box-Behnken试验结果分析
格瓦斯发酵条件优化响应面试验结果见表5，回归模型方差分析结果见表6。
表5 Ben-Behnken试验设计结果
Table 5 Results of Ben-Behnken experiments design
酒精度是格瓦斯发酵的一个关键因素，根据表6可知，酒精度的二次模型的F值为63.42（P＜0.001），对结果影响极显著。失拟值的P值为0.187，表明失拟项不显著，说明该模型合理。其次，决定系数R2=99.13%，调整决定系数R2adj=97.57%，说明此模型可以解释97.57%的变化，拟合度非常好，可以用此模型对玫瑰果格瓦斯发酵条件进行分析。对表5中结果进行回归拟合分析，得到玫瑰果格瓦斯发酵过程中酒精度含量的二次回归方程为：
总酸含量是格瓦斯感官品质的另一个重要指标，总酸含量过低会使格瓦斯失去其独特的口感，过酸又会降低格瓦斯的品质。表6显示了因变量和自变量之间的线性关系的重要性。该模型F值为36.35（P＜0.001），极显著，且失拟项不显著，表明二次回归方程可以很好地预测响应值。决定系数R2=98.49%；调整决定系数R2adj=95.78%，表明只有大约4.22%的总方差不能用该模型解释。总酸含量的二次模型可以用下式表示：
表6 回归模型方差分析
Table 6 Variance analysis of regression model
一次项A、B和C三个因素对酒精度均有着极显著影响（P＜0.001），交互项AB、二次项A2、B2和C 2对酒精度的影响均显著（P＜0.05）。一次项B、二次项C 2对总酸含量影响极显著（P＜0.001），一次项C、二次项A2对结果影响非常显著（P＜0.01）。交互项BC和二次项B2对总酸含量影响均显著（P＜0.05）。
图6 各因素间交互作用对玫瑰果格瓦斯酒精度和总酸含量影响的响应面及等高线
Fig.6 Response surface plots and contour lines of effect of interaction between various factors on the alcohol content and total acid content of rosehip Kvass
格瓦斯的酒精度一般低于1.5%vol，但格瓦斯酒精度过低时，产品中很难产生醇香的味道，并且麦汁味道会过重[27]，酒精度过高时又会使产玫瑰果格瓦斯的酒味过重。因此在保证酒精度在1.0%vol和1.2%vol之间，这样才能保证产品获得更加浓郁的醇香。格瓦斯的酸味也是感官评价中的重要指标，既要体现出乳酸的味道也不能酸味过重，因此把总酸含量定为4 g/L最好[6]。在响应面试验中设置总酸目标值为4 g/L，同时设置酒精度范围为1.0%vol～1.2%vol，根据模型计算，初始可溶性固形物含量、发酵温度和时间的最优值分别为8.002°Bx、26.517 ℃、20.483 h，根据实际操作条件，将其分别调整为8°Bx、26 ℃、20 h，其他条件为接种量2%，接种比为1∶1∶1。并得到此模型预测的酒精度和总酸含量分别为1.047%vol和4 g/L。
2.3 发酵工艺的验证
为了验证该模型是否可靠，将模型得到的最优工艺（初始可溶性固形物含量8°Bx，发酵温度26 ℃，发酵时间20 h）进行验证。该组试验有6个平行，最终测得酒精度的实际值为1.09%vol，总酸含量的实际值为4.02 g/L。与理论值相差不大，由此可知，该响应面模型有效，可以预测玫瑰果格瓦斯发酵的最佳工艺，具有一定的实践指导意义。
3 结论
本研究以玫瑰果和麦芽为原料研制玫瑰果格瓦斯，通过单因素和响应面优化试验设计对玫瑰果格瓦斯的发酵工艺进行优化。最终确定最优发酵工艺为初始可溶性固形物含量8°Bx，发酵温度26 ℃，发酵时间20 h，三种菌株总接种量2%，接种比为1∶1∶1。此优化条件下，玫瑰果格瓦斯酒精度为1.09%vol，总酸含量为4.02 g/L。为玫瑰果格瓦斯的大规模生产提供了有力的数据支撑。
[1]QUEVEDO R,VALENCIA E,PEDRESHI F,et al.Kinetic deterioration and shelf life in rose hip pulp during frozen storage[J].J Berry Res,2019,10(1):1-11.
[2]WANG Y X,GUO X,ZHANG L G,et al.Effects of deproteinization on rheological properties of polysaccharides from Rosa acicularis'Lu He'and Rosa acicularis Lindl fruits[J]. J Food Measure Charact,2021,15(3):1-16.
[3] PATEL S.Rose hip as an underutilized functional food: Evidence-based review[J].Trend Food Sci Technol,2017,63:29-38.
[4]陈小松，王宇晓，王坤立，等.高不饱和脂肪酸玫瑰果籽油微胶囊制备及品质分析[J].中国食品学报，2018，18（3）：278-283.
[5]VARTOLOMEI N,TURTOI M.The influence of the addition of rosehip powder to wheat flour on the dough farinographic properties and bread physico-chemical characteristics[J].Appl Sci,2021,11:12035.
[6]田莹莹，安家彦，刘靖靖，等.谷物格瓦斯饮料发酵工艺的优化[J].食品科技，2015，40（5）：124-130.
[7] LIDUMS I,KIRSE A,KARKINA D,et al.Quality parameters of fermented kvass extract[J].Chem Technol,2016,67(1):73-76.
[8]POLANOWSKA K,VARGHESE R,KULIGOWSKI M,et al.Carob kibbles as an alternative raw material for production of kvass with probiotic potential[J].J Sci Food Agr,2021,101(13):5487-5497.
[9]张素华，孙长花，薛凌燕.花卉格瓦斯饮料的研制[J].食品与发酵工业，2006，32（7）：130-134.
[10]李玉斌，吴华昌，肖猛，等.一种青稞格瓦斯的制备及挥发性风味成分分析[J].食品与发酵工业，2017，43（1）：96-103.
[11]SOHRABVANDI S,MOUSAVI S M,RAZAVI S H,et al.Alcohol-free beer: methods of production,sensorial defects,and healthful effects[J].Food Rev Int,2010,26(4):335-352.
[12] MARSH A J,HILL C,ROSS R P,et al.Fermented beverages with health-promoting potential:Past and future perspectives[J].Trend Food Sci Technol,2014,38(2):113-124.
[13]邵占梅，仲继冬，房玉明，等.格瓦斯对脾胃虚寒型胃溃疡大鼠保护作用的研究[J].中国酿造，2022，41（1）：64-69.
[14]XIA A N,MENG X S,TANG X J,et al.Probiotic and related properties of a novel lactic acid bacteria strain isolated from fermented rose jam[J].LWT-Food Sci Technol,2021,136(2):110327.
[15]BELLUT K,ARENDT E K.Chance and challenge:non-Saccharomyces yeasts in nonalcoholic and low alcohol beer brewing-a review[J].J Am Soc Brewing Chem,2019,77(2):77-91.
[16] JOLLY N P,CRISTIAN V,PRETORIUS I S.Not your ordinary yeast:non-Saccharomyces yeasts in wine production uncovered[J].FEMS Yeast Res,2014,14(2):215-237.
[17] ARROYO T.Sequential Non-Saccharomyces and Saccharomyces cerevisiae fermentations to reduce the alcohol content in wine[J]. Fermentation,2020,6(2):60.
[18]FRANCESCA N,GAGLIO R,ALFONZO A,et al.The wine:typicality or mere diversity?the effect of spontaneous fermentations and biotic fac-tors on the characteristics of wine[J].Agr Sci Proced,2016,8:769-773.
[19] CIANI M,CANONICO L,ORO L,et al.Footprint of nonconventional yeasts and their contribution in alcoholic fermentations[J].Biotechnol Progr Beverage Consump,2020:435-465.
[20]李凯娅，毛曦庆，林雪，等.梅奇酵母与酿酒酵母混合发酵对火龙果酒风味的影响[J].食品研究与开发，2021，42（10）：54-60.
[21] BOURBON-MELO N,PALMA M,ROCHA M P,et al.Use of Hanseniaspora guilliermondii and Hanseniaspora opuntiae to enhance the aromatic profile of beer in mixed-culture fermentation with Saccharomyces cerevisiae[J].Food Microbiol,2021,95:10367.
[22]金蓓，李琳，李冰，等.麦汁蛋白在麦汁煮沸过程中的变化研究[J].食品与发酵工业，2009，36（5）：6.
[23]中华人民共和国国家卫生健康委员会，国家市场监督管理总局.GB 12456—2021 食品安全国家标准食品中总酸的测定[S].北京：中国标准出版社，2021.
[24]中华人民共和国国家卫生和计划生育委员会.GB 5009.225—2016食品安全国家标准酒中乙醇浓度的测定[S].北京：中国标准出版社，2016.
[25]吴嘉琪.卡瓦斯复合发酵菌剂的分离筛选及产品开发[D].杨凌：西北农林科技大学，2021.
[26]WANG C Y,LIU Y W,JIA J Q,et al.Optimization of fermentation process for preparation of mulberry fruit wine by response surface methodology[J].Acad J,2013.7(3):227-236.
[27] GERNAT D C,BROUWER E,OTTENS M.Aldehydes as wort offflavours in alcohol-free beers-origin and control[J].Food Bioproc Technol,2020,13(2):195-216.