‘小芒森’（Petit Manseng），又称小满胜、佩特蒙森，在众多的酿酒葡萄品种之中，‘小芒森’成熟期晚，挂果时间长，是一种高糖、高酸的酿酒葡萄品种，是酿造天然甜酒的理想品种[1-2]。一般认为，来源于酿酒果实的品种香带有明显的品种和产地特征，这都决定着葡萄酒的风格，品种香又根据其代谢路径分为源于脂肪酸的C6/C9化合物、源于异戊二烯的萜烯类和降异戊二烯类化合物，以及源于氨基酸的芳香族类和甲氧基吡嗪等[3-5]。有研究表明，香气化合物主要存在葡萄果实内表皮中，在葡萄果实成熟阶段会受到成熟进程的调控[6-8]。
目前‘小芒森’在我国的胶东半岛产区已有种植，其在该地区的品质表现已有报道[1-2，9]。而‘小芒森’引种到新疆天山北麓产区的时间不长，目前只在五家渠中粮长城和玛纳斯中信国安葡萄酒业有限公司葡萄种植基地种植，众所周知，新疆天山北麓产区的气候特征明显区别于其他产区，如日照时间长、降雨量少、昼夜温差大等[10-11]，这些因素都会影响葡萄果实的成熟进程，进而影响葡萄果实的品质[12-13]，主要包括颜色和香气品质[13-16]。任瑞华等[17]研究发现，以‘小芒森’为试材，从花后30 d开始直至完全成熟进行采样，其可溶性固形物含量和pH随着果实生长逐渐增大，而可滴定酸、总酚和总单宁含量呈降低趋势。周鹏辉等[9]研究发现，小芒森在蓬莱产区适宜的采收期是在葡萄果实糖度达到290 g/L以上，总酸在9 g/L左右，此外如果气候条件允许，继续推迟采收，果粒开始萎缩，出汁率下降，导致总糖上升，其香气成分也将发生变化。目前关于新疆地区‘小芒森’葡萄果实品质特性研究的报道很少。
本研究以新疆天山北麓产区这一特定地域环境下的‘小芒森’葡萄品种为研究对象，分别测定五家渠和玛纳斯地区葡萄果实生长过程中的理化指标，通过顶空固相微萃取（headspace solidphase microextraction，HS-SPME）结合气相色谱-质谱（gas chromatography-mass spectrometry，GC-MS）联用技术检测其香气物质的组成及含量，并采用偏最小二乘法-判别分析（partial least square-discriminant analysis，PLS-DA）判断果实香气物质组成及含量差异，以期为‘小芒森’葡萄品种的栽培提供一定参考，进一步为更好地发挥其在新疆地区的利用价值提供理论依据。
1 材料与方法
1.1 材料与试剂
‘小芒森’酿酒葡萄果实均来源于天山北麓产区。‘小芒森’葡萄：五家渠中粮长城葡萄种植基地，树龄为12年，亩产800 kg。‘小芒森’葡萄：玛纳斯中信国安葡萄种植基地，树龄为8年，亩产600 kg。两地区都采用南北走向，“厂”字型架势的种植模式。采样从盛花期花后第8周开始，每周采样一次，直至第13周采样结束，采样时消除边际效应，兼顾阴阳面，叶幕层内外和上中下果穗，以及每穗葡萄肩、中、顶部，分散随机采取葡萄果实。新鲜果实用于测定葡萄果实理化指标，其他用液氮速冻，放到-40 ℃冰箱中待用。
NaCl、NaOH、葡萄糖、二氯甲烷（均为分析纯）、二氯甲烷、甲醇（均为色谱纯）、4-甲基-2-戊醇（色谱纯）：北京化学试剂公司；D-葡萄糖酸内酯、聚乙烯基吡咯烷酮（polyvinylpolypyrrolidone，PVPP）（纯度≥99%）：美国Sigma公司。
1.2 仪器与设备
TGL-16A型高速台式离心机：北京世纪科信科学仪器有限公司；RE-52AA型旋转蒸发仪：上海星宋科学仪器有限公司；HZS-H型水浴恒温振荡器：上海思尔达科学仪器有限公司；SHZ-Ⅲ型循环水式真空泵：郑州华特仪器设备有限公司；Agilent 7890气相色谱仪、Agilent 5975B质谱仪：美国安捷伦科技公司；聚二甲基硅氧烷/碳筛/二乙烯苯（PDMS/CAR/DVB）萃取头：北京康林科技有限责任公司；Cleanert PEP-SPE固相萃取柱（150 mg/6 mL）：天津博纳艾杰尔科技有限公司；PAL-2手持折光仪：日本ATAGO公司；JYL-C93T榨汁机：九阳股份有限公司。
1.3 方法
1.3.1 葡萄果实理化指标的测定
样品预处理：50 g葡萄果实破碎后挤汁，8 000 r/min条件下离心10 min，取上清液。采用手持折光仪测定可溶性固形物含量；采用酸碱滴定法测定可滴定酸含量。
1.3.2 葡萄果实香气物质的提取
参照杨晓帆[14]的顶空固相微萃取（HS-SPME）方法提取葡萄果实香气物质。100 g葡萄果实去梗去籽碾碎之后在液氮保护下加入0.5 g D-葡萄糖酸内酯和2 g聚乙烯基聚吡咯烷酮，用打粉机打成粉末装入50mL离心管中放入4℃冰箱内静置浸提4 h，然后于4 ℃、8 000 r/min条件下离心15 min，得到澄清的葡萄汁。之后吸取5 mL葡萄汁于15 mL的样品瓶中，再加入1 g NaCl和10 μL内标（4-甲基-2-戊醇，质量浓度1.038 8 g/L的水溶液）：将装有葡萄汁的样品瓶放置在磁力搅拌加热台上于40 ℃下保持30 min，将已活化过的萃取头插入样品瓶的顶部，萃取头与样品液面保持1 cm距离，在250 ℃的条件下热解吸8 min，待GC-MS分析[14]。每个样品均做3次独立的重复。
1.3.3 葡萄果实香气物质的测定
GC-MS分析：葡萄果实香气化合物的分析使用气相色谱-质谱仪，载气为高纯氦气（He）；流速1 mL/min；柱温箱在50 ℃保持1 min后以3 ℃/min的速度升温至220 ℃，之后保持5 min；质谱接口和离子源的温度分别为280 ℃和230 ℃，选择电离方式为电子电离（electron ionization，EI）源，电子能量为70 eV，质量扫描范围为20～350 u[14，18]。
定性和定量分析：对于已有标准品的香气物质根据相同色谱条件下该化合物的保留指数和离子碎片进行定性分析[14，18]。以4-甲基-2-戊醇为内标物，利用其获得的相应物质的标准曲线回归方程对已有标样的香气物质进行定量，利用化学结构相似、碳原子数相近的标准品的标准曲线回归方程对没有标样的香气物质进行半定量[14，18]。
1.3.4 数据处理
本研究采用Microsoft Office Excel 2019进行数据及图表整理；运用SPSS 19.0进行数据统计分析；采用Metabo-Analyst（https：//www.metaboanalyst.ca/）进行偏最小二乘法-判别分析（PLS-DA）。
2 结果与分析
2.1 不同成熟阶段‘小芒森’葡萄果实理化指标的测定结果
‘小芒森’葡萄果实成熟过程中可溶性固形物和可滴定酸含量测定结果见图1。
葡萄果实中糖分是诸多指标的基础，决定着葡萄酒的酒度[19-20]。有研究认为，在干旱和半干旱地区，较少降雨量以及强光照使果实糖分迅速积累，成熟速度比其他地区有所加快，果实品质会受到影响[5，21]。由图1A可知，五家渠、玛纳斯地区的‘小芒森’葡萄果实可溶性固形物含量均随着果实成熟呈上升的趋势。从花后第8周至花后第13周，随着果实成熟，玛纳斯地区葡萄果实可溶性固形物含量的增长幅度较大，在果实采收时，可溶性固形物含量高于五家渠地区葡萄，达到了30.10°Bx，五家渠地区葡萄可溶性固形物含量为27.47°Bx。
葡萄果实中可滴定酸的含量主要是在绿果期大量积累，随着果实的成熟可滴定酸含量逐渐降低。由图1B可知，可滴定酸含量总体呈现逐渐降低的趋势。在花后第8周，五家渠、玛纳斯地区的‘小芒森’葡萄果实可滴定酸含量均为最高值，其值分别为38.11 g/L、28.93 g/L。在花后13周果实采收时，五家渠地区的为11.91 g/L，玛纳斯地区葡萄果实可滴定酸含量为10.67 g/L。
图1 ‘小芒森’葡萄果实成熟过程中可溶性固形物（A）和可滴定酸（B）含量测定结果
Fig.1 Determination results of soluble solid (A) and titratable acid (B) contents of 'Petit Manseng' grape fruit during ripening process
2.2 ‘小芒森’葡萄果实成熟过程中香气成分分析
‘小芒森’葡萄果实成熟过程中香气化合物GC-MS分析结果见表1。由表1可知，两地区葡萄果实成熟过程中香气成分共检出46种，其中，醇类10种，醛类16种，酯类3种，酮类4种，酸类1种，烯类6种，苯类6种。以醛类和醇类为主，并含有少量酯类、酸类、酮类和烯类及苯类物质，五家渠地区‘小芒森’葡萄果实成熟过程中可检测到香气化合物43种，主要包括醇类9种，醛类16种，酯类2种，酮类4种，酸类1种，烯类6种，苯类5种。玛纳斯地区‘小芒森’葡萄果实成熟过程中可检测到香气化合物42种，包括醇类10种，醛类15种，酯类3种，酮类4种，酸类1种，烯类4种，苯类5种。在花后第13周果实成熟采收时，两地区共有的香气成分有35种，香气物质的种类组成差异物质11种，包括4-萜烯醇、2,6-二甲基-5,7-辛二烯-2-醇、乙酸叶醇酯、双戊烯、1,4-二氯苯、辛醛、E-2,6-壬二醛、邻甲基苯乙烯、苯乙烯、对二甲苯、1-辛烯-3-酮。
表1 不同地区‘小芒森’葡萄果实成熟过程中香气化合物GC-MS分析结果
Table 1 Results of aroma compounds in 'Petit Manseng' grape fruit in different areas during ripening process analyzed by GC-MS
续表
续表
注：“nd”表示未检出。
2.3 ‘小芒森’葡萄果实成熟过程中香气成分的变化
随着‘小芒森’葡萄果实的成熟，两个地区的‘小芒森’葡萄果实香气化合物均整体呈现上升的趋势，花后第13周，五家渠地区葡萄香气物质总含量为57 749.58 μg/L，玛纳斯地区明显低于五家渠地区，为32 828.59 μg/L。在五家渠地区，花后第13周葡萄果实中香气化合物总含量是花后第8周的3.8倍，而同生长期的玛纳斯地区的‘小芒森’葡萄果实香气化合物含量则是2.9倍，在成熟过程中五家渠地区的葡萄果实香气化合物的积累速率高于玛纳斯地区。通过监测葡萄果实成熟过程中的可溶性固形物含量发现，果实成熟后期（花后12周到花后13周），可溶性固形物含量积累速度虽次于成熟早期（花后8周到花后10周），但是香气化合物含量一直保持快速积累的状态，也有研究发现，香气化合物的积累量与果实成熟度不完全相关[22-23]。进一步对‘小芒森’葡萄果实中各类香气成分的变化进行具体分析。
2.3.1 醇类物质的变化
在玛纳斯地区，葡萄果实中10种醇类物质均可检出，随着果实成熟，3-己烯-1-醇含量变化整体呈下降的趋势，而己醇呈先下降后上升的趋势，花后第13周，其含量分别为5.705 μg/L，282.76 μg/L；在五家渠地区，花后第8周和第9周未检出E-2-己烯-1-醇、己醇，花后第11周后未检出4-萜烯醇，成熟过程中均未检出2,6-二甲基-5,7-辛二烯-2-醇；具有清草香的E-2-己烯-1-醇、苯甲醇及己醇含量变化整体呈上升趋势[24]，花后第13周，这3种物质的含量分别为209.042 μg/L、74.448 μg/L、926.613 μg/L。
2.3.2 醛类物质的变化
在玛纳斯地区，花后第11周未检出辛醛，整个成熟期未检出E-2,6-壬二醛；具有绿叶清香的己醛、E-2-己烯醛含量明显上升[24]，花后第13周，这2种物质的含量分别为26 497.742 μg/L、2 997.057 μg/L。在五家渠地区，花后11周可检出甜花香的苯乙醛，而己醛、E-2-己烯醛含量明显上升，花后第13周，这2种物质的含量分别为50 653.17 μg/L、3 035.452 μg/L。这些醛类化合物在葡萄酒中主要呈‘绿叶’‘青草’气味，是由不饱和脂肪酸经过脂氧合酶（lipoxygenase，LOX）、脂氢过氧化物裂解酶（hydroperoxide lyase，HPL）以及乙醇脱氢酶（alcohol dehydrogenase，ADH）等催化产生[25]，在‘赤霞珠’品种中的含量很高。丁燕等[26]分析了蓬莱产区的小芒森葡萄果实中香气物质组成及含量，也发现醛类物质是葡萄果实中检测出的最丰富的一类物质。
2.3.3 酯类物质的变化
乙酸叶醇酯含量在果实成熟过程中整体呈先下降后上升的趋势，花后第13周，其在玛纳斯地区葡萄果实中含量为182.901 μg/L，而其在五家渠地区葡萄果实未检出，它在葡萄酒中主要呈青草香以及香蕉气味[27]。而在两个地区，甲基丙烯酸己酯和水杨酸甲酯含量变化均不明显。
2.3.4 酮类物质的变化
在玛纳斯地区葡萄果实中，1-辛烯-3-酮在花后11周之后未检出，β-大马士酮在花后第13周略有降低，含量为9.556 μg/L。而五家渠地区葡萄果实中，1-辛烯-3-酮整体呈先升高后下降的趋势，花后第13周，其含量为8.294 μg/L，β-大马士酮呈上升趋势，花后第13周，其含量为12.035 μg/L。这些物质主要为葡萄酒贡献花香和果香，其中β-大马士酮也是降异戊二烯类香气化合物中主要的组分[13]。
2.3.5 酸类物质的变化
在玛纳斯地区，葡萄果实成熟过程中乙酸含量整体呈下降趋势，花后第13周，其含量为1 582.818 μg/L，而五家渠地区，乙酸含量在葡萄果实成熟过程中呈上升趋势，果实成熟时，其含量为1 762.108 μg/L。乙酸在葡萄酒中主要呈刺激、尖酸的气味，因此，有研究利用本土戴尔有孢圆酵母R12与酿酒酵母NX11424同时接种和顺序接种发酵，来降低甜型葡萄酒中的乙酸，进一步增加其香气复杂度[28]。
2.3.6 烯类物质的变化
在玛纳斯地区，Z-4-蒈烯在果实发育过程中有所下降，花后第13周，其含量为3.391 μg/L，邻甲基苯乙烯、苯乙烯未检出，其他物质含量变化不明显。在五家渠地区，松油烯、Z-4-蒈烯、邻甲基苯乙烯在果实成熟过程中有所下降，此外，双戊烯在花后11周后葡萄果实中未检出。其中，双戊烯又称柠檬烯，在葡萄酒中呈现柑桔香、柠檬香[24]。
2.3.7 苯类物质的变化
在玛纳斯地区，乙基苯、邻-异丙基甲苯的含量在葡萄果实成熟采收时有所增加，其他物质变化不明显，对二甲苯未检出。而在五家渠地区，乙基苯在葡萄果实成熟采收时有所增加，花后第13周，其含量为11.291 μg/L，邻-异丙基甲苯含量有所下降，1,4-二氯苯在成熟过程中均未检出。
2.4 ‘小芒森’葡萄香气成分的偏最小二乘法-判别分析
为了更加直观反映五家渠和玛纳斯地区‘小芒森’葡萄成熟过程中果实香气物质的差异，进行了偏最小二乘法-判别分析（PLS-DA），结果见图2。由图2A可知，PLS-DA在提取出来的2个主成分中，主成分1和主成分2累积方差贡献率为96.1%，可基本反映出样品中的香气物质信息，随果实成熟，玛纳斯地区样品点的分布从X轴的负半轴向正半轴排列，对于五家渠地区，虽然其样品点分布随果实成熟未呈现规律性分布，但部分的样品点与玛纳斯地区可以较好地分离。由图2B可知，通过变量重要性投影（variable importance in the projection，VIP）值＞1.0，确定导致两地区葡萄果实组分含量差异的主要物质为己醛（b2）、E-2-己烯醛（b4）、乙酸（e1）、己醇（a9）。
图2 五家渠和玛纳斯地区‘小芒森’葡萄果实成熟过程中香气化合物的偏最小二乘法-判别分析结果
Fig.2 Partial least squares-discriminant analysis results of aroma compounds during ripening process of 'Petit Manseng'grape fruit in Wujiaqu and Manas regions
A为散点图；B为VIP得分图；香气物质序号同表1。
3 结论
在新疆天山北麓产区，持续的高温会加快‘小芒森’葡萄果实的成熟。随着果实的成熟，可溶性固形物含量整体呈上升趋势，而可滴定酸含量呈下降趋势，香气化合物总量呈现上升的趋势。五家渠、玛纳斯地区葡萄果实在成熟过程中共检出香气物质46种，其中，醇类10种，醛类16种，酯类3种，酮类4种，酸类1种，烯类6种，苯类6种，以醛类、醇类物质为主。花后第13周，两地区葡萄果实共有香气成分有35种，通过偏最小二乘法-判别分析发现，葡萄成熟过程中香气物质的组分含量差异主要在于己醛、E-2-己烯醛、乙酸、己醇。本研究为认识新疆天山北麓地区‘小芒森’葡萄果实香气品质表现特性提供了依据，更好地发挥其在新疆地区的利用价值。
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